使用與b細胞表面標志結合的拮抗劑治療自身免疫病的制作方法

專利名稱：使用與b細胞表面標志結合的拮抗劑治療自身免疫病的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用與B細胞表面標志，如CD19或CD20結合的拮抗劑治療自身免疫病。
背景技術：
淋巴細胞是骨髓造血過程中產生的多種白細胞的一種。存在兩種重要的淋巴細胞群B淋巴細胞(B細胞)和T淋巴細胞(T細胞)。這里對淋巴細胞中的B細胞尤其有興趣。
B細胞在骨髓中成熟，離開骨髓時在其細胞表面表達與抗原結合的抗體。當天然B細胞首次與其膜結合抗體特異的抗原相遇時，細胞開始迅速分裂，其子代分化成記憶B細胞和稱為“漿細胞”的效應細胞。記憶B細胞壽命很長，并繼續表達與其親代細胞具有相同特異性的膜結合抗體。漿細胞不產生膜結合抗體，而代之產生可分泌型的抗體，可分泌的抗體是體液免疫的重要效應分子。
CD20抗原(也稱為人B淋巴細胞限制性分化抗原Bp35)是前B細胞和成熟B淋巴細胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大約35kD(Valentine等生物學化學雜志264(19)11282-11287(1989)；和Einfeld等，歐洲分子生物學組織雜志7(3)711-717(1988))。該抗原也在大于90％的B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表達(Anderson等，血液63(6)1424-1433(1984))，但在造血干細胞，原B細胞，正常漿細胞或其它正常組織中未發現(Tedder等，免疫學雜志135(2)973-979，1985)。CD20在細胞周期啟動和分化的活化過程早期階段起調節作用(Tedder等，同上)，并可能發揮鈣離子通道的功能。(Tedder等，細胞生物學雜志14D195(1990))由于CD20在B細胞淋巴瘤中表達，這一抗原可作為用于“靶向”這類淋巴瘤的候選者。實質上，這種靶向可如下歸納給予患者B細胞表面抗原CD20的特異性抗體。這些抗CD20抗體與正常和惡性B細胞(表面的)CD20抗原特異結合；與表面抗原CD20結合的抗體可引起腫瘤性B細胞的破壞和耗竭。此外，具有破壞腫瘤潛力的化學制劑或放射活性標記能與抗CD20抗體偶聯，從而將所述制劑特異性“運送”至腫瘤性B細胞。不管用什么方法，一個主要目的是破壞腫瘤；可根據所使用的具體抗CD20抗體確定具體方法，因此，靶向CD20抗原的現有方法很多。
CD19是B細胞系細胞表面表達的另一種抗原。象CD20一樣，發現CD19在從干細胞階段到快要最終分化為漿細胞之前的整個分化過程中均位于細胞上(Nadler，L.淋巴細胞分型II23-37和Appendix，Renling等，編(1986)Spring Verlag出版)。然而與CD20不同，與CD19結合的抗體引起CD19抗原的內在化。在多種抗體中使用HD237-CD19抗體(也稱為B4抗體)可鑒定CD19抗原(Kiesel等，白血病研究II，121119(1987))。CD19抗原存在于4-8％的外周血單個核細胞及大于90％的分離自外周血，脾臟，淋巴結或扁桃體的B細胞。在外周血T細胞，單核細胞或粒細胞中未檢出CD19。實際上，所有的非T細胞急性淋巴母細胞白血病(ALL)，B細胞慢性淋巴細胞白血病(CLL)和B細胞淋巴瘤均表達可被B4抗體檢測的CD19(Nadler等，免疫學雜志131244(1983)；和Nadler等，血液學進展，Vol.XIIpp.187-206.Brown，E.編(1981)Grune&Stratton公司出版)。
由B細胞系的細胞所表達的能識別分化階段特異性抗原的其它抗體已得到鑒定。其中有抗CD21抗原的B2抗體；抗CD22抗原的B3抗體；抗CD10抗原的J5抗體(也稱為CALLA)。見1997年1月21日授權的美國專利5,595,721號(Kaminski等)。
rituximab(RITUXAN)抗體是一種遺傳工程化鼠/人嵌合單克隆抗CD20抗體。Rituximab在1998年4月7日授權的美國專利5,736,137號(Anderson等)中稱為“C2B8”的抗體。RITUXAN被指示用于治療復發或難治的低級或濾泡性CD20陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤。在體外對作用機制的研究顯示RITUXAN與人補體結合，并通過補體依賴性細胞毒作用(CDC)裂解淋巴樣B細胞系(Reff等，血液83(2)435-445(1994))。此外，在抗體依賴的細胞性細胞毒作用(ADCC)試驗中有顯著活性。最近，RITUXAN在氚標胸腺嘧啶摻入實驗中顯示抗增殖效應并直接誘導凋亡，而其它抗CD19和抗CD20的抗體則不能(Maloney等，血液88(10)637a(1996))。在實驗中觀察到RITUXAN與化療和毒素有協同作用。尤其是RITUXAN使耐藥性人B細胞淋巴瘤細胞系對阿霉素，CDDP，VP-16，白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細胞毒效應敏感(Demidem等，癌癥化療及放射性藥物(Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals)12(3)177-186(1997))。體內臨床前研究顯示RITUXIMAB？耗竭來源于彌猴(cynomolgus)外周血，淋巴結和骨髓的B細胞，推測是通過補體和細胞介導的過程(Reff等，血液83(2)435-445(1994))。
發明簡述本發明第一方面提供了一種治療哺乳動物自身免疫病的方法，包括給予哺乳動物治療有效量的與B細胞表面標志結合的拮抗劑。
另一方面，本發明涉及一種制品，其包括一個容器及其中所含的組合物，還包括一種包裝插頁，所述組合物包含一種與B細胞表面標志結合的拮抗劑，所述插頁可指導用戶用所述組合物治療患有或易感自身免疫病的患者。
優選實施方案詳述I.定義本文中“B細胞表面標志”是一種表達于B細胞表面，可作為與之結合的拮抗劑的靶的抗原。B細胞表面標志有CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86白細胞表面標志。有特別興趣的B細胞表面標志是優先表達在B細胞表面而不是其它非B細胞組織表面，并且在前B細胞和成熟B細胞上都可表達的一種標志。在一個具體實施方案中，所述標志，如CD19或CD20，是在B細胞系由干細胞階段到最終分化至漿細胞之前的整個階段在B細胞上發現的一種標志。這里優先的B細胞表面標志是CD19和CD20。
“CD20”抗原是在90％以上來自外周血或淋巴器官的B細胞表面發現的一種～35kDa的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細胞發育階段表達，并保持到漿細胞分化。CD20在正常B細胞和惡性B細胞上均可發現。文獻中CD20亦稱為“B淋巴細胞限制性抗原”或“Bp35”。例如CD20抗原在Clark等，PNAS(USA)821766(1985)中被描述。
“CD19”抗原是指由諸如HD237-CD19或B4抗體鑒定的～90kDa抗原(Kiesel等，白細胞研究II，121119(1987))。與CD20一樣，CD19是在細胞系由干細胞階段到最終分化至漿細胞之前的整個階段在細胞上發現的一種標志。拮抗劑與CD19的結合可能引起CD19的內在化。
本文中“自身免疫病”是一種源自個體自身組織或直接針對個體自身組織的非惡性疾病。本文中自身免疫病特別排除了惡性疾病或腫瘤性疾病，尤其排除了B細胞淋巴瘤，急性淋巴細胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，毛細胞(Hairy cell)白血病和慢性成髓細胞性白血病。自身免疫病實例包括，但不限于，炎性應答如炎性皮膚疾病包括牛皮癬和皮炎(如過敏性皮炎)；系統性硬皮病和硬化癥；與炎性腸疾病有關的應答(如克羅恩氏(Crohn’s)病和潰瘍性結腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘破綜合征；ARDS)；皮炎；腦脊膜炎；腦炎；色素膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏性疾病如濕疹和哮喘，以及涉及T細胞浸潤和慢性炎性應答的其它疾病；動脈粥樣硬化；白細胞粘附缺陷；類風濕性關節炎；系統性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(如I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發性硬化癥；雷諾氏(Reynaud’s)綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；斯耶格倫氏(Sjorgen’s)綜合征；幼年型糖尿病；常見結核、結節病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎中的，涉及細胞因子和T淋巴細胞所介導的急性和遲發型超敏反應的免疫應答；惡性貧血(阿狄森氏(Addison’s)病)；與白細胞滲出有關的疾病；中樞神經系統(CNS)炎性病變；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥；或庫姆斯氏(Combs)陽性貧血)；重癥肌肌無力；抗原抗體復合物介導的疾病；抗腎小球基底膜疾病；抗磷脂綜合征；過敏性神經炎；格雷夫斯氏(Graves’s)綜合征；蘭-伊氏(Lambert-Eaton)肌無力綜合征；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內分泌腺疾病；賴特爾氏(Reiter’s)病；全身肌強直(stiff-man)綜合征；貝切特氏(Behcet)病；巨細胞性動脈炎；免疫復合物性腎炎；IgA腎病；IgM多發性神經炎；免疫性血小板減少性紫癜或自身免疫性血小板減少癥等。
“拮抗劑”是通過與B細胞表面標志結合能破壞或耗竭哺乳動物中的B細胞和/或例如通過減少或阻止B細胞所激發的體液應答而干擾B細胞的一或多種功能的分子。拮抗劑優選能耗竭所治療的哺乳動物中的B細胞(即降低循環B細胞水平)。這種耗竭可通過多種機制獲得，如抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒作用(CDC)，對B細胞增殖的抑制和/或對B細胞死亡的誘導(即通過凋亡)。本發明的拮抗劑包括與B細胞標志結合的抗體、合成序列肽或天然序列肽以及小分子拮抗劑，可任選偶聯或融合于一種細胞毒制劑。優選拮抗劑包含一種抗體。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用”和“ADCC”指一種細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒細胞(如自然殺傷(NK)細胞，中性粒細胞，和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，并隨后引起靶細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞即NK細胞僅表達FcγR III，而單核細胞表達FcγR I，FcγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫學年鑒9457-92(1991)，464頁的表3中總結了造血細胞上的FcR表達。為評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC試驗，如美國專利5,500,362號或5,821,337號中所述。這類試驗中有用的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。選擇性地，或附加地，目的分子的ADCC活性可在體內評估，例如采用Clynes等PNAS(USA)95652-656(1998)中公開的動物模型。
“人效應細胞”是表達一種或多種FcR并執行效應物的功能的白細胞。優選所述細胞表達至少FcγR III并執行ADCC效應物的功能。例如可介導ADCC的人白細胞包括人外周血單個核細胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細胞，單核細胞，細胞毒T細胞和中性粒細胞；其中優選PBMC和NK細胞。
術語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區結合的受體。優選的FcR是人FcR的天然序列。而且，優選的FcR是與IgG抗體結合的受體(γ受體)，其包括FcγR I，FcγR II和FcγR III亞型，以及這些受體的等位基因變體以及可替換的剪接形式。FcγR II受體包括FcγR IIA(“活化型受體”)和FcγR IIB(“抑制型受體”)，二者的氨基酸序列相似，主要區別在其胞漿結構域。活化型受體FcγR IIA在其胞漿結構域包含一個基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγR IIB在其胞漿結構域包含一個基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見Daeron，免疫學年鑒15203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫學年鑒9457-92(1991)；Capel等，免疫方法(免疫學方法)425-34(1994)；和de Haas等，實驗室及臨床醫學雜志(J.Lab.Clin.Med.)126330-41(1995)中對FcR進行了綜述。其它FcR，包括將來被確定的，均被包含在術語“FcR”中。該術語也包括新生受體，FcRn，其負責將母體的IgG轉運至胎兒(Guyer等，免疫學雜志117587(1976)和Kim等，免疫學雜志24249(1994))。
“補體依賴性細胞毒作用”或“CDC”是指在補體存在時分子裂解靶細胞的能力。補體活化途徑由補體系統第一個成分(C1q)結合至一個與同源抗原形成復合物的分子(如抗體)來啟動。為評價補體活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫學方法雜志202163(1996)所述進行CDC試驗。
“生長抑制”拮抗劑是指那些阻止或減少可與拮抗劑結合之抗原的表達細胞增殖的拮抗劑。例如拮抗劑可在體內或體外阻止或減少B細胞的增殖。
“誘導凋亡”的拮抗劑是指那些可誘導例如，B細胞程序性細胞死亡的拮抗劑，所述凋亡可通過標準凋亡試驗，如annexin V的結合，DNA片段化，細胞皺縮，內織網膨脹，細胞碎裂，和/或膜泡(稱為凋亡小體)形成確定。
這里的術語“抗體”用其最廣泛的意義，尤其包含完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及能顯示所需生物學活性的任何抗體片段。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優選包括抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；二價抗體；線性化抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段構成的多特異性抗體。
“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)構成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，免疫球蛋白不同種型的重鏈中二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規則間隔的鏈內二硫鍵。每個重鏈在其一個端有可變區(VH)，緊接著多個恒定區。每個輕鏈端有變區(VL)，而另一端有恒定區；輕鏈恒定結構域與重鏈第一恒定結構域并列，輕鏈的可變區與重鏈的可變區并列。認為輕鏈和重鏈的可變區有特定氨基酸形成一個界面。
術語“可變的”是指不同抗體的可變區特定部分序列差異很大，且這些部分在每種抗體與其特定抗原的結合和特異性中有用。然而在抗體整個可變區中可變性的分布并不均等。它集中在輕鏈和重鏈可變區的三個被稱為高變區的節段中。可變區的更高度保守部分被稱為框架區(FR)。天然輕鏈和重鏈的可變區分別包含四個FR，它們大多采用β片層構象，通過三個高變區相連，這些高變區與β片層結構形成環狀，有時形成部分環狀。每條鏈的高變區通過FR連接至十分接近，并與其他鏈的高變區共同形成抗體的抗原結合位點(見Kabat等，具有免疫學意義的蛋白的序列，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定區不直接參與抗體對抗原的結合，但顯示多種效應功能，如使抗體參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)。
抗體經木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的稱為“Fab”的抗原結合片段和一個殘余“Fc”片段，每個Fab片段具有單個抗原結合位點，Fc的名稱反映了其容易形成結晶的能力。胃蛋白酶處理產生一個F(ab’)2片段，它有兩個抗原結合位點并仍能與抗原交叉結合。
“Fv”是最小抗體片段，包含一個完整的抗原識別和抗原結合位點。這個區域是由一條重鏈和一個輕鏈可變區緊密、非共價結合成的二聚體。在VH-VL二聚體表面，每個可變區的三個高變區在構型上相互作用，從而限定一個抗原結合位點。六個高變區共同賦予抗體以抗原結合特性。但即使單個可變區(或Fv中僅包含三個抗原特異性高變區的那一半)也能識別并結合抗原，只是比完整結合位點的親和力低。
Fab片段還包含輕鏈恒定區和重鏈的第一恒定區(CH1)。Fab’不同于Fab片段之處在于，其重鏈CH1結構域的羧基端添加了數個殘基，其中包括來自抗體鉸鏈區的一或多個半胱氨酸。本文中Fab’-SH指一種Fab’，其中恒定區的半胱氨酸殘基有至少一個游離巰基。F(ab’)2抗體片段最初是作為Fab’片段對且它們之間有鉸鏈區半胱氨酸的形式產生的。抗體片段的其它化學連接也是已知的。
脊椎動物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以是兩種完全不同的型(κ和λ)之一，型別區分的依據是其恒定區氨基酸序列。
抗體依據其重鏈恒定區氨基酸序列分為不同的類。完整抗體有五大類IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中幾種能進一步分為亞型(同種型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。對應于不同類抗體的重鏈恒定區結構域分別被稱為α，δ，ε，γ和μ。免疫球蛋白不同類的亞單位和三維構型是已知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結構域，這些結構域存在于單個多肽鏈上。優選Fv多肽在VH和VL結構域之間還包含一個多肽接頭，它能使scFv形成抗原結合所需的結構。關于scFv的綜述見Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
術語“二價抗體(diabodies)”是指具有兩個抗原結合位點的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的一個重鏈可變區(VH)和一個輕鏈可變區(VL)。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個結構域無法配對，不得不與另一條鏈上的互補結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美國國家科學院學報，906444-6448(1993)中有對二價抗體的更詳細描述。
本文中術語“單克隆抗體”指從實質上均一的抗體群獲得的抗體，即包含該群體的單個抗體除了可能自然發生的很少量突變以外都相同。單克隆抗體均以高度特異性直接針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(多克隆)抗體制劑相比，每種單克隆抗體直接針對抗原上的單個決定簇。單克隆抗體除了具有特異性，其優勢還在于，它們是通過雜交瘤培養而合成的，無其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆的”指抗體獲自實質上均一的抗體群的特征，不應理解為限定由任何具體方法產生抗體。例如根據本發明使用的單克隆抗體可以用由Kohler等，自然，256495(1975)首次描述的雜交瘤方法來制備，或用重組DNA法(如美國專利4,816,567)來制備。“單克隆抗體”還可以是用Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學雜志，222581-597(1991)所述技術從噬菌體抗體庫中分離得到。
本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，只要它們展示所需生物學活性，其中所述嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于來自特定物種的抗體或屬于特定抗體類或亞類的抗體的相應序列，鏈的其余部分等同于或同源于來自其它物種的抗體或屬于另一抗體類或亞類的抗體的相應序列(見美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學院學報，816851-6855(1984))。本文的目標嵌合抗體包括“靈長類化(primatized)”抗體，其包含源于非人靈長類可變區的抗原結合序列(如OldWorld Monkey，如狒狒，獼猴(rhesus)或恒河猴(cynomolgus monkey))和人的恒定區序列(美國專利5,693,780)。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗體是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在多數情況下，人源化抗體是下述人免疫球蛋白(接收(recipient)抗體)，其中受者的高變區殘基被非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類(供者(donor)抗體)的具有所需特異性、親和力和能力(capacity)的高變區的殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架區(FR)殘基被相應的非人殘基取代。而且人源化抗體可包含未在受者抗體或供者抗體中發現的殘基。這些修飾旨在進一步細化抗體的功能。一般情況下，人源化抗體基本上包含至少一個、通常兩個可變區的全部，其中所有或基本上所有高變環對應于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗體任選還包含免疫球蛋白恒定區(Fc)、通常為人免疫球蛋白的至少一部分。祥見Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
本文中術語“高變區”是指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區含有“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重鏈可變區的殘基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫學意義的蛋白的序列，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高變環”的殘基(例如輕鏈可變區的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重鏈可變區的殘基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學雜志196901-917(1987))。“框架區”或“FR”殘基是除本文所定義的高變區殘基以外的可變區殘基。
“結合”目的抗原如B細胞表面標志的拮抗劑是下述拮抗劑，其能以足夠的親和力結合該抗原因而其可作為靶向表達該抗原的細胞的治療劑。
與CD20抗原結合的抗體有“C2B8”現在被稱為“rituximab”(“RITUXAN”)(美國專利5,736,137，引入作為參考)；釔-[90]-標記的2B8鼠抗體“Y2B8”(美國專利5,736,137，引入作為參考)；任選用131I標記鼠IgG2a“B1”產生“131I-B1”抗體(BEXXARTM)(美國專利5,595,721，引入作為參考)；鼠單克隆抗體“IF5”(Press等Blood 69(2))584-591(1987))；“嵌合2H7”抗體(美國專利5,677,180，引入作為參考)；和可從國際白細胞分型小組(Intemational Leukocyte Typing Workshop)獲得的單克隆抗體L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2(Valentine等，在《白細胞分型III》(McMichael編，第440頁，Oxford University Press(1987))。
與CD19抗原結合的抗體包括Hekman等，癌癥免疫學和免疫方法(Cancer Immunol.Immunother.)32364-372(1991)和Vlasveld等，癌癥免疫學和免疫方法4037-47(1995)中所述抗CD19抗體；和在Kiesel等，白血病研究II，121119(1987)中所述B4抗體。
本文中術語“rituximab”或“RITUXAN”指經遺傳工程改造的、針對CD20抗原的嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利5,736,137(引入作為參考)中命名為“C2B8”。該抗體是含小鼠輕鏈和重鏈可變區序列及人的恒定區序列的IgG1κ型免疫球蛋白。Rituximab結合CD20的親和力為約8.0nM。
“分離”的拮抗劑是已經從其自然環境組分中鑒定并分離和/或回收的拮抗劑。其自然環境中的污染成分有，可干擾該拮抗劑的診斷和治療應用的礦物質，可能還包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶質。在優選實施方案中，，該拮抗劑的純度應達到(1)經Lowery法確定的拮抗劑重量的95％以上，最優選所述重量的99％以上，(2)足以獲得用旋轉杯狀(spinning cup)序列分析儀所測至少15個殘基的N端或內部氨基酸序列，(3)通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色、優選銀染所證實的均質性。分離的拮抗劑包括重組細胞內的原位拮抗劑，因為該拮抗劑的自然環境中的至少一種組分已不存在。一般情況下分離的拮抗劑可通過至少一個純化步驟來制備。
需要治療的“哺乳動物”是指歸為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和農場動物，以及動物園里的動物、參與運動項目的動物或寵物如狗、馬、貓、牛等。優選所述哺乳動物為人類。
“治療”是指治療方法和預防措施。需要治療者包括已經患病者，以及需要對疾病進行預防者。因此，哺乳動物可能被診斷為已患病或對所述疾病易感。
“治療有效量”是指能有效阻止，改善或治療目標自身免疫病的拮抗劑的量。
本文用于輔助治療的術語“免疫抑制劑”是指能抑制或掩蓋所治哺乳動物的免疫系統的物質。這將包括能抑制細胞因子的產生，下調或抑制自身抗原的表達，或掩蓋MHC抗原的物質。這些制劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利4,665,077，其全文引入本文作參考)；硫唑嘌呤；環磷酰胺；溴麥角環肽；達那唑；氨苯砜；戊二醛(它們掩蓋MHC抗原，如美國專利4,120,649所述)；抗MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環孢菌素A；類固醇如糖皮質激素，例如強的松，甲基強的松龍和地塞米松；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑包括抗IFN-γ，-β或-α抗體，抗TNF-α抗體，抗TNF-β抗體，抗IL-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；pan-T抗體，優選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；包含LFA-3結合結構域的可溶性肽(公開于7/26/90的WO90/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；源于宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T細胞受體(Cohen等，美國專利5,114,721)；T細胞受體片段(Offner等，科學，251430-432(1991))；WO90/11294；Ianeway，自然，341482(1989)；和WO 91/01133)；和T細胞受體抗體(EP 340,109)例如T10B9。
本文中術語“細胞毒制劑”是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，p32和镥的放射性同位素)，化療制劑，毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，或它們的片段。
“化療制劑”是在腫瘤治療中使用的化學化合物。化療制劑實例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)；環膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如benaodopa，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車霉素(calicheamicin)，carabicin，洋紅霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，道諾紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，doxifluridine，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睪酮，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡內酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；elliptinium acetate；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；nitracrine；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春堿酰胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和doxetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；異環磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓(vinorelbine)；navelbine；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。
術語“細胞因子”是由一個細胞群釋放的、作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白的總稱。這類細胞因子有淋巴因子，單核因子，和傳統的多肽激素。包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；mullerian-抑制物；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內皮細胞生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。
本發明使用的術語“前體藥物”是指藥物活性物質的前體或衍生物形式，其相對于親本藥物對腫瘤細胞的細胞毒作用較小且可酶促活化或被轉換成更具活性的親本形式。例見Wilman，“癌癥化療中的前體藥物”Biochemical Society Transaction，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物一種藥物定向運送的化學方法”定向藥物運送，Borchardt等(編)，pp.247-267，Humana press(1985)。本發明的前體藥物包括，但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內酰胺的前體藥物，任選含有取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選含有取代的苯基乙酰胺的前體藥物，可轉化為更具細胞毒活性的游離藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物。可衍生為本發明所用前體藥物形式細胞毒藥物包括，但不限于上述化療試劑。
“脂質體”是由能向哺乳動物有效運送藥物(如本文所公開的拮抗劑，和，任選地，一種化療試劑)的各類脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子載體。通常將脂質體成分安排為一種雙層形式，其類似于生物膜的脂質排列。
所用的術語“包裝插頁”是指通常包括在治療產品的商業包裝中，含有與這些治療產品的使用有關的說明，用法，劑量，給藥，禁忌和/或警示等的說明書。
II.拮抗劑的制備本發明的方法和制品使用，或摻入了一種能結合B細胞表面標志的拮抗劑。相應地，本文還描述了產生這類拮抗劑的方法。
用于產生或篩選拮抗劑的B細胞表面標志可以是，如抗原的可溶形式或其一部分，包括所需表位。或者，或任選，在表面表達所述B細胞表面標志的細胞可用于產生或篩選拮抗劑。可用于產生拮抗劑的其它形式的B細胞表面標志為本領域所顯而易見，優選為CD19或CD20抗原。
雖然優選的拮抗劑是抗體，但除抗體以外的其它拮抗劑也包括在此。例如，拮抗劑可含有任選融合至或偶聯于細胞毒試劑(如本文所公開的那些)的小分子。可在小分子文庫中篩選本文的目標B細胞表面標志，以便鑒定能與該抗原結合的小分子。還可進一步篩選小分子的拮抗特性和/或使其與細胞毒試劑偶聯。
拮抗劑也可以是經合理設計或噬菌體展示(例見WO98/35036，1998年8月13日公開)。在一個具體實施方案中，所選的分子可以是“CDR類似物”或基于抗體CDR而設計的抗體類似物。盡管所述肽本身可能就有拮抗性，但任選將此肽與細胞毒制劑融合，以便添加或增強此肽的拮抗性。
以下為本發明所用抗體拮抗劑的產生技術舉例。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優選通過多次給動物皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑而產生。將所述相關抗原與針對所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來酰亞氨苯甲酰基硫代琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基結合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，進行偶聯是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯物或衍生物免疫動物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯物(分別針對兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點皮內注射該溶液。1個月后，多位點皮內注射起始量的1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑的偶聯物來加強免疫。7-14天后，對動物采血，測定血清中的抗體效價。對動物的加強免疫直到效價達到平臺期為止。優選給動物加強注射相同抗原的偶聯物，但也可以是偶聯至不同蛋白和/或通過不同的交聯劑偶聯的偶聯物。偶聯物還可以是重組細胞培養物產生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強免疫應答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體來自基本均一的抗體群，即該群體中的每個抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞“單克隆”指所述抗體的并非不同抗體混合物的特性。
例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術制備，或用重組DNA方法制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適合的宿主動物如倉鼠，以激發那些產生或能產生與用于免疫之蛋白特異性結合的抗體的淋巴細胞。另外，可體外免疫淋巴細胞。然后用適當融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體原理及應用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細胞接種至適當培養基中并培養，優選該培養基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養基)，這些物質阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。
優選骨髓瘤細胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩定的高水平產生抗體，并對諸如HAT培養基等類似培養基敏感的細胞。其中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell DistreibutionCenter，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細胞和由美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也有報道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質性骨髓瘤細胞系可用于產生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術及應用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))可在含有生長的雜交瘤細胞培養基中分析直接針對所述抗原的單克隆抗體的產生。雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉淀或通過體外結合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)來分析。
單克隆抗體的結合親和力可通過如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來測定。
一旦鑒定出能產生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(Goding，單克隆抗體原理及應用，pp.59-103(Academic Press，1986))。適于此目的的培養基包括如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可作為腹水中腫瘤的形式在動物體內生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養基、腹水或血清中分離。
編碼單克隆抗體的DNA可用常規方法很容易的分離和測序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優選來源。DNA分離后，可將其插入表達載體中，然后用此表達載體轉染宿主細胞，如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述見Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一實施方案中，可從用McCafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術產生的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。后來的文獻描述了通過鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術10779-783(1992))，以及用于構建大規模噬菌體文庫的組合感染和體內重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術都可取代傳統單克隆抗體雜交瘤技術來分離克隆抗體。
DNA也可通過用人類重鏈和輕鏈的恒定區編碼序列取代小鼠同源序列來修飾(美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學院學報816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價結合來修飾。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區，或取代抗體上一個抗原結合點的可變區，形成二價嵌合抗體，其中一個抗原結合位點特異于一種抗原而另一個抗原結合位點特異于另一種抗原。
(iii)人源化抗體本領域已有關于人源化非人類抗體的制備方法的描述。優選人源化抗體中已導入一或多個源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學，2391534-1536(1988))所述，用高變區序列取代人類抗體的相應序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區的很少一部分被非人類物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。
對用于制備人源化抗體的人類可變區包括重鏈和輕鏈的選擇，對降低抗原性非常重要。根據所謂“最適應”方法，針對已知人類可變區序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變區序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(FR)(Sims等，免疫學雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國國家科學院學報，894285(1992)；Presta等，免疫學雜志，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領域技術人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構象的計算機程序。通過觀察這些展示結果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基，通過這種方法，可從受者和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質，如對靶抗原的親和力增加。總之，高變區殘基直接并且最主要涉及對抗原結合的影響。
(iv)人類抗體除了進行人源化以外還可制備人類抗體。例如現在已能產生如下轉基因動物(如小鼠)，它們通過免疫能產生人類抗體的所有成分而不產生內源免疫球蛋白。例如，有報道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合缺失導致內源抗體的產生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉移到這類種系突變小鼠中將導致因抗原攻擊而誘導人類的抗體產生。見Jakobovits等，美國國家科學院學報，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.733(1993)；和美國專利5591669，5589369和5545807。
或者，可用噬菌體展示技術(McCafferty等，自然348552-553(1990))從未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區基因的所有組成而體外產生人類抗體和抗體片段。依據此技術，將抗體V區基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據抗體的功能特點進行的選擇也導致對顯示這些性質的抗體的編碼基因進行選擇。因此，噬菌體模仿了B細胞的部分特點。噬菌體展示可以以多種形式進行；這些綜述見Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，結構生物學的最新觀點(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)。可使用V基因片段的多個來源進行噬菌體展示。Clackson等，自然，352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因的隨機組合小文庫中分離了抗-惡唑酮抗體的一個多樣性陣列。可基本如Marks等，分子生物學雜志222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述構建未免疫人類供者的V基因所有組成，并分離針對抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見美國專利5565332和5573905。
人類抗體也可通過體外激活的B細胞而產生(見美國專利5,567,610和5,229,275)。
(v)抗體片段已開發了生成抗體片段的多種技術。傳統上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學和生物物理學方法雜志(Joumal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學，22981(1985))。但現在可直接通過重組宿主細胞產生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經化學連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術10163-167(1992))。依據另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養中分離F(ab’)2片段。其它產生抗體片段的技術對本領域技術人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458。抗體片段也可以是“線性化抗體”，如美國專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結合特異性的抗體。如雙特異性抗體可以與B細胞表面標志物的兩種不同表位結合。其它這類抗體可以結合第一個B細胞表面標志并再結合第二個B細胞表面標志。或者，可將抗B細胞標志物的結合臂與結合白細胞上引發分子的臂結合，從而集中針對B細胞的細胞防御機制，所述引發分子如T細胞受體分子(CD2或CD3)，或IgG Fc受體(FcγR)如FcγR I(CD64)、FcγR II(CD32)和FcγRIII(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細胞毒制劑定位至B細胞。這些抗體具有B細胞標志物結合臂和結合細胞毒制劑(例如皂草素，抗INF-α，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。完整雙特異性抗體的傳統制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些雜交瘤(quadroma)可能產生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復雜，且產量很低。類似的方法見WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依據另一種方法，可將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恒定區序列融合。該融合優選與包含鉸鏈區的至少一部分、CH2及CH3區的免疫球蛋白重鏈恒定區融合。優選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恒定區(CH1)出現在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構建的實施方案中，能夠較靈活地調整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現這種不對稱結構有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節，見Suresh等，酶學方法，121210(1986)。
根據美國專利5,731,168所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養中獲得的異源二聚體的百分比最大。優選的界面包括抗體恒定區CH3結構域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側鏈被較大側鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側鏈大小相同或相近的互補“溝”可通過將氨基酸大側鏈用小側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產量比不想要的終產物如同型二聚體的高。
雙特異性抗體包括交聯抗體或“異源偶聯的”抗體。例如，可使異源偶聯物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯，使另一抗體與生物素偶聯。有觀點認為，這類抗體可用于將免疫細胞導向不想要的細胞(美國專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯抗體可通過任何適當的交聯方法制備。適當的交聯制劑和多種交聯技術為本領域已知，可在美國專利4676980號中獲得。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術已有文獻。例如，雙特異性抗體可利用化學連接制備。Brennan等，科學22981(1985)中描述了將完整抗體經蛋白水解制備F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復合劑亞砷酸鈉存在時被還原，從而穩定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進展促進了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經化學偶聯形成雙特異性抗體。Shalaby等，實驗醫學雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來，體外直接化學偶聯形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結合，還能引發人類細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤細胞的裂解活性。
直接從重組細胞培養中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國國家科學院學報，906444-6448(1993))描述的“二價抗體”技術提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結構域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結構域被迫與另一片段上的互補VL和VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。此外還報道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學雜志，14760(1991)。
III.偶聯以及對拮抗劑的其它修飾本文方法或制品中提到的拮抗劑可任選與細胞毒制劑偶聯。
可用于制備這些拮抗劑-細胞毒制劑偶聯物的化療試劑如上述。
本文還涉及拮抗劑與一或多種小分子毒素，如加利車霉素，美登素(美國專利5,208,020)，單端孢霉烯(trichothene)，CC1065的偶聯物。在本發明的一個實施方案中，使拮抗劑與一或多個美登素分子偶聯(如每個拮抗劑分子與約1-10個美登素分子偶聯)。美登素可轉化成May-SS-Me，然后還原成May-SH3，并與修飾過的拮抗劑反應(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))產生美登木素生物堿-拮抗劑偶聯物。
另外，拮抗劑可以與一或多個加利車霉素分子結合。加利車霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車霉素結構類似物包括，但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG以及θ1I(Hinmam等，癌癥研究533336-3342(1993)和Lode等，癌癥研究582925-2928(1998))。
可以應用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見1993年10月28日公開的WO93/21232。
本發明還涉及與具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯的拮抗劑。
多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯的拮抗劑，實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32以及Lu的放射性同位素。
拮抗劑與細胞毒制劑的偶聯物可通過多種雙功能蛋白偶聯劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲酰基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學2381098(1987)所述制備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯至拮抗劑的偶聯劑之一。見WO94/11026。這種接頭可能是有利于細胞毒藥物在細胞內釋放的“可斷開的接頭”。例如，可使用酸不穩定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))。
或者，可通過重組技術或肽合成來獲得拮抗劑與細胞毒制劑的融合蛋白。
在另一實施方案中，拮抗劑可與腫瘤預靶向中應用的“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯，將該拮抗劑-受體偶聯物給予患者，之后用清除劑除去循環中未結合的偶聯物，再給予已偶聯了細胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如抗生物素蛋白)。
本發明的拮抗劑還可與前體藥物活化酶相結合，該酶可以將前體藥物(如肽基化療劑，見WO81/01145)轉化為活性抗癌藥物。見WO88/07378和美國專利4,975,278。
這些偶聯物中的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉化為活性更強的細胞毒形式的任何酶。
本發明的方法中用到的酶包括，但不限于，能將含磷酸基的前體藥物轉化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸基的前體藥物轉化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；將無毒的5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；能將含肽的前體藥物轉化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等；可轉化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；能將糖基化前體藥物轉化為游離藥物的碳水化合物裂解酶類如β-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；能將β-內酰胺衍生的藥物轉化為游離藥物的β-內酰胺酶；能在藥物中的氨基氮處分別用苯氧乙酰基或苯乙酰基轉化而使藥物游離的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可用本領域稱為“抗體酶”的具有酶活性的抗體，將本發明的前體藥物轉化為游離的活性藥物(見Massey，自然328457-458(1987))。可如本文所述制備拮抗劑-抗體酶偶聯物以便將抗體酶運送至腫瘤細胞群。
本發明的酶可通過本領域已知的技術，如上述異源雙功能交聯試劑的使用而與拮抗劑共價結合。或者，可以通過本領域已知的DNA重組技術(如Neuberger等，自然，312604-608(1984))構建含至少本發明拮抗劑的抗原結合區的融合蛋白，所述拮抗劑與本發明酶的至少一個功能活性部分連接。
本文還涉及對拮抗劑的其它修飾。例如，拮抗劑可與一種非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物交聯。
本文公開的拮抗劑還可配成脂質體。含拮抗劑的脂質體可通過本領域已知方法制備，如Epstein等，美國國家科學院學報823688(1985)；Hwang等，美國國家科學院學報774030(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公開的WO97/38731。在美國專利5,013,566中公開了循環壽命增加了的脂質體。
特別有效的脂質體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物經反相蒸發法產生。脂質體通過一定孔徑大小的濾膜而擠出后獲得具有所需直徑的脂質體。本發明抗體的Fab’片段可如Martin等，生物學化學雜志，257286-288(1982)所述，經二硫化物交換反應與脂質體偶聯。可任選在所述脂質體中包含一種化療制劑。見Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
本發明還涉及對本文所述蛋白質或肽類拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，可預期改進拮抗劑的結合親和力和/或其它生物學特性。拮抗劑的氨基酸序列變體可通過在拮抗劑核酸中導入適當的核苷酸改變，或通過肽合成法來制備。所述修飾包括，如該拮抗劑的氨基酸序列中的殘基缺失，和/或插入和/或取代。可對缺失、插入、和取代進行任意組合以獲得最終構建體，只要該最終構建體具有所需特性。氨基酸的變化還可改變拮抗劑的翻譯后加工，如改變糖基化位點的數目或位置。
一種鑒別拮抗劑中處于誘變優選位置的特定殘基或區域的有效方法是Cunningham和Wells，科學2441081-1085(1989)所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電的氨基酸取代(最優選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與抗原的相互作用。那些證實對取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過在取代點引入進一步的或其他的變體而改進。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但突變本身不必是預定的。例如，為分析在指定位點處突變的作用，在所述靶密碼子或區域實行丙氨酸掃描或隨機誘變，并篩選所表達的具有預期活性的拮抗劑變體。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長度從一個殘基至包括100個或更多殘基的多肽)，以及序列內單個或多個氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端甲硫氨酰殘基的拮抗劑或與細胞毒性多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括在酶或多肽的拮抗劑的N-或C-末端進行融合，以增加拮抗劑在血清中的半衰期。
另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使拮抗劑分子中至少一個氨基酸殘基被不同殘基取代。抗體拮抗劑分子中最有興趣進行取代誘變的位點包括高變區，也可以改變FR。保守取代見表1的“優先取代”欄。如果這些取代引起生物學活性的改變，則可引入表1中“取代舉例” 欄的更實質性改變，或進一步在下文的氨基酸分類中所述的更實質性改變，并篩選產物。
表1
對拮抗劑的生物學特性的實質性修改可通過選擇性取代來完成，所述取代的效應在維持(a)取代區多肽骨架的結構，例如片層結構或螺旋構象，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，(c)側鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據共有的側鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。與維持拮抗劑正確構象有關的任何半胱氨酸殘基也可被取代，如被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩定性，并阻止異常交聯。相反，可在拮抗劑中添加半胱氨酸連接以提高其穩定性(特別當拮抗劑為抗體片段如FV片段時)。
取代變體的特別優選類型包括取代親本抗體高變區的一或多個殘基。通常，所選用于進一步開發的變體相對于其親本抗體應具有改進的生物學活性。產生這種取代變體的一個方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，使高變區的幾個位點(如6-7個位點)突變以便在每一位點產生所有可能的氨基酸取代。這樣產生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個顆粒內包裝的M13基因III產物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學活性(如結合親和力)。為了鑒定備選的高變區修飾位點，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結合作出主要貢獻的高變區殘基。此外，分析抗原-抗體復合物的晶體結構以確定抗原與抗體之間的接觸點也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據本文所述技術進行取代的候選位點。一旦產生這樣的變體，如本文所述對它們全部進行篩選，選出在一或多個相關實驗中具有優勢特性的抗體以便進一步開發。
拮抗劑的另一種氨基酸變體改變了拮抗劑原來的糖基化模式。所謂改變就是去掉拮抗劑中的一或多個碳水化合物部分，和/或添加一或多個原本不存在于該拮抗劑中的糖基化位點。
多肽的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側鏈酶促相連的識別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。
在拮抗劑分子中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列，使其包含一或多個上述三肽序列(在添加N-連接糖基化位點的情況下)而實現。這種改變也可通過在原始的拮抗劑序列中添加或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(在添加O-連接的情況下)。
編碼拮抗劑的氨基酸序列變體的核酸分子由本領域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過對早期制備的拮抗劑變體或未變異的拮抗劑進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變，PCR誘變和盒式誘變來制備。
也可預期修飾拮抗劑的效應物功能，如以此增強拮抗劑的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)。這可以通過在抗體拮抗劑FC區引入一或多個氨基酸取代而獲得。此外，可在FC區引入半胱氨酸殘基，使得在此區形成鏈間二硫鍵。由此產生的同型二聚體抗體可提高內在化能力和/或增強補體介導的細胞殺傷作用和ADCC。見Caron等，實驗醫學雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學雜志1482918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯劑制備。或者，可通過工程改造產生具有雙FC區并因此具有增強的補體裂解效應及ADCC能力的抗體。見Stevenson等，抗癌藥物的設計(Anti-Cancer drug design)3219-230(1989)。
為了提高拮抗劑的血清半衰期，一種方法是在拮抗劑(尤其抗體片段)上摻入一個補救受體結合表位，如美國專利5,739,277所述。本文中術語“補救受體結合表位”是指IgG(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區中負責延長該IgG分子的體內血清半衰期的表位。
IV.藥用制劑根據本發明使用的拮抗劑的藥用制劑通過將具有所需純度的拮抗劑與任選的藥用載體、賦形劑或穩定劑(雷氏藥學(Remington’s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以凍干劑或含水劑的形式保存。可藥用載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復合物(例如鋅-蛋白復合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
抗CD20抗體制劑的實例如WO98/56418所述，其已引入本文作為參考。其描述了一種液體多劑量制劑，該制劑包含40mg/ml rituximab，25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨酸酯(polysorbate)20，pH5.0，在2-8℃至少可保存2年。另一種抗CD20目標制劑在9.0mg/ml氯化鈉，7.35mg/ml二水檸檬酸鈉，0.7mg/ml聚山梨酸酯80，注射用無菌水，pH6.5中包含10mg/ml rituximab。
適于皮下給藥的凍干劑見WO97/04801所述。這種凍干劑可用適當稀釋劑重新恢復至高蛋白濃度，所重建的制劑可皮下給藥至這里所治療的哺乳動物。
所述制劑還可根據所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優選具有互補活性但相互無負面影響的那些。例如，優選還提供細胞毒試劑，化療試劑，細胞因子或免疫抑制劑(如作用于T細胞的那些，如環孢菌素或結合T細胞的抗體，如結合LFA-1的抗體)。所述其它試劑的有效量取決于該制劑中拮抗劑的量，疾病或病癥或治療的類型，及上述其它因素。通常應用上文所述劑量和給藥方式，或迄今所用劑量的約1-99％。
活性成分也可容納在通過凝聚技術或界面聚合作用制備的微膠囊中，如分別在膠體性質的藥物運送系統(如脂質體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)或大乳劑(macroemulsions)的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術見雷氏藥學，第16版Osol，A.編(1980)。
也可制備控釋制劑。控釋制劑的適當實例包括含有拮抗劑的固態疏水聚合物的半通透性基質，所述基質為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊。控釋制劑實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。
用于體內給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實現。
V.用拮抗劑進行治療含一種與B細胞表面抗原結合的拮抗劑的組合物可根據常規醫療實踐進行配制、分劑量、并給藥。其中應考慮的因素包括所治療的具體疾病或紊亂，所治療的具體哺乳動物，具體患者的臨床狀況，疾病或紊亂的病因，藥物的給藥部位，給藥方法，給藥時間表，和醫務人員已知的其它因素。拮抗劑的治療有效量將參考上述因素而給予。
作為常規建議，胃腸道外途徑每次給予拮抗劑的治療有效量的范圍是每天約0.1-20mg/kg患者體重，拮抗劑通常的起始劑量為約2-10mg/kg。
優選的拮抗劑是抗體，如不與細胞毒制劑偶聯的RITUXAN。例如，非偶聯型抗體的適當劑量可以是約20mg/m2-約1000mg/m2。在一個具體實施方案中，抗體劑量不同于目前推薦的RITUXAN。例如，可給予患者一或多劑抗體，每劑基本上少于375mg/m2，例如為約20mg/m2-約250mg/m2，如約50mg/m2-約200mg/m2。
此外，可給藥一或多劑起始劑量的抗體，然后給藥一或多劑后續劑量的抗體，其中所述后續劑量中mg/m2抗體劑量高于起始劑量中mg/m2抗體劑量。例如，起始劑量為約20mg/m2-約250mg/m2(如約50mg/m2-約200mg/m2)，而后續劑量了為約250mg/m2-約1000mg/m2。
但如上所述，應在多種治療中謹慎考慮拮抗劑的這些建議劑量。其結果是選擇適當劑量和給藥時間表的關鍵因素，如上所示。例如治療進行性疾病和急性疾病可能需要相對較高的起始劑量。為針對疾病或紊亂獲得最有效的結果，應盡可能在接近于疾病或紊亂的首次癥狀、診斷、表現、或發生時或在疾病或紊亂緩解期間給予拮抗劑。
拮抗劑可通過任何適當方式給藥，包括胃腸道外、皮下、腹膜內、肺內、和鼻內途徑，如需進行局部免疫抑制治療，可在病損內給藥。胃腸道外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內、或皮下給藥。此外，拮抗劑適于經脈沖輸注給藥，如，使用劑量遞減的拮抗劑輸注。優選經注射給藥，最優選靜脈注射或皮下注射，其取決于給藥是短期的還是長期的。
可與本文拮抗劑一起給予其它化合物，如細胞毒試劑、化療試劑、免疫抑制劑和/或細胞因子。組合給藥包括同時給藥各自的制劑或單一可藥用制劑，還包括以任何順序連續給藥，其中優選有一段時間使兩種(或所有)活性試劑同時發揮它們的生物學活性。
除了向患者給藥蛋白拮抗劑，本申請還考慮通過基因治療給藥拮抗劑。這類編碼拮抗劑的核酸的給藥以“給予有效治療劑量的拮抗劑”的表達形式包括在內。例見1996年3月14日公開的WO96/07321，其涉及利用基因治療產生細胞內抗體。
有兩種主要方法可將核酸(任選包含在載體中)引入患者細胞；體內和離體(ex vivo)。體內運送核酸指直接給病人注射，通常注射至需要拮抗劑的位點。離體治療是將患者細胞取出，將核酸引入這些分離的細胞，然后將這些已改變的細胞直接給予患者或裝入多孔膜中再植入患者體內(見美國專利4,892,538和5,283,187)。有多種技術可用于將核酸引入活細胞。可根據是將核酸轉移至體外培養的細胞，還是轉移至目標宿主的體內細胞而使用不同方法。適于將核酸轉移至體外哺乳動物細胞的技術有脂質體的應用、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等。常用于離體運送基因的載體是逆轉錄病毒。
目前優選的體內核酸轉移技術包括用病毒載體(如腺病毒，單純皰疹病毒I型或腺伴隨病毒)和基于脂質的系統(可用于基因的脂質介導型轉移的有效脂質有DOTMA，DOPE和DC-Chol)。某些情況下，希望提供一種帶有能靶向靶細胞的試劑(如特異于細胞表面膜蛋白或靶細胞的抗體，針對靶細胞表面受體的配體，等)的核酸來源。當使用脂質體時，可使用能結合胞吞作用相關性細胞表面膜蛋白的蛋白來靶向和/或促進對下述蛋白的吸收，所述蛋白如對特定細胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段，在循環中進行內在化的蛋白的抗體，靶向細胞內定位和提高細胞內半衰期的蛋白。受體介導型胞吞作用的技術見Wu等，生物學化學雜志2624429-4432(1987)；和Wagner等，美國國家科學院學報，873410-3414(1990)。有關目前已知的基因制備和基因治療方案的綜述見Anderson等，科學256808-813(1992)。亦參見WO93/25673。
VI.制備相關的制品本發明另一實施方案是一種制品，其包含可用于上述疾病或紊亂的治療的材料。所述制品包括一個容器和位于該容器表面的或與該容器相關的標簽或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器可內含一種能有效治療目標疾病或紊亂的組合物，并具有無菌存取口(例如該容器可以是點滴袋(intravenous solution bag)或帶有能通過皮下注射針穿刺的塞子的小瓶)。所述組合物中至少一種活性試劑是與B細胞表面標志結合的拮抗劑。標簽或包裝插頁將指明，所述組合物是用于治療自身免疫病(如本文所列)患者或易感者。所述制品還可包含第二個容器，該容器中含有可藥用稀釋液，如細菌抑制性注射用水(BWFI)，磷酸鹽緩沖液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。還可包括具有商業需要以及符合用戶需要的材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，濾器，針頭，和注射器。
本發明的更詳細內容通過以下非限制性實施例舉例說明。本說明書中所引用的所有文獻均引入作為參考。
實施例1臨床診斷為類風濕性關節炎(RA)的患者用rituximab(RITUXAN)抗體進行治療。所治患者沒有B細胞惡性病。此外，患者可任選進一步用任何一或多種治療RA的試劑進行治療，所述試劑如水楊酸鹽；非類固醇抗炎藥物如吲哚美辛、苯丁唑酮、苯乙酸(如布洛芬和非諾洛芬)、萘乙酸(萘普生)、吡咯鏈烷酸(tometin)、吲哚乙酸(蘇靈大)、鹵代鄰氨基苯甲酸(甲氯滅酸鈉)、炎痛喜康、苯酰吡酸鈉、二氟苯水楊酸；抗瘧疾藥物如氯奎；金鹽；青霉胺；或免疫抑制劑如氨甲喋呤或皮質激素，所用劑量為這些藥物的已知用藥劑量或減量。但優選僅用RITUXAN治療患者。
可按下述任一種劑量方案給RA患者靜脈注射(IV)RITUXAN(A)第1天靜脈注射50mg/m2，第8、15和22天靜脈注射150mg/m2(B)第1天靜脈注射150mg/m2，第8、15和22天靜脈注射375mg/m2(C)第1、8、15和22天靜脈注射375mg/m2
第一次應答通過Paulus指數(Paulus等，Athritis Rheum.33477-484(1990))測定，所述指數為晨僵、疼痛且發炎的關節的數量、血沉(ESR)的改善，以及經患者和醫生評估的疾病嚴重程度之5點評分中至少提高了2點。給予RITUXAN將在接受上述治療的患者體內緩解一或多種RA癥狀。
實施例2診斷為自身免疫性溶血性貧血(AIHA)，例如冷球蛋白血癥或庫姆斯氏(Coombs)陽性貧血的患者用RITUXAN抗體進行治療。AIHA是由于與患者紅細胞反應的自身抗體導致的一種獲得性溶血性貧血。被治療的患者沒有B細胞惡性病。
可按下述任一種劑量方案給所述患者靜脈注射(IV)RITUXAN(A)第1天靜脈注射50mg/m2，第8、15和22天靜脈注射150mg/m2(B)第1天靜脈注射150mg/m2，第8、15和22天靜脈注射375mg/m2(C)第1、8、15和22天靜脈注射375mg/m2其它輔助治療(如糖皮質激素，強的松，硫唑嘌呤，環磷酰胺，vinca-laden血小板或達那唑)可與RITUXAN治療聯合應用，但優選在治療全程僅用RITUXAN作為單一制劑進行治療。
總應答率的確定取決于血細胞計數的增加、對輸液的需求減少、血紅蛋白水平的提高和/或通過標準化學參數確定的溶血證據的減少。在上述接受治療的患者體內，RITUXAN給藥將改善溶血性貧血的一或多種癥狀。例如，接受上述治療的患者顯示血紅蛋白至少增加1g/d1，有關溶血作用的化學參數也有50％改善或恢復正常(如血清乳酸脫氫酶，膽紅素所測)。
實施例3成人免疫性血小板減少性紫癜(ITP)是一種非常罕見的血液病，其構成最常見的免疫介導型細胞減少癥。該病通常伴有嚴重的血小板減少，其可能與骨髓中正常量或增加量的巨核細胞存在時的急性出血有關。大多數ITP患者具有直接針對血小板膜外表面靶抗原的IgG抗體，導致血小板在脾臟滯留并加速網狀內皮對血小板的破壞(Bussell J.B.Hematol.Oncol.Clin.NorthAm.(4)179(1990))。多項干預治療已顯示在ITP治療中有效。通常將類固醇作為第一線治療，然后大多數患者將選擇靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)，脾切除，或其它治療包括長春新堿或免疫抑制劑/細胞毒制劑的治療。多達80％的ITP患者在最初階段能應答類固醇，但極少數能徹底并持續緩解癥狀。脾切除被推薦為類固醇治療失敗后標準的二線治療，近60％的患者緩解期延長，但可導致對感染的免疫力下降。脾切除是與高發病率(16％)和高死亡率(2％)相關的主要外科手術。IVIG也被作為二線治療，盡管只有一小部分成人ITP患者獲得緩解。
能干擾活化B細胞產生自身抗體，但不出現與皮質激素和/或脾切除術相關的發病率的治療選擇將為部分ITP患者提供一種重要的治療方法。
臨床診斷為ITP(如血小板計數＜50,000/μL)的患者用rituximab(RITUXAN)抗體進行治療，可任選聯合類固醇治療。所治療的患者沒有B細胞惡性病。
可按下述任一種劑量方案給ITP患者靜脈注射(IV)RITUXAN(A)第1天靜脈注射50mg/m2，第8、15和22天靜脈注射150mg/m2(B)第1天靜脈注射150mg/m2，第8、15和22天靜脈注射375mg/m2(C)第1、8、15和22天靜脈注射375mg/m2在注射RITUXAN前，患者先靜脈給藥苯海拉明(diphenhydramine)25-50mg和口服對乙酰氨基酚(acetaminophen)650mg各一劑。用無菌注射器和21號針頭或更大號針頭，從小瓶取所需數量的RITUXAN至無菌、無熱原質但含0.9％NaCl，USP(鹽溶液)的IV袋中。RITUXAN終濃度約1mg/mL。起始劑量的注入率在第一個半小時期間為25mg/hr，然后每隔30分鐘增加50mg/hr，直至最大注入率200mg/hr。如果對第一輪RITUXAN輸注能很好耐受，則后續數輪的注入率從50mg/hr開始，然后每隔30分鐘增加100mg/hr，直至最大輸入率不超過300mg/hr。每15分鐘監測生命指征(血壓、脈搏、呼吸、體溫)，共監測4次或直到穩定，然后每小時監測1次直到輸注結束。
連續4周每周用RITUXAN治療1次，然后根據間隔2周連續2次測定的血小板計數來確定總應答率。用RITUXAN治療的患者比用安慰劑治療的患者血小板計數增加。例如，血小板計數＜20,000/μl的患者當血小板計數增加到≥20,000/μl時，判為應答；血小板計數≥20,000/μl并有能指示出血的臨床癥狀的患者，當血小板計數總體增加10,000/μl或更多且癥狀消退時，判為應答。見George等“先天性血小板減少性紫癜由美國血液學公開的明確方法的實用指南(A Practice Guideline Developed by ExplicitMethods for The American of Hematology)”血液(Blood)883-40(1996)，其引入本文作為參考。
權利要求
1.治療哺乳動物自身免疫病的方法，包含給予哺乳動物有效治療量的與B細胞表面標志結合的拮抗劑。
2.權利要求1的方法，其中的B細胞表面標志選自CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86。
3.權利要求1的方法，其中的拮抗劑包含一種抗體。
4.權利要求3的方法，其中的抗體與CD20結合。
5.權利要求3的方法，其中的抗體與CD19結合。
6.權利要求1的方法，其中所述自身免疫病選自牛皮癬；皮炎；系統性硬皮病和硬化癥；相關于炎性腸疾病的應答；克羅恩氏病；潰瘍性結腸炎；呼吸窘迫綜合征；成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)；皮炎；腦脊膜炎；腦炎；色素膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏性疾病；濕疹；哮喘；涉及T細胞浸潤和慢性炎性應答的疾病；動脈粥樣硬化；白細胞粘附缺陷；類風濕性關節炎；系統性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病；多發性硬化癥；雷諾氏綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；斯耶格倫氏綜合征；幼年型糖尿病；與由細胞因子和T淋巴細胞介導的急性及遲發型超敏反應有關的免疫應答；結核；結節病；多肌炎；肉芽腫病；脈管炎；惡性貧血(阿狄森氏病)；與白細胞滲出有關的疾病；中樞神經系統(CNS)炎性病變；多器官損傷綜合征；溶血性貧血；重癥肌肌無力；抗原抗體復合物介導的疾病；抗腎小球基底膜疾病；抗磷脂綜合征；過敏性神經炎；格雷夫斯氏病；蘭-伊氏肌無力綜合征；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內分泌腺疾病；賴特爾氏病；全身肌強直綜合征；貝切特氏病；巨細胞性動脈炎；免疫復合物性腎炎；IgA腎病；IgM多發性神經炎；特發性血小板減少性紫癜(ITP)；和自身免疫性血小板減少癥。
7.權利要求1的方法，其中的哺乳動物是人。
8.權利要求3的方法，其中的抗體不與細胞毒制劑偶聯。
9.權利要求4的方法，其中的抗體包含rituximab(RITUXAN)。
10.權利要求3的方法，其中的抗體與細胞毒制劑偶聯。
11.權利要求10的方法，其中的細胞毒制劑是放射活性化合物。
12.權利要求11的方法，其中的抗體包含Y2B8或131I-B1(BEXXARTM)。
13.權利要求1的方法，其包括靜脈給予拮抗劑。
14.權利要求1的方法，其包括皮下給予拮抗劑。
15.權利要求3的方法，其包括給予哺乳動物實質上不足375mg/m2的抗體。
16.權利要求15的方法，其中的劑量為約20mg/m2到約250mg/m2。
17.權利要求16的方法，其中的劑量為約50mg/m2到約200mg/m2。
18.權利要求3的方法，其包括先以起始劑量給予抗體，接著以后續劑量給予抗體，其中后續給藥中所述抗體的mg/m2劑量超過起始給藥中所述抗體的mg/m2劑量。
19.權利要求6的方法，其中的自身免疫病是免疫性血小板減少性紫癜(ITP)。
20.權利要求6的方法，其中的自身免疫病是類風濕性關節炎。
21.權利要求6的方法，其中的自身免疫病是溶血性貧血。
22.權利要求21的方法，其中的溶血性貧血是冷球蛋白血癥或庫姆斯氏陽性貧血。
23.權利要求6的方法，其中的自身免疫病是脈管炎。
24.權利要求1的方法，其主要包括將所述拮抗劑給予哺乳動物。
25.一種制品，其包括一個容器及其中所含的組合物，還包括一種包裝插頁，所述組合物包含一種與B細胞表面標志結合的拮抗劑，所述插頁可指導用戶用所述組合物治療患有或易感自身免疫病的患者。
26.權利要求25的制品，其中的自身免疫病選自牛皮癬；皮炎；系統性硬皮病和硬化癥；相關于炎性腸疾病的應答；克羅恩氏病；潰瘍性結腸炎；呼吸窘迫綜合征；成人呼吸窘破綜合征(ARDS)；皮炎；腦脊膜炎；腦炎；色素膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏性疾病；濕疹；哮喘；涉及T細胞浸潤和慢性炎性應答的疾病；動脈粥樣硬化；白細胞粘附缺陷；類風濕性關節炎；系統性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病；多發性硬化癥；雷諾氏綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；斯耶格倫氏綜合征；幼年型糖尿病；與由細胞因子和T淋巴細胞介導的急性及遲發型超敏反應有關的免疫應答；結核；結節病；多肌炎；肉芽腫病；脈管炎；惡性貧血(阿狄森氏病)；與白細胞滲出有關的疾病；中樞神經系統(CNS)炎性病變；多器官損傷綜合征；溶血性貧血；重癥肌肌無力；抗原抗體復合物介導的疾病；抗腎小球基底膜疾病；抗磷脂綜合征；過敏性神經炎；格雷夫斯氏病；蘭-伊氏肌無力綜合征；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內分泌腺疾病；賴特爾氏病；全身肌強直綜合征；貝切特氏病；巨細胞性動脈炎；免疫復合物性腎炎；IgA腎病；IgM多發性神經炎；特發性血小板減少性紫癜(ITP)；和自身免疫性血小板減少癥。
全文摘要
本發明涉及用能與B細胞表面標志,如CD19或CD20結合的拮抗劑治療自身免疫病。
文檔編號A61P21/00GK1378459SQ00809834
公開日2002年11月6日 申請日期2000年5月4日 優先權日1999年5月7日
發明者約翰·G·柯德, 洛里·A·孔克爾, 安東尼奧·J·格里洛-洛佩斯 申請人:杰南技術公司, Idec醫藥公司