專利名稱：一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒的膜條的制備方法及其構成的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種診斷疾病的試劑盒，具體地，涉及一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒的膜條的制備方法及其構成的試劑盒。
背景技術：
自身免疫性肝病是一類病因不明的慢性進行性肝臟疾病，與自身免疫反應密切相關，早期臨床表現隱匿，難以與慢性病毒性肝炎區分，而這兩種疾病的治療方式有很大的不 同。若治療不當最終可發展為肝纖維化和肝硬化，只能通過肝移植延長患者生命。因此，自身免疫性肝病早期診斷和鑒別診斷是十分迫切和必要的。自身免疫性肝病都有特異性的抗體，是用于早期診斷和鑒別診斷疾病的重要的依據。常見的自身免疫性肝病有自身免疫性肝炎(AIH)，原發性膽汁性肝硬化(PBC)等。AIH的特征性的自身抗體有抗LKM-I、LC-I、SLA和F_actin的抗體；PBC的特異性的自身抗體有抗AMA/M2、gp210、SplOO的抗體。對于自身免疫疾病診斷方法多采用間接免疫熒光分析法(IFA)、酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫印跡，但各有其不足。間接免疫熒光分析法是檢測自身抗體的常用技術。其實驗基質一般是鼠肝片或猴肝片，含有完整的抗原譜，適合篩查試驗。但是有如下缺點不能作為確診依據；結果的判斷需要有豐富的經驗；滴度的意義大于核型，但滴度的判定主觀性強；靈敏度較低，特異性也不高。酶聯免疫吸附法(ELISA)具有靈敏度高，可作為篩選實驗，也可作為確診依據，還可定量測定，檢測病情和治療效果。但一次試驗只能檢測單一指標，通量低，檢測成本較高，在自身免疫疾病的診斷應用推廣方面存在著極大的局限性。Western blot (WB)是在凝膠電泳和免疫分析技術基礎上發展起來的一種免疫檢測技術，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性的優點，比較適合發現未知的抗體。而對于檢測已知的抗體，由于使用了天然的混合抗原，實驗過程中經常出現找不到目標條帶和條帶偏移的問題，給結果的判讀造成了不少困難，極易誤判和漏判。同時WB使用時間長，也不適合在臨床檢驗中推廣。有人將WB改進，直接將純化抗原包被于硝酸纖維素膜上，然后進行免疫反應檢測抗體，形成了改良的免疫印跡方法，但目前還沒有將該方法用于檢測自身免疫肝病的3種自身抗體的應用。對于現有的試劑盒，存在下述缺點
I、WB使用時間長，操作復雜。2、WB使用了天然的混合抗原，實驗過程中經常出現找不到目標條帶和條帶偏移的問題，給結果的判讀造成了不少困難，極易誤判和漏判。3、ELISA方法一次只能檢測一個項目，效率不高。4、IFA方法僅能進行篩查，不具有輔助診斷的意義。5、目前還沒有能同時檢測自身免疫肝病相關的7種自身抗體的改良免疫印跡方法。6、目前的試劑盒中，一般沒有對照線或者一個對照線只能作為一個檢測結果對照，沒有能夠同時 至少作為2個檢測結果對照的質控帶。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒的膜條的制備方法及其構成的試劑盒。采用該方法制備的膜條及具備該膜條的試劑盒，可以同時對兩個乃至更多的檢測條帶(檢測結果)起到對照判讀的作用。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒的膜條的制備方法，膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由AMA-M2、LKM-l、LC-l、SLA、F-actin、gp210和SplOO中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成，所述臨界質控帶的制備方法包括下述步驟1)選擇m個確診為陰性的新鮮血液標本作為樣本，膜條的抗原條帶中具有η個抗原，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將m個樣本中相同的抗原所檢測抗體的灰度值作為一組數值得到η組數值，分別計算這η組數值的平均值Mp、標準差SDp和各個抗原所檢測抗體的臨界質控值C0P，其中C0p=(Mp+2 X SDp),m、n、p均為自然數且m ^ 120,n ^ 2,n ^ p ^ I ； 2)將各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp進行處理，計算其平均值Μ、標準差SD、變異系數CV ;3)如CV ( 10%，則可得到膜條的臨界質控值CO，其中CO= (M+2XSD);如CV > 10%，調整印跡抗原量重復步驟I)、步驟2)重新測定，直至CV < 10% ;4)選擇確診為陽性的新鮮血液標本作為樣本，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將其與膜條的臨界質控值CO比較，如所有的樣本灰度值均不小于CO，則CO有效；如有一個或以上的樣本灰度值小于CO，需再次測定驗證；如仍有一個或以上的樣本灰度值小于CO，則調整印跡抗原量重復步驟I)、步驟2)、步驟3)重新確定膜條的臨界質控值CO ；5)根據確定的膜條的臨界質控值確定臨界質控帶包被人IgG的濃度。該方法中，功能質控線屬于現有技術，其目的是用于判斷該膜條的一次反應是否有效。步驟I)的陰性和步驟4)的陽性是指當具有這些抗原所能檢測的抗體時為陽性，不具有這些抗原所能檢測的抗體為陰性。本方案的膜條的每個抗原都彼此獨立地劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成一個獨立的抗原檢測線，這些所有的抗原檢測線統稱為抗原條帶，步驟I中的“取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值”，這里的灰度值為每一個抗原檢測線檢測樣品后掃描得到的灰度值。步驟5)中根據確定的膜條的臨界質控值，技術人員通過本領域的常規技術手段，可以得到合適的人IgG的濃度，采用現有的包被工藝，即可制備臨界質控帶，或者采用本發明下述的專用確定方式來確定。本方案的發明點可同時最多檢測自身免疫肝病相關的7種自身抗體，而且設置了一個可以同時對兩個乃至更多的檢測條帶(抗原條帶)起到判讀的臨界質控帶。隨著檢測條帶的增多，每增加一條被檢測條帶，都要對重新進行完整的臨界質控值確定實驗，同時實驗難度顯著加大。通常，確定一個臨界質控值需要許多次實驗，才能最終確定。具體地,步驟5)的具體步驟為將一定濃度的人IgG溶于Tris或Hepes緩沖液中，然后劃線于硝酸纖維素膜上制備成膜條，且膜條上僅包被臨界質控帶；隨機選取30個膜條檢測步驟I)的隨機陰性樣本，并掃描灰度，計算30次測定的均值Ms、標準差SDs和變異系數CVs，其中 CVs=Ms/SDs ;臨界質控帶合格的標準為1)0. 97XCO ^ Ms ^ I. 03XCO ；2)CVS <5%;如果不符合其中的任意一個，則需重新調整濃度后重復本步驟所有實驗，直至得到合格的臨界質控帶，此時的人IgG包被濃度即為臨界質控帶的包被濃度。一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，包括膜條、酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液，膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由AMA-M2、LKM-I、LC-I、SLA、F-actin、gp210和SplOO中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成；臨界質控帶同時為抗原條帶中的至少兩個抗原的對照條帶。所述臨界質控帶的成分為20ng 20y g/mL的人IgG。現有技術中有選用抗羊IgG作為對照線的記載，如CN200810132304. 8中，但是該專利中的每一個抗原條帶上都需要劃一個抗羊IgG的對照線，這樣制作工藝比較比較繁瑣，而且成本較高，在CN200810132304. 8中，沒有關于同一對照線可以用于2個或者2個以上的抗原條帶判讀的記載。本發明通過 創造性實驗發現，選擇一定濃度范圍的人IgG作為臨界質控帶，可以清楚、準確的對2個或者2個以上的抗原條帶進行判讀。作為進一步的優選,所述臨界質控帶的成分為200ng 2y g/mL的人IgG。所述底物為質量百分比濃度為O. 02%-2%的魯米諾或質量百分比濃度為
O.002%-0. 2%的過氧化氫構成的單一試劑。所述抗原條帶相互平行并且每個抗原條帶寬度均一，各相鄰抗原條帶之間間隔等寬。所述抗原條帶寬度為O.相鄰抗原條帶之間間隔為2mm-20mm。所述自身免疫肝病疾病包括自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化。所述SplOO、gp210、F-actin、LC-I和SLA由昆蟲細胞sf9表達并純化制得；所述AMA-M2是從天然組織中提取制得；所述LKM-I是人工合成的多妝
與現有技術相比較，本發明的有益效果是
I、可同時檢測自身免疫肝病相關的7種自身抗體，并可作為輔助診斷的依據。2、本發明具有獨創性的臨界質控帶，一個臨界質控帶可以同時對兩個乃至更多的檢測條帶(抗原條帶)起到判讀的作用，將顯色條帶與臨界質控帶的顏色的深淺比較即可判斷結果陽性顏色比臨界質控帶相同或深；陰性顏色比臨界質控帶淺。3、本發明還改良了單試劑底物，加入底物后不需終止。4、每個抗原條帶寬度均一，條帶間隔等寬，膜條背景干凈，使結果判定更加簡單可
O
圖I是本發明膜條的結構示意 圖2是臨界質控值確定流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述，但本發明的實施方式不僅限于下述實施例。實施例I :
參見圖I至圖2所示，圖2中的CO質控線即為臨界質控帶；本實施例的檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒包括膜條、酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液，其中酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液的選擇都屬于現有技術，對于酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液而言，選用現有技術的產品也可以實現本發明的技術方案。膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由AMA-M2、LKM-l、LC-l、SLA、F-actin、gp210和SplOO中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成，本實施例的臨界質控帶的成分為20ng 20y g/mL的人IgG。 本試劑盒創造性的加入了能同時最多對7個被檢抗體(抗原條帶)進行陰陽性判定的臨界質控帶。具體的流程見圖2的流程圖所示。臨界質控帶的臨界質控值確定方法包括下述步驟
1)選擇m個確診為陰性的新鮮血液標本作為樣本，膜條的抗原條帶中具有η個抗原，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將m個樣本中相同的抗原所檢測抗體的灰度值作為一組數值得到η組數值，分別計算這η組數值的平均值Mp、標準差SDp和各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp，其中COp= (MP+2XSDP), m、η、P均為自然數且m彡120，η彡2，η彡ρ彡I ;
2)將各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp進行處理，計算其平均值Μ、標準差SD、變異系數CV ；
3)如CV( 10%，則可得到膜條的臨界質控值CO，其中CO= (M+2XSD);如CV > 10%，調整印跡抗原量重復步驟I)、步驟2)重新測定，直至CV ^ 10% ；
4)選擇確診為陽性的新鮮血液標本作為樣本，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將其與膜條的臨界質控值CO比較，如所有的樣本灰度值均不小于CO，則CO有效；如有一個或以上的樣本灰度值小于CO，需再次測定驗證；如仍有一個或以上的樣本灰度值小于CO，則調整印跡抗原量重復步驟I)、步驟2)、步驟3)重新確定膜條的臨界質控值CO ；
5)根據確定的膜條的臨界質控值確定臨界質控帶包被人IgG的濃度。總的來說，臨界質控值的確定有兩個關鍵點，第一是7個條帶的灰度上限的CV不能超過10%，否則需要重新調整相應抗原的印跡濃度后再進行實驗。第二是用陽性樣本來驗證臨界質控帶，如果兩次實驗某個樣本的灰度都小于臨界質控值，那么需要重新做整個實驗。并且隨著檢測條帶的增多，每增加一條被檢測條帶，都要對重新進行完整的臨界質控值確定實驗，同時實驗難度顯著加大。通常，確定一個臨界質控值需要許多次實驗，才能最終確定。實施例2
本實施例是對由ΑΜΑ-Μ2、LKM-ULC-U SLA、F-actin、gp210和SplOO這7個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成的抗原條帶進行試驗測定。在實施例I的基礎上，為了使結果判定更加簡單可靠，將每個抗原條帶寬度均一設置，條帶間隔等寬，抗原條帶寬度為O.相鄰抗原條帶之間間隔為2mm-20mm,膜條背景干凈,并且采用改良的單試
劑底物，加入底物后不需終止，底物為魯米諾O. 02%-2%或過氧化氫O. 002%-0. 2%構成的單一試劑；所有的印跡抗原都是高度純化的，且采用了國際最新的包被工藝，具體包被方法見后述。臨界質控值的確定
I)確定各抗體的臨界質控值
隨機選取臨床確診為陰性的新鮮血清、血漿標本122份，用本實施例的試劑盒檢測。測定其抗原條帶所檢測的相應抗體的灰度值，計算122份標本中各相同抗體的灰度值均值Mp和標準差SDp，可得到每個抗體95%的置信上限(MP+2XSDP)，即為各抗體的臨界質控值，記作C0P。結果見下表,本實施例m=122, n=p=3。
權利要求
1.一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒的膜條的制備方法，其特征在于，膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由AMA-M2、LKM-I、LC-I、SLA、F_actin、gp210和SplOO中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成，所述臨界質控帶的制備方法包括下述步驟 1)選擇m個確診為陰性的新鮮血液標本作為樣本，膜條的抗原條帶中具有η個抗原，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將m個樣本中相同的抗原所檢測抗體的灰度值作為一組數值得到η組數值，分別計算這η組數值的平均值Mp、標準差SDp和各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp，其中COp= (MP+2XSDP), m、η、P均為自然數且m彡120，η彡2，η彡ρ彡I ; 2)將各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp進行處理，計算其平均值Μ、標準差SD、變異系數CV ； 3)如CV( 10%，則可得到膜條的臨界質控值CO，其中CO= (M+2XSD);如CV > 10%，調整印跡抗原量重復步驟I)、步驟2)重新測定，直至CV ^ 10% ； 4)選擇確診為陽性的新鮮血液標本作為樣本，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將其與膜條的臨界質控值CO比較，如所有的樣本灰度值均不小于CO，則CO有效；如有一個或以上的樣本灰度值小于CO，需再次測定驗證；如仍有一個或以上的樣本灰度值小于CO，則調整印跡抗原量重復步驟I)、步驟2)、步驟3)重新確定膜條的臨界質控值CO ； 5)根據確定的膜條的臨界質控值確定臨界質控帶包被人IgG的濃度。
2.根據權利要求I所述的一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒的膜條的制備方法，其特征在于，步驟5)的具體步驟為將一定濃度的人IgG溶于Tris或Ifepes緩沖液中，然后劃線于硝酸纖維素膜上制備成膜條，且膜條上僅包被臨界質控帶；隨機選取30個膜條檢測步驟I)的隨機陰性樣本，并掃描灰度，計算30次測定的均值Ms、標準差SDs和變異系數CVS，其中CVs=Ms/SDs ;臨界質控帶合格的標準為1)0.97XC0 ^ Ms ^ 1.03XC0 ；2)CVs < 5%;如果不符合其中的任意一個，則需重新調整濃度后重復本步驟所有實驗，直至得到合格的臨界質控帶，此時的人IgG包被濃度即為臨界質控帶的包被濃度。
3.—種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，其特征在于，包括膜條、酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液，膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由AMA-M2、LKM-I、LC-I、SLA、F-actin、gp210和SplOO中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成；臨界質控帶同時為抗原條帶中的至少兩個抗原的對照條帶。
4.根據權利要求3所述的一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，其特征在于，所述臨界質控帶的成分為20ng 20y g/mL的人IgG。
5.根據權利要求4所述的檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，其特征在于，所述臨界質控帶的成分為200ng 2y g/mL的人IgG。
6.根據權利要求3至5任一項所述的一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，其特征在于，所述底物為質量百分比濃度為O. 02%-2%的魯米諾或質量百分比濃度為O.002%-0. 2%的過氧化氫構成的單一試劑。
7.根據權利要求3至5任一項所述的一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，其特征在于，所述抗原條帶相互平行并且每個抗原條帶寬度均一，各相鄰抗原條帶之間間隔等寬。
8.根據權利要求7所述的一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，其特征在于，所述抗原條帶寬度為O.相鄰抗原條帶之間間隔為2mm-20mm。
9.根據權利要求3至5任一項所述的一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，其特征在于，所述自身免疫肝病疾病包括自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化。
10.根據權利要求3至5任一項所述的一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒，其特征在于，所述Spl00、gp210、F-actin、LC-l和SLA由昆蟲細胞sf9表達并純化制得；所述AMA-M2是從天然組織中提取制得；所述LKM-I是人工合成的多肽。
全文摘要
本發明涉及一種檢測自身免疫肝病相關自身抗體譜的試劑盒的膜條的制備方法及其構成的試劑盒。該膜條的制備方法及該試劑盒中，膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由AMA-M2、LKM-1、LC-1、SLA、F-actin、gp210和Sp100中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成。本發明具有獨創性的臨界質控帶，一個臨界質控帶可以同時對兩個乃至更多的檢測條帶(抗原條帶)起到判讀的作用，結果判定更加簡單可靠。
文檔編號G01N33/531GK102937650SQ201210455868
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者李想, 周帥, 何濤濤, 陳洪, 鄭麗, 陳衛, 陳川 申請人:四川省新成生物科技有限責任公司