具有甲脒修飾的單環堿基的核苷類似物的制作方法

專利名稱：具有甲脒修飾的單環堿基的核苷類似物的制作方法
本申請要求于2000年2月15日申請的美國臨時申請第60/182676號、于2000年6月16日申請的美國發明專利申請(utility application)順序號09/595365的優先權，所述每個專利申請的全部內容通過引用結合到本文中。
哺乳動物的免疫系統有兩大類淋巴細胞B淋巴細胞(B細胞)，它們起源于骨髓；和T淋巴細胞(T細胞)，它們起源于胸腺。B細胞主要負責體液免疫(即抗體產生)，而T細胞主要負責細胞介導免疫。
一般認為T細胞分為兩個亞類輔助T細胞和細胞毒性T細胞。輔助T細胞通過釋放參與細胞介導免疫的稱為細胞因子的可溶性蛋白介質，激活其它淋巴細胞，包括B細胞和細胞毒性T細胞和巨噬細胞。本文所用的淋巴因子是一個細胞因子亞類。
一般認為，輔助T細胞也分類兩個亞類-1型和2型。1型細胞產生白介素-2(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNFα)和干擾素γ(IFNγ)，主要負責細胞介導免疫，例如遲發型過敏反應和抗病毒免疫。相反，2型細胞產生白介素IL4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，主要涉及輔助體液免疫應答，例如在對變應原的應答中所觀察到的，例如IgE和IgG4抗體同種型轉換(Mosmann，1989，Annu Rev Immunol，7145-173)。
本文所用的術語1型和2型“應答”是指包括分別由于1型和2型淋巴細胞的誘導所引起的整個效應范圍。其中，這類應答包括通過轉錄、翻譯、分泌和可能的其它機制引起的相應細胞因子產生的變化、相應淋巴細胞增殖增加、和與細胞因子產生增加相關的其它效應，包括運動性效應。
先前的申請(09/462714、09/291097、09/291093、09/471513、60/164365、60/164366、60/172097、60/175111)(每個申請通過引用結合到本文中)涉及我們最近發現的多個方面，包括各種核苷(在本文中限定，以包括天然核苷的衍生物和類似物)對選擇性調節相互之間相對的淋巴細胞應答的影響。其中，我們已經表明，1型和2型應答中任一種應答都可以被選擇性地抑制，而另一種應答或者被誘導，或者保持相對不受影響，并且可以選擇性地誘導或者1型或者2型應答，而另一種應答或者受抑制，或者保持相對不受影響。我們也發現了令人驚訝的事實有效地相對選擇性地調節相互之間相對的1型和2型應答的某些核苷往往具有雙模式效應(bimodal effect)。其中，往往在相對高劑量下一般抑制或誘導1型和2型兩者活性的某些核苷，往往在相對低的劑量下有效地相互之間相對地調節1型和2型。
已經表明ViramidineTM(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲脒鹽酸鹽)在10種不同病毒中有相當于利巴韋林的活性。(J.T.Witkowski，R.K.Robins，G.P.Khare，R.W.Sidwell，J.Med.Chem.，16，935-937，1973；R.W.Sidwell，J.H.Huffman，D.L.Barnard，D.Y.Pifat，Antiviral Research，10，193-208，1988，B.Gabrielsen，M.J.Phelan，L.Barthel-Rosa，C.參見J.W.Huggins，D.F.Kefauver，T.P.Monath，M.A.Ussery，G.N.Chmurny，E.M.Schubert，K.Upadhya，C.Kwong，D.A.Carter，J.A.Secrist III，J.J.Kirsi，W.M.Shannon，R.W.Sidwell，G.D.Kini，R.K.Robins，J.Med.Chem.，35，3231-3238，1992)。另外，ViramidineTM像利巴韋林一樣，是一種IMP脫氫酶的抑制劑(R.C.Willis，R.K.Robins，J.E.Seegmiller，Molecular Pharmacology，18，287-295，1980)。而且，初步的毒理學研究提示，ViramidineTM的毒性低于利巴韋林(D.Y.Pifat，R.W.Sidwell，P.G.Canonico，Antiviral Research，9，136，1988)。另外，我們實驗室最近的研究(R.Tam.K.Ramasamy，ICN Pharmaceuticals，Inc.，未發表的結果，1999)表明，ViramidineTM和利巴韋林表現出相似的免疫調節特性。這些結果與生物利用度低和利巴韋林相關的毒性結合，促使我們不僅開發了用于其它病毒性疾病的ViramidineTM，而且制備了ViramidineTM的其它衍生物，包括ViramidineTM前體藥物的合成，并且篩選作為潛在抗病毒藥的化合物。
對于其它核苷類似物化合物對選擇性地調節相互之間相對的淋巴細胞應答的影響，先前尚未進行研究或有記載。我們發現了，在給予其它核苷類似物化合物(例如所述化合物的前體藥物形式)之后，也發生1型和2型應答的雙模式效應或者相互之間相對的選擇性調節。
在使生物活性化合物發展為臨床有用藥物的過程中，有許多障礙有待克服。許多有效的生物活性化合物從未成為臨床有用藥物，因為它們有不合要求的生物藥物特性，包括由于通過生物屏障(例如血腦屏障(BBB)和腸屏障)的通透性低所致的生物利用度低。雖然許多因素影響藥物的生物利用度，但許多藥物的不合要求的物理化學特性(例如電荷、親脂性、形成氫鍵的潛能、大小)可能是阻礙藥物透過生物屏障的最常見的因素之一。因此，對藥物的物理化學特性(電荷、親脂性、形成氫鍵的潛能、大小)進行優化，可能是促進藥物轉運通過這類膜屏障的最為可能的通用策略。
為了優化藥物的物理化學特性，一種可能的策略是前體藥物策略。(H.Bundgaard，Design of Prodrugs，Elsevier，Amsterdam，1985；N.Bodor，L.Prokai，W.M.Wu，H.Farag，S.Jonhalagadda，M.Kawamura，J.Simpkins，Science，257，1698-1700，1992；H.E.Taylor，K.B.Sloan，J.Pharm.Sci.，87，5-20，1998)。術語前體藥物用來描述一種藥物，所述藥物在給藥后必須經歷化學轉化或酶促轉化成為活性藥物或母體藥物，使得所述代謝產物或母體藥物隨后可以表現出所需的藥理學反應。通過將小有機分子中的某些極性官能團暫時生物可逆地衍生化，這些基團的不合要求的物理化學特性(例如電荷、形成氫鍵的潛能)被“掩蔽”，而不會永久性地改變所述分子的藥理學特性。這種策略已經非常成功地用于前體藥物的衍生化涉及將羧基或羥基官能團轉化為酯的情況下，所述酯在體內可以容易地或者化學水解，或者酶促水解。這種有前景的前體藥物概念，我們預期在母體藥物中引入其它部分，將提高生物利用度、吸收和抗病毒效應。
盡管存在尚未確定的機制，但我們已經發現，許多潛在益處可能來源于對1型和2型應答相互之間的選擇性調節。我們已經推斷，例如，相對于2型而言對1型進行特異性調節，可能可用于治療種類繁多的病癥和疾病，范圍從感染、侵染、腫瘤和過敏反應至自身免疫病。
這些發現尤為重要，因為現代對于許多以上所列疾病的治療策略的效力有限、副作用顯著或這兩者都有。例如自身免疫病的治療常常限于緩解措施、消除有毒抗體(如在重癥肌無力中)和給予有害的藥物包括皮質類固醇、氯喹衍生物和抗代謝藥或抗腫瘤藥以及靶向免疫系統細胞的藥物例如環孢菌素。
在本發明的一方面，提供式1的核苷類似物化合物 式1-ViramidineTM(ICN3142)在本發明的另一方面，一種藥用組合物包含與至少一種藥學上可接受的載體混合的治療有效量的式1的甲脒或其藥學上可接受的酯或鹽。
在本發明的再一方面，一種藥用組合物包含與至少一種藥學上可接受的載體混合的式1甲脒的前體藥物形式或其藥學上可接受的酯或鹽。
在本發明的又一方面，式1化合物用于治療對按照達到陽性反應的任何配方和方案給予所述化合物有所述陽性反應的任何病癥。其中，考慮了可以用式1化合物治療感染、侵染、癌癥、腫瘤或其它贅生物、巨細胞性動脈炎或自身免疫病。
圖2圖示了所考慮化合物和其它化合物對SEB活化人T細胞中1型細胞因子合成的影響。
圖3圖示了0.625-10μM濃度的所考慮化合物對SEB活化人T細胞中1型細胞因子合成的影響。
圖4圖示了所考慮化合物對BALB/c小鼠體內CHS應答的影響。
圖5圖示了所考慮化合物和其它化合物對SEB活化人T細胞中1型細胞因子合成的峰反應和峰范圍。
詳細描述當以下術語用于本說明書時，它們按如下定義使用。
術語“核苷”和“核苷類似物化合物”可互換使用，是指包含連接于雜環、芳族雜環的特定位置或者連接于嘌呤(9位)或嘧啶(1位)的天然位置或者連接于類似物的等同位置的任何戊糖或修飾戊糖部分的化合物。
術語“核苷酸”是指在核苷的5’位上取代的磷酸酯。
術語“雜環”是指環中具有至少一個雜原子(例如N、O或S)的單價飽和或不飽和碳環基團，雜環中的每個可利用的位置可以任選獨立地被例如羥基、氧代基、氨基、亞氨基、低級烷基、溴、氯和/或氰基取代。在該類取代基中包括嘌呤和嘧啶。
術語“嘌呤”是指含氮二環雜環。
術語“嘧啶”是指含氮單環雜環。
術語“D-核苷”是指具有D-核糖糖部分的核苷化合物(例如腺苷)。
術語“L-核苷”是指具有L-核糖糖部分的核苷化合物。
術語“L-構型”和“D-構型”在本發明中用來描述所述化合物中與所述分子的吡咯并-嘧啶酮部分連接的呋喃核糖基部分的化學構型。
術語“C-核苷”在本說明書中用來描述核糖糖部分和雜環堿基之間形成的鍵合類型。在C-核苷中，所述鍵合起源于核糖糖部分的C-1位，并且連接雜環堿基的碳。在C-核苷中形成的所述鍵合是碳-碳型。
術語“N-核苷”在本說明書中用來描述核糖糖部分和雜環堿基之間形成的鍵合類型。在N-核苷中，所述鍵合起源于核糖糖部分的C-1位，并且連接雜環堿基的氮。在N-核苷中形成的所述鍵合是碳-氮型。
術語“保護基”是指加入至氧原子或氮原子、防止所述氧原子或氮原子在所述氧或氮所在的分子中的其它部分衍生化過程中進一步反應的化學基團。種類繁多的氧和氮的保護基是有機合成領域的技術人員已知的。
術語“低級烷基”是指甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基或正己基。該術語的其它實例有具有1-6個碳原子的環狀、支鏈或直鏈基團。
術語“芳基”是指具有一個單環(例如苯基)或兩個稠環(例如萘基)的單價不飽和芳族碳環基團，它可以任選地被羥基、低級烷基、氯和/或氰基取代。
術語“雜環”是指環內具有至少一個雜原子(例如N、O、S、Se或P)的單價飽和或不飽和碳環基團，其每個可利用的位置可以任選地獨立地被羥基、氧代基、氨基、亞氨基、低級烷基、溴、氯和/或氰基取代或是未取代的。
術語“單環”是指環內具有至少一個雜原子(例如N、O、S、Se或P)的單價飽和碳環基團，其每個可利用的位置可以任選地獨立地被糖部分或任何其它基團(如溴、氯和/或氰基)取代，使得所述單環環系最終被芳香化[例如胸苷]。
術語“免疫調節劑”和“調節劑”在本文中可互換使用，是指能夠通過刺激或抑制改變正常或異常的免疫系統的天然或合成產物。
術語“有效量”是指式(1)化合物使免疫功能恢復至正常水平、或者將免疫功能提高至正常水平以上以消除感染的量。
式1化合物可能具有多個不對稱中心。因此，它們可以以或者旋光形式或者作為外消旋混合物制備。所描述的和要求保護的本發明范圍包括式1化合物的單個的旋光異構體及其非外消旋混合物以及外消旋形式。
術語“α”和“β”是指所示化學結構中不對稱碳原子上取代基的特定立體化學構型。
術語“對映體”是指相互之間為非重疊鏡像的一對立體異構體。以1∶1比率的一對對映體的混合物是“外消旋”混合物。
術語“異構體”是指具有相同化學式的不同化合物。“立體異構體”是僅在所述原子在空間排列的方式上不同的異構體。
“藥學上可接受的鹽”可以是由無機和有機酸或堿衍生的任何鹽。化合物本發明的核苷類似物化合物一般用式1來描述 式1-ViramidineTM(ICN3142)其中該化合物的化學構型為L-構型或D-構型。所考慮化合物(此處ViramidineTM)的示例性合成可以按照以下概述和示于

圖1的方案進行。
3-氰基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑(7)將3-氰基-1，2，4-三唑(18.8g，200mmol)(6)、1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-D-呋喃核苷(63.66g，200mmol)和雙(對硝基苯基)磷酸酯(1g)的混合物置于RB燒瓶(500ml)中。將燒瓶置于水泵真空下預熱的165-175℃油浴中，同時將其攪拌25分鐘。被置換的乙酸收集于置于水泵和RB燒瓶之間的冰阱中。從油浴取出燒瓶并讓其冷卻。當燒瓶的溫度大致達到60-70℃時，加入EtOAc(300ml)和飽和NaHCO3(150ml)，在EtOAc中萃取。水層再用EtOAc(200ml)萃取。合并的EtOAc萃取液依次用飽和NaHCO3(300ml)、水(200ml)和鹽水(150ml)洗滌。有機萃取液經無水硫酸鈉干燥，過濾并將濾液蒸發至干。將殘余物溶于乙醚(100ml)中，在0℃冷卻12小時，得到無色晶體。將固體過濾，用最少量的冷EtOH(20ml)洗滌，并在高度真空下經固體NaOH干燥。產量56.4g(80％)。mp96-97℃。1HMR(CDCl3)δ2.11(s，3H，COCH3)，2.13(s，3H，COCH3)，2.14(s，3H，COCH3)，4.22(dd，1H)，4.46(m，2H)，5.52(t，1H，J＝6.0Hz)，5.70(m，1H)，6.01(d，1H，C1’H J＝3.6Hz)和8.39(s，1H，C5H)。C14H16N4O7(352.30)的分析計算值C，47.73；H，4.58；N，15.90。實測值C，47.70；H，4.63；N，16.01。
1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲脒(ViramidineTM)鹽酸鹽(8)將(7)(14.08g，40.0mmol)、NH4Cl(2.14g，40.0mmol)和無水氨(150ml)的混合物在鋼制反應釜中于85℃加熱18小時。將鋼制反應釜冷卻，打開，將內容物蒸發至干。殘余物從MeCN-EtOH中結晶，得到10.6g(95％)的8。Mp177-179℃。1HMR(DMSO-d6)δ3.44-4.2(m，3H)，4.40(m，2H)，5.04(t，1H)，5.29(m，1H)，5.74(m，1H)，5.87(d，1H，C1’H)，8.96(bs，3H)和9.17(s，1H，C5H)。C8H14ClN5O4(279.68)的分析計算值C，34.35；H，5.05；N，25.04；Cl，12.69。實測值C，34.39；H，5.10；N，25.14；Cl，12.71。
或者，可以如下由市售的RibavirinTM進行合成2’，3’，5’-三-O-乙酰基-1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(9)。將1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(RibavirinTM)(28.4g，116.4mmol)(5)的乙酸酐(200ml)和吡啶(50ml)懸浮液于室溫攪拌過夜。將所得的澄清溶液真空濃縮，得到透明的泡沫狀物(43.1g，定量的)。該泡沫狀物在TLC上為均一的，無需純化而直接用于下一步中。將少量經快速色譜純化，得到分析級樣品；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ2.01，2.08，2.09(3s，9H，COCH3)，4.10(m，1H)，3.52(m，2H)，5.58(t，1H)，5.66(m，1H)；6.33(d，.1H，J.＝3.0Hz，C1H)，7.73，7.92，(2s，2H，CONH2)，8.86(s，1H，C5H三唑)。(C10H18N4O8)的分析值C，H，N。
3-氰基-2’，3’，5’-三-O-乙酰基-1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑(10)。向9(43.1g，116.4mmol)的氯仿(500ml)溶液中加入三乙胺(244ml)，將混合物在冰-鹽浴中冷卻至0℃。在攪拌下滴加三氯氧化磷(30.7ml，330mmol)，將溶液溫熱至室溫。將混合物于室溫攪拌1小時后，TLC(己烷/丙酮3∶1)顯示原料完全消失。將褐色反應混合物真空濃縮至干，殘余物溶于氯仿(500ml)中。該有機溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液(3×200ml)洗滌，經無水硫酸鈉干燥并真空濃縮。殘余物經硅膠色譜(快速色譜)，用20％丙酮的己烷溶液洗脫，得到33.14g(從利巴韋林計81％)的純10，為非晶形固體。該固體在所有方面與真實樣品相同mp101-103℃；IR(溴化鉀)ν2250(CN)，1750(C＝O)，cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ2.04，2.06，2.07(3s，9H，乙酰基甲基)，4.15(dd，1H)，4.40(m，1H)，5.47(t，1H)，5.63(dd，1H)，5.95(d，1H，J＝3.2Hz，C1H)，8.34(s，1H，C5H三唑)。
1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲脒鹽酸鹽(8)向10(4.0g，11.4mmol)的甲醇(100ml)懸浮液中加入1摩爾濃度的甲醇鈉甲醇溶液(12ml)，將混合物于室溫攪拌過夜。溶液用甲醇洗滌的Dowex H+樹脂酸化至pH4，將樹脂過濾，將濾液真空濃縮至干。將殘余物溶于最少量的甲醇(15ml)中，轉移至耐壓瓶中。加入氯化銨(0.61g，11.4mmol)和于0℃用干燥氨氣飽和的甲醇溶液(75ml)，將瓶密封，溶液于室溫攪拌過夜。將溶液真空濃縮至干，所得的殘余物從乙腈/乙醇中結晶，得到8，為晶狀固體(2.95g，93％)。該樣品在所有方面與真實樣品相同。
在某些藥物劑型中，優選所述化合物的前體藥物形式，尤其包括本發明化合物的酰化(乙酰化或其它)衍生物、吡啶酯和各種鹽形式，在治療患者病癥的方法中，可以給予所述前體藥物形式。本領域技術人員知道如何容易地將本發明化合物修飾為前體藥物形式，以有助于將活性化合物傳遞至宿主生物或患者的靶部位。合適時，本領域技術人員也會利用所述前體藥物形式的適宜藥代動力學參數，以將本發明化合物傳遞至宿主生物或患者的靶部位中，以使所述化合物的目的效應最大化。
本文所公開化合物的前體藥物形式的所考慮的生成的實施例如下。ViramidineTM的最簡單的前體藥物之一是ViramidineTM的三-O-乙酰基衍生物。所述三-O-乙酰基衍生物如流程1中的描述制備 流程1ViramidineTM的5’-視黃酰基衍生物是另一種簡單的前體藥物形式，如下制備 流程2ViramidineTM的其它5’-衍生物包括流程3中所示的以下衍生物 流程3這些化合物中的大多數化合物可以如已描述的方法獲得(C.Sergheraert，C.Pierlot，A.Tartar，Y.Henin，M.Lemaitre，J.Med.Chem.，36，826-830，1993)。
ViramidineTM的基于香豆素的前體藥物形式的合成可以如下獲得 流程4認為氨基酸酯是更好的前體藥物形式，因為它們可能涉及立體選擇性轉運蛋白。ViramidineTM的氨基酸衍生物可以如下所示合成 流程5為了將藥物特異性地傳遞至肝和膽汁系統，內源膽汁酸轉運系統是有吸引力的候選者。ViramidineTM的膽汁酸綴合物的合成可以如下所示完成核苷酸衍生物是另一類前體藥物或前體藥物形式。被護5’-一磷酸酯衍生物的制備示于下文。通過用中性取代基保護帶負電荷的磷酸根，可能形成親脂性更強的衍生物，預期所述衍生物在細胞中后，立即恢復為相應的一磷酸酯。 流程6
核苷酸衍生物是另一類前體藥物或前體藥物形式。被護5’-一磷酸酯衍生物的制備示于下文。通過用中性取代基保護帶負電荷的磷酸根，可能形成親脂性更強的衍生物，預期所述衍生物在細胞中后，立即恢復為相應的一磷酸酯。 流程7其中R1是烷基，例如CH3C(O)S-CH2CH2-；(CH3)2CHC(O)S-CH2CH2-；(CH3)3CC(O)S-CH2CH2-；(CH3)3CC(O)OCH2-；C6H5C(O)S-CH2CH2-或HOCH2CH2SS-CH2CH2-。
氨基酸氨基磷酸酯是另一類前體藥物，可以如下所示合成 流程8R＝氫以外的任何基團以下顯示一磷酸酯前體藥物的其它衍生物 流程8AViramidineTM的基于水楊酸的前體藥物可以按照以下流程獲得 流程9核苷5’-二磷酸酯或三磷酸酯的前體藥物可能更有價值，因為它們可能繞過更多的代謝步驟。
以下是潛在的核苷酸親脂性前體藥物，如下所示制備 流程10 流程11以下是ViramidineTM的另一類潛在膦酸酯前體藥物 流程12其它可能的前體藥物包括PCT專利申請WO 98/39342、WO98/39343、WO 98/39344和WO 99/45016中所示的基團的可能組合。
ViramidineTM的前體藥物不僅可以通過修飾母體分子的糖部分而獲得，而且也可以通過將脒官能團衍生化來獲得。以下是少數類別的可以如下所述通過修飾脒基團制備的前體藥物 流程13 流程14 流程15 流程16R＝CH3-R＝苯基R＝R1-S-S-Ph-且R1＝烷基、脂質、維生素、膽汁酸、膽固醇衍生物應用考慮了式1化合物可以用來治療各種各樣的病癥，事實上可以用來治療對給予一種或多種所述化合物有陽性反應的任何病癥。其中尤其考慮了本發明化合物可以用來治療感染、侵染、癌癥或腫瘤或自身免疫病。還考慮了本發明化合物可以用來靶向患者特定器官(例如肝或心臟)的病癥或疾病。
考慮用本發明化合物治療的感染包括呼吸道合胞病毒(RSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、1型和2型單純皰疹、生殖器皰疹、皰疹性角膜炎、皰疹性腦炎、帶狀皰疹、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型流感病毒、漢坦病毒(出血熱)、人乳頭瘤病毒(HPV)、麻疹和真菌。
考慮用本發明化合物治療的侵染包括原生動物侵染以及蠕蟲和其它寄生物侵染。
考慮治療的癌癥或腫瘤包括由病毒引起的癌癥或腫瘤，并且所述效應可以包括抑制受病毒感染的細胞轉化為腫瘤狀態、抑制病毒從轉化細胞傳播至其它正常細胞和/或阻滯病毒轉化細胞的生長。
考慮治療的自身免疫病和其它疾病包括關節炎、銀屑病、腸病、青少年糖尿病、狼瘡、多發性硬化、痛風和痛風性關節炎、類風濕性關節炎、移植排斥、巨細胞性動脈炎、變態反應和哮喘。
本發明化合物的其它考慮的應用包括用作其它核苷或核苷酸類似物化學合成的中間體，所述核苷或核苷酸類似物又可用作治療藥或用于其它目的。
再一方面，一種治療哺乳動物的方法包括給予治療和/或預防有效量的含本發明化合物的藥物。在該方面，所述效應可以涉及調節所述哺乳動物免疫系統的某一部分，尤其是調節1型和2型相互之間的淋巴因子分布型。在發生1型和2型淋巴因子的調節的情況下，尤其考慮了所述調節可以包括抑制1型和2型兩者，更優選刺激1型淋巴因子，或者1型應答相對于2型應答相對增加。
尤其考慮了，ViramidineTM(1.39μg/ml)增加(優選活化的)T淋巴細胞中1型細胞因子表達和合成，得自各種實驗的結果示于圖2-5中。圖2描繪了5μM ViramidineTM(一種式1化合物)、利巴韋林和levovirin對SEB活化的人T細胞(n＝5個供體)中1型細胞因子合成的影響，其中viramidine顯示出與使用三唑的對照相比，1型應答明顯增加。圖3圖示了0.625-10μM范圍內的Viramidine對SEB(葡萄球菌腸毒素B)活化的人T細胞中1型細胞因子合成的劑量-反應效應(數據代表4個單獨的供體)。在圖4中清楚地顯示出Viramidine在接觸性過敏反應(CHS)測定中1型應答增加的體內效應，而圖5顯示了Viramidine和Levovirin/利巴韋林之間在峰反應核苷濃度和反應的峰范圍方面的比較(y軸描繪特定實驗中的應答者數目)。
人T細胞的制備和體外活化通過密度梯度離心，然后用Lymphokwik(One Lambda，CanogaPark CA)進行T細胞富集，從健康供體或類風濕性關節炎患者中分離出外周血單核細胞。通過粘附于塑料上，除去污染的單核細胞。純化的T細胞＞99％CD2+、＜1％HLA-DR+和＜5％CD25+，在RPMI-AP5(含有20mM HEPES緩沖液pH7.4、5％自體血漿、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素和0.05％2-巰基乙醇的RPMI-1640培養基)中維持。
關于細胞因子蛋白水平的測定，通過加入10ng PMA+0.5μg離子霉素(兩者都得自Calbiochem，La Jolla，CA)活化T細胞(1×106細胞，體積為1ml)，在24孔板中在0-20μM核苷存在下于37℃和5％CO2下在潮濕的培養箱中孵育至多48小時。活化后，分析上清液的細胞來源的細胞因子產生。對于增殖和生存力研究，將上述方案修改為96孔板，使用0.2×106細胞，體積為0.2ml，用2ngPMA和0.1μg離子霉素活化。在單獨的實驗中，用20ngPMA+1μg離子霉素活化2ml中的5×106T細胞。或者，按照已發表的方法，可以在體外用SEB活化細胞。這里，在6-24小時孵育后，從T細胞中分離出總RNA，通過RT-PCR分析，以測定各種細胞因子和炎性介質的mRNA水平。也在單獨的實驗中，進一步純化人類T細胞(使用得自Stem CellTechnologies的細胞富集試劑，Vancouver，BC)，得到純群體CD4+(＜1％CD8+，采用RosetteSep人CD4+T細胞分離試劑)和CD8+(＜1％CD4+，采用RosetteSep人CD4+T細胞分離試劑)T細胞亞群，此后，在全部T細胞實驗中，用PMA和離子霉素活化1×106細胞/ml。胞外細胞因子分析在細胞上清液中，在適當稀釋后，用對IL-2、IFNg、TNFα、IL-4和IL-5特異性的ELISA試劑盒(Biosource International，Camarillo，CA)，測定人細胞因子水平。用對鼠類IFNg和IL-4特異性的ELISA試劑盒(R and D Systems，Minneapolis，MN)，測定鼠類細胞因子水平。所有的ELISA結果都以pg/ml表示。某些數據以活化對照的百分率顯示，以試驗核苷存在下活化T細胞的細胞因子水平與未經處理的活化T細胞的細胞因子水平之比×100％來計算。試驗核苷對細胞因子水平的零效應將給出100％的活化對照值的百分率。或者，數據以與活化對照的差異百分率([(試驗pg/ml-活化對照pg/ml)/活化對照pg/ml]×100％)顯示。試驗核苷對細胞因子水平的零效應將是0％。接觸性過敏反應(CHS)按照先前描述的方法(Ishii，N.，K.Takahashi，H.Nakajima，S.Tanaka，P.W.Askenase.1994.BALB/c和C3H/He小鼠中的DNFB接觸敏感性(CS)。J.Invest.Dermatol.102321)，在BALB/c小鼠中測定對接觸性變應原DNFB的反應性。簡而言之，通過應用20μl 0.3％DNFB的丙酮∶橄欖油4∶1溶液于首次用于實驗的小鼠已剃毛的腹部上，使小鼠致敏。對于CHS的最適誘發，致敏后5天，小鼠在每只耳朵的兩側用20μl 0.12％DNFB攻擊。也攻擊未經致敏的小鼠，將其用作每個試驗的對照。24小時后，測量耳部厚度，通過從攻擊前數值中減去攻擊后的數值，評價對DNFB的反應。表示時，通過在用DNFB攻擊時腹膜內注射，給予50μlPBS中6.2μg(0.3mg/k)或者100μlPBS中12.4μg(0.6mg/kg)劑量的7-β-D-呋喃核糖基-4-氧代吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-甲脒。這些劑量的7-β-D-呋喃核糖基-4-氧代吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-甲脒在初步優化研究中給出最大效應。在最后的耳部厚度測量后，通過頸椎脫臼處死小鼠，取出腋窩/腋側淋巴結。從分離的淋巴結細胞中分離總細胞RNA后，進行RT-PCR和DNA印跡分析，以檢測小鼠IFNg、IL-2和IL-10mRNA水平。進一步的實驗一般考慮到，免疫應答向1型應答偏移是合適的。因此，考慮到按照本發明主題的化合物可能尤其可用于治療病毒性疾病(優選用于其中1型應答減弱或受抑制的病毒感染)。為了證實調節免疫應答的效力，已經進行了各種實驗，以下是用所考慮化合物進行的某些實驗的示例性總結體外-Viramidine抑制LLC-MK2(恒河猴腎細胞)的Punta Toro病毒感染，EC50為8mg/ml(Adames品系)，12mg/ml(Balliet品系)-CC50為320mg/ml(1.0-1.2病毒評級)。
體內-皮下給予或口服給予viramidine導致皮下注射的PTV100％存活(10只C57BL/6只小鼠/gp)(Adames品系)。
對于PTV體內感染后24小時而言，對于皮下每日兩次給予5天的利巴韋林的最低有效皮下劑量為32mg/kg，對于viramidine而言為96mg/kg。對于PTV體內感染后24小時而言，對于每日口服兩次給予5天的利巴韋林的最低有效口服劑量為20mg/kg，對于viramidine而言為40mg/kg。
一般而言，按照本發明的最優選應用是所述活性化合物對于非靶宿主細胞的細胞毒性相對較低、而對于靶的活性相對較高的那些應用。在該方面，也可能有利的是，L-核苷的穩定性可能高于D-核苷，可能導致藥代動力學更優。這一結果可以達到，因為L-核苷可能不為酶所識別，因此可能半壽期更長。
考慮了，按照本發明的化合物將在任何合適的藥用制劑中、以任何合適的方案體內、體外或離體給予。因此，可以口服、胃腸外(包括皮下注射、靜脈內、肌內、通過胸骨內注射或輸注技術)、通過吸入噴霧或經直腸、局部等等、在含有常規無毒的藥學上可接受的載體、佐劑和溶媒的劑量單位制劑中進行給藥。
作為實例，考慮了按照本發明的化合物可以與藥學上可接受的載體混合配制。例如，本發明的化合物可以作為藥學上可接受的鹽口服給予。因為本發明的化合物通常是水溶性的，因而它們可以在生理鹽溶液(例如緩沖至pH約7.2-7.5)中靜脈內給予。常規的緩沖劑例如磷酸鹽、碳酸氫鹽或檸檬酸鹽可以用于此目的。當然，本領域技術人員可以在本說明書內容的范圍內修改所述制劑，以便在不使得本發明的組合物不穩定或損害其治療活性的情況下提供用于特定給藥途徑的多種制劑。具體地說，對本發明化合物進行修飾，以使其更溶于水或其它溶媒，例如可以通過本領域技術人員眾所周知的微小的修飾(鹽制劑、酯化等)容易地達到。本領域技術人員也熟知，為了控制本發明化合物的藥代動力學以在患者體內獲得最大有益效應，可改變特定化合物的給藥途徑和給藥方案。
另外，按照本發明的化合物可以單獨給予，獲得與用于治療上述感染或病癥的其它藥物聯合給予。按照本發明的聯合療法包括給予至少一種本發明化合物或其功能性衍生物和至少一種其它藥用有效成分。所述有效成分和藥用有效成分可以分開給予，或者一起給予，并且當分開給予時，這可以同時給予或以任何順序分開給予。選擇所述有效成分和藥用有效成分的量以及給藥的相對定時，以便達到所需的聯合治療效應。最好是，所述聯合療法包括給予一種本發明化合物或其生理功能性衍生物和一種下文提及的藥物。
考慮與按照式1的調節劑聯合有效的其它藥物或有效成分的實例是抗病毒藥，例如干擾素包括但不限于干擾素α和干擾素γ、利巴韋林、阿昔洛韋和AZTTM；抗真菌藥，例如托萘酯、FungizoneTM、LotriminTM、MycelexTM、制霉菌素和兩性霉素(Amphoteracin)；抗寄生蟲藥，例如MintezolTM、NiclocideTM、VermoxTM和FlagylTM；腸用藥物(bowel agents)，例如ImmodiumTM、LomotilTM和PhazymeTM；抗腫瘤藥，例如干擾素α和γ、AdriamycinTM、CytoxanTM、ImuranTM、氨甲蝶呤、MithracinTM、TiazofurinTM、TaxolTM；皮膚科用藥，例如AclovateTM、CyclocortTM、DenorexTM、FloroneTM、OxsoralenTM、煤焦油和水楊酸；偏頭痛制劑，例如麥角胺化合物；類固醇和以上未列出的免疫抑制藥，包括環孢菌素、DiprosoneTM、氫化可的松；FloronTM、LidexTM、去氧米松(Topicort)和倍他米松戊酸酯(Valisone)；和代謝藥物(metabolicagents)，例如胰島素；以及可能不能很好地符合以上類別的其它藥物，包括細胞因子如IL2、IL4、IL6、IL8、IL10和IL12。尤其優選的主要藥物是AZT、3TC、8-取代的鳥苷類似物、2，3-二脫氧核苷、白介素II、干擾素例如IαB-干擾素、托卡雷瑣、左旋咪唑、異丙肌苷和環木脂體。
這類其它治療藥的實例包括有效調節免疫系統或相關病癥的藥物，例如AZT、3TC、8-取代的鳥苷類似物、2’，3’-二脫氧核苷、白介素II、干擾素例如α-干擾素、托卡雷瑣、左旋咪唑、異丙肌苷和環木脂體。按照本發明的某些化合物可以通過降低其它化合物的代謝或使其失活而有效增強某些按照本發明的藥物的生物活性，因此可以共同給予以獲得這一目的效應。
對于劑量，本領域技術人員會認識到，治療有效量將隨待治療的感染或病癥、其嚴重程度、待使用的治療方案、所用藥物的藥代動力學以及所治療的患者(動物或人類)而變。考慮了各種可供選擇的劑量也是合適的，包括0.5mg/kg-0.1mg/kg的劑量和更低劑量，也包括0.5-1.0mg/kg的劑量和更高劑量。還考慮到，雖然對于某些病毒感染，在相對低血漿濃度的式1化合物下可以達到治療成功，但其它病毒感染可能需要相對高的劑量。然而，考慮到通過給予小劑量，然后將該量增加，直至副作用變得過分不利，或者達到計劃的效應為止，可發展合適的方案。
所述活性化合物的給予，其范圍可以從連續(靜脈內滴注)至每日數次口服(例如Q.I.D.)，給藥途徑其中可以包括口服、局部、胃腸外、肌內、靜脈內、皮下、經皮(可以包括滲透增強劑)、口腔含化和栓劑給予。
為了制備按照本發明的藥用組合物，最好將治療有效量的一種或多種按照本發明的化合物與藥學上可接受的載體按照常規藥物混合技術進行完全混合，產生一定的劑量。根據給藥所需的制劑形式(例如口服或胃腸外給藥)，載體可以采用各種各樣的形式。在制備口服劑型的藥用組合物中，可以使用任何通常的藥用介質。因此，對于液體口服制劑例如混懸劑、酏劑和溶液劑而言，可以使用合適的載體和添加劑，包括水、甘醇類、油類、醇類、矯味劑、防腐劑、著色劑等。對于固體口服制劑例如粉劑、片劑、膠囊劑以及對于例如栓劑的固體制劑而言，可以使用合適的載體和添加劑，包括淀粉、糖載體例如葡萄糖、甘露醇、乳糖和相關載體、稀釋劑、制粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。如果需要，可以將片劑或膠囊劑包腸衣，或通過標準技術緩釋。
對于胃腸外制劑，載體通常將包含無菌水或氯化鈉水溶液，雖然可以包括其它成分，包括有助于分散的成分。當然，當使用無菌水并保持無菌時，所述組合物和載體也必須滅菌。也可以制備注射用混懸劑，在這種情況下，可以使用合適的液體載體、懸浮劑等。
權利要求
1.一種治療患者病癥的方法，所述方法包括給予式1化合物 式1其中所述化合物為L-構型。
2.一種治療患者病癥的方法，所述方法包括給予式1化合物的前體藥物形式， 式1其中所述化合物為L-構型或D-構型。
3.權利要求1的方法，其中所述病癥選自HIV感染、HCV感染、HBV感染和人乳頭瘤病毒感染。
4.權利要求1的方法，其中所述病癥包括肝臟疾病。
5.權利要求1的方法，其中所述給藥的步驟在患者體內相對于2型應答而言提高1型應答。
6.權利要求1的方法，其中所述給藥的步驟包括口服給藥。
7.權利要求1的方法，其中所述給藥的步驟包括給予劑量在0.1mg/kg所述患者體重和1.0mg/kg所述患者體重之間的所述化合物。
8.權利要求2的方法，其中所述病癥選自HIV感染、HCV感染、HBV感染和人乳頭瘤病毒感染。
9.權利要求2的方法，其中所述病癥包括肝臟疾病。
10.權利要求2的方法，其中所述給藥的步驟在患者體內相對于2型應答而言提高1型應答。
11.權利要求2的方法，其中所述給藥的步驟包括口服給藥。
12.權利要求2的方法，其中所述給藥的步驟包括給予劑量在0.1mg/kg所述患者體重和1.0mg/kg所述患者體重之間的所述化合物。
全文摘要
公開了新型核苷類似物化合物。所述新型化合物或其藥學上可接受的酯或其鹽可以用于藥用組合物中，并且這類組合物可以用于治療感染、侵染、腫瘤或自身免疫病。所述新型化合物也可以用來調節免疫系統的多個方面，包括調節1型和2型活性。
文檔編號A61P1/16GK1438891SQ01807745
公開日2003年8月27日 申請日期2001年2月15日 優先權日2000年2月15日
發明者R·塔姆, K·拉馬薩米, Z·洪, J·劉 申請人:里巴藥品公司