治療免疫疾病的草藥藥物組合物的制作方法

專利名稱：治療免疫疾病的草藥藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物組合物，它們治療具有免疫疾病的患者的應用，和制備藥物組合物的方法。具體地，藥物組合物包含草藥，它們是(1)沿階草屬植物(沿階草屬植物塊莖(Tuber Ophiopogonis))，(2)半夏屬植物(半夏屬植物塊莖(Tuber Pinelliae))，(3)生甘草屬植物(甘草根(RadixGlycyrrhizae))，和(4)下述草藥的一種長柄菊(lantem tridax)(HerbaTridacis procumbentis)，臺灣adenostema(Herba Adenostematis)和魚腥草(heartleaf houttuynia)(Herba houttuyniae)。任選地，可加入第五種草藥，其是黨參(tang-shen)·(Radix Codonopsitis)或西洋參(Radix PancisQuinquefolii)。草藥藥物組合物被用來有效治療免疫球蛋白E(Ig E)介導的疾病，其包括，但不局限于過敏性鼻炎，過敏性結膜炎，過敏性哮喘，特異反應性濕疹，特異反應性皮炎，食物過敏，高IgE綜合征，和類風濕性關節炎。
例如，在臺灣，小兒哮喘的流行從1974年的1.3％增加到1985年的5.07％和1991年的5.8％。同樣，過敏性鼻炎的發病率從1985年的7.84％增加到1991年的20.67％。另外，遺傳性過敏性濕疹1974年為1.43％，增加到1985年的1.23％和1991年的3.84％。早期發作的過敏原相關的免疫疾病可能是由于環境污染引起的。
呼吸性過敏反應是Ig E介導的免疫反應。Brinker，自然療法醫學雜志(J.Naturopathic Medicine)，464-68(1993)。存在兩種主要的呼吸性過敏反應過敏性鼻炎和過敏性支氣管哮喘。過敏性鼻炎，也已知為枯草熱，是由抗原/Ig E與致敏的肥大細胞和嗜堿性粒細胞結合引起的。所述結合導致cAMP降低，其反過來導致esosinophil趨化因子和組胺的釋放。然后，組胺結合H1-受體，并導致血管舒張、毛細血管滲透性和平滑肌收縮的增加，如同被帶有清涕的鼻充血、打噴嚏和眼睛發癢所證實。
過敏性哮喘是另一種Ig E介導的免疫反應，其中肥大細胞釋放組胺，舒緩激肽和花生四烯酸代謝物包括過敏反應的白細胞三烯慢反應物和血栓烷/前列腺素支氣管收縮藥。血小板激活因子是許多白細胞釋放的另一種有效的哮喘介質。在這種條件下，cAMP減少后釋放的組胺作用于H1受體，引起支氣管痙攣；由于膽堿能的反射作用和在過敏反應中產生部分前列腺素，組胺也導致支氣管收縮。
由于受影響的人群的百分比和疾病的嚴重程度在增加，對過敏反應的治療方法仍然主要依賴于經驗和意外發現而不是依賴于科學方法。大多數過敏患者用針對于控制由效應細胞釋放的介質產生的癥狀的藥物來進行治療。某些藥物似乎短期內能有效緩解癥狀而沒有副作用，然而，還沒有發現對于防止疾病惡化和持久破壞長期有效而沒有任何副作用的藥物。例如，已知長期口服療法如類固醇療法治療哮喘與多數衰弱作用如生長延緩，骨質疏松癥和腎上腺抑制相關。
傳統的中國草藥和藥物結合提供了一種治療免疫疾病的備選方案。已知傳統的中國草藥和草藥化合物能提高免疫系統功能和治療各種慢性(chronicle)免疫疾病。例如，Hamasaki等.，民族藥物學雜志(J.Ethnopharmacology)，(1997)56123-131公開了中國草藥-Shinpi-To，其抑制在大鼠嗜堿性粒細胞性白血病-2H3細胞中Ig E介導的白細胞三烯合成。Shinpi-To是凍干顆粒狀的中國草藥，從7種藥用草藥包括草麻黃(Ephedra sinica Stapf)，杏，runus armeniaca Linne)，厚樸(Magnolia obovataThunberg)，陳皮(Citrus unshiu Markovich)，甘草(Glycyrrhiza uvalensisFischer)，柴胡(Bupleurum falcatum L.)，和紫蘇(Perillae herba)(Perillafrutescens Britton var.acuta Kudo)的提取物中制得。Shinpi-To用于治療小兒哮喘。
Toda等.，民族藥物學雜志(J.Ethnopharmacology)，(1988)24303-309公開了中國草藥-Saiboku-To，其顯示對小鼠腹膜肥大細胞釋放組胺的抑制作用。Saiboku-To包含10種草藥，包括柴胡(Bupleurum falcatum L.)，半夏(Pinelliae ternata Breitenbach)，茯苓(Poria cocos Wolf)，黃苓(Scutellaria baicalensis Georgi)，中國棗(Zizyhus vulgaris Lam)，人參(Panaxginseng C.A.Meyer)，厚樸(Magnolia obovata Thunberg)，光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)，紫蘇，erilla frutescens Britton var.acuta Kudo)和姜(Zingiber officinale Roscoe)。
Li等.，免疫藥理學(Immunopharmacology)，(1999)，4311-21公開了中國草藥-Hochu-Ekki-To，其顯示對修復壓力誘導的免疫抑制的作用。Hochu-Ekki-To由10種成分組成，包括人參(Ginseng Rx)，Atractylodis albaRz，Astragali Rx，當歸(Angelicae sinensis Rx)，大棗(Jujubae Fr)，CitrireticulataePc，柴胡(Bupleuri Rx)，甘草(Glycyrrhizae Rx)，Preparata，Zingiberis recens Rz，和升麻(Cimicifugae Rz)。
Zou等.，中國傳統和西方醫學雜志(Chinese Traditional and WesternMedical Magazine)，529-532(1996)公開了中國草藥-Wenyang Tongluo混合物，來治療寒型哮喘。它顯示了提供肺通氣功能、調節外周血淋巴細胞的腎上腺素β-受體、降低5-羥色胺的血清水平的作用。Wenyang Tongluo混合物包含12種草藥，包括紅參(Red Ginseng)，Zhi Fu Pian，Yin Yang Huo，干姜(Zingiberis recens Rz.)，Zhi Huang Zhi，當歸(Angelicae sinesis Rx)，麻黃(Ephedra)，Polygalae Rx，桑白皮(Sang Baipi)，生石膏(Sheng Shi Gao)，五味子(Schisandrae Fr)和甘草(Glycyrrhizae Rx.Preparata)。
治療之氣管炎和支氣管哮喘的煎劑已公開于國際互聯網(www.herb.com.tw)。所述煎劑由6種草藥制得，包括麥冬(OphiopogonisRx)，半夏(Pinelliae Rz)，Preparata，Oryzae Sm，大棗(Jujubae Fr)，人參(Ginseng Rx)，和甘草(Glycyrrhizae Rx)。
在從草藥中開發藥物組合物過程中，中國草藥的質量控制是關鍵。草藥的含量和活性成分可能隨著一些因素如生長條件和生長位置、收獲季節和技術、和收獲草藥的制造和加工而波動。如果不滿足這些關鍵因素的任何一種，則可能草藥的功效受到影響。然而，尚沒有報道或采納可靠監測中國草藥的質量的科學方法。
本發明提供了新的并且無毒的藥物組合物，其得自主要發現于中國和臺灣的草藥。在任何文獻或報道中尚未發現結合使用這些草藥。這些藥物組合物能有效治療患有免疫疾病，特別是Ig E介導的疾病。已證實本發明的藥物組合物特別作用于白細胞介素4(IL-4)合成的負調節和抑制Ig E。另外，為有效控制草藥的質量，本發明利用薄層層析法(TLC)和高效液相色譜(HPLC)對每種草藥進行指紋圖譜，以保證用于組合物的每種草藥包含一致的和重現的成分。
最優選的藥物組合物包含沿階草屬植物，半夏屬植物，生甘草屬植物，西洋參和長柄菊。這些草藥的有效成分可以用水或有機溶劑提取，也可以是直接研磨草藥獲得的粉末形式。
在一個實施方案中，藥物組合物包含水性提取物形式的沿階草屬植物，其余的草藥為粉末形式。沿階草屬植物的水性提取物優選通過在水中提取來制備。
在另一個實施方案中，藥物組合物包含沿階草屬植物、半夏屬植物、生甘草屬植物和西洋參的水性提取物，優選通過在水中提取來制備；和長柄菊的水性提取物，優選在醇(最優選在50％醇)中提取來制備。
本發明還提供了制備藥物組合物的方法，其中制備了草藥的水性提取物和/或粉末。在一個實施方案中，除了沿階草屬植物，所有其它草藥切成片狀，脫水，研磨，并通過篩網來生產草藥粉末。通過在水中煎煮和濃縮沿階草屬植物來提取沿階草屬植物的成分。然后通過使濃縮的沿階草屬植物-水混合物通過篩網獲得沿階草屬植物提取物(被過濾的)。其次，將沿階草屬植物濾液與草藥粉末混合以形成草藥混合物。然后將草藥混合物置于流動造粒機中以生產顆粒。任選過篩顆粒以生產具有均勻大小的顆粒。
在另一個實施方案中，如下制備藥物組合物(a)優選單獨過濾和濃縮每種沿階草屬植物，半夏屬植物，生甘草屬植物，西洋參和長柄菊的水性提取物。(b)除了不被制粒的沿階草屬植物，從濃縮物中分別制粒每種半夏屬植物，生甘草屬植物，西洋參和長柄菊的濃縮物，以形成單獨的顆粒。(c)在制粒前，向濃縮物中加入賦形劑，優選玉米淀粉，以獲得合適形式的顆粒。(d)然后將各單獨的顆粒和沿階草屬植物濃縮物一起混合以形成混合的顆粒，然后將這些顆粒包入膠囊。
優選地，沿階草屬植物濃縮物的固體內容物為沿階草屬植物原材料的約20-30％重量，優選約25％重量。濃縮物的固體內容物是除水之外的濃縮物。就沿階草屬植物而言，濃縮物包含大量的水(即約58％的沿階草屬植物濃縮物是水)。其余草藥的固體內容物約與濃縮物相同(即，忽略水含量)。半夏屬植物的濃縮物為半夏屬植物原材料的約15-25％重量，優選約20％重量。生甘草屬植物的濃縮物為生甘草屬植物原材料的約15-25％重量，優選約20％重量。西洋參的濃縮物為西洋參原材料的約19-29％重量，優選約24.3％重量。長柄菊的濃縮物為長柄菊原材料的約5-10％重量，優選約7.8％重量。
半夏屬植物顆粒為半夏屬植物原材料的約20-30％重量，優選約25％重量。生甘草屬植物顆粒為生甘草屬植物原材料的約16-26％重量，優選約21％重量。西洋參顆粒為西洋參原材料的約27-37％重量，優選約32％重量。長柄菊顆粒為長柄菊原材料的約37-47％重量，優選42％重量。
同樣，該方法需要分別對沿階草屬植物、半夏屬植物、生甘草屬植物、西洋參和長柄菊進行提取。另外，通過煎熬，在水中提取沿階草屬植物、半夏屬植物、生甘草屬植物和西洋參。通過回流，在醇，優選50％醇中提取長柄菊。提取后，過濾每個單獨的提取物，以去除殘留的草藥。然后，在約55℃的溫度，約30托的真空下，通過減壓濃縮對濾液進行濃縮，以形成濃縮物。除了沿階草屬植物，向每種濃縮物中加入適量的賦形劑，優選玉米淀粉，以形成提取膏，其在約105℃的入口溫度和約76-77℃的出口溫度下，通過噴霧干燥進行制粒。將來自半夏屬植物、生甘草屬植物、西洋參和長柄菊的各自顆粒與沿階草屬植物的濃縮物混合，以形成混合的顆粒，這些顆粒可包入膠囊。
另外，水性提取物的體積與草藥的重量的比率約為20∶1。對于水提取，優選的煎熬時間約為30分鐘。優選的醇提取時間也約為30分鐘。
本發明的兩種藥物組合物，一種包含沿階草屬植物的水提取物和其它草藥的粉末，另一種包含所有草藥的水提取物，這兩種組合物均對治療免疫疾病有效。然而，包含所有草藥的水提取物的藥物組合物是比較受歡迎的，因為證實了它比含沿階草屬植物的水提取物和其它草藥粉末的藥物組合物具有更好的藥效和功效。這兩種方法的治療效果的不同可能是由于在提取過程中，活性成分釋放的效力增加的緣故。
本發明的藥物組合物在治療患有免疫疾病，特別是Ig E介導的疾病的患者是有效的，所述疾病包括，但不局限于過敏性鼻炎，過敏性結膜炎，過敏性哮喘，特異反應性皮炎，食物過敏，高IgE綜合征，特異反應性濕疹，和類風濕性關節炎。
圖2表示半夏屬植物的HPLC色譜圖。利用方法2的HPLC分析，在260nm波長處檢測到兩個化學標記腺嘌呤和鳥苷。腺嘌呤具有14.8分鐘的保留時間。鳥苷具有17分鐘的保留時間。
圖3表示生甘草屬植物的HPLC色譜圖。利用方法1的HPLC分析，在250nm波長處檢測到化學標記甘草甜(Gly)。Gly具有46.4分鐘的保留時間。
圖4表示西洋參的HPLC色譜圖。利用方法3的HPLC分析，在203nm波長處檢測到化學標記人參皂甙Rb1(Rb1)。Rb1具有37.5分鐘的保留時間。
圖5表示長柄菊的HPLC色譜圖。利用方法2的HPLC分析，在250.0nm波長處檢測到4個獨特的峰，FY-1-FY-4。FY-1具有28分鐘的保留時間。FY-2具有31.6分鐘的保留時間。FY-3具有33.5分鐘的保留時間。FY-4具有18.3分鐘的保留時間。
圖6表示吸入Der p5激發，然后用5(A-F)煎劑組處理后，Der p5(屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssimus)過敏原5)特異性Ig G和Ig E抗體的水平。用ELISA測量血清Ig G和Ig E水平。數值是平均值±SEM，條框指示SEM。AWhite-Draining粉末組；BGreen-Blue Dragon煎劑組；C沿階草屬植物煎劑組；DDryness-Clearing lung-Rescuing煎劑組；E蘇子Qi-Downbearing煎劑組(Perilla Fruit Qi-Downbearing Decoctiongroup)；和F安慰劑組。
圖7表示吸入Der p5激發，然后用5(A-F)煎劑組處理后，IL-4基因在脾細胞中的表達。用RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈式反應)確定IL-4基因的表達。數值為平均值±SEM，條框指示SEM。AWhite-Draining粉末組；BGreen-BlueDragon煎劑組；C沿階草屬植物煎劑組；DDryness-Clearing lung-Rescuing煎劑組；E蘇子Qi-Downbearing煎劑組；和F安慰劑組。*指示p＜0.05。
圖8表示用過敏原Der p5(屋塵螨過敏原5)激發和用單獨的草藥治療后小鼠血清Ig G水平。泳道1表示沿階草屬植物治療的作用。泳道2表示黨參治療的作用。泳道3表示半夏屬植物治療的作用。泳道4表示生甘草屬植物治療的作用。泳道5是安慰劑治療。用ELISA測量血清Ig G水平。數值為平均值±SEM，條框指示SEM。
圖9表示Der p5(屋塵螨過敏原5)激發和用單獨的草藥或藥物組合物(即，STA-36，下文)治療后小鼠血清Ig E水平。泳道1表示沿階草屬植物治療的作用。泳道2表示黨參治療的作用。泳道3表示半夏屬植物治療的作用。泳道4表示生甘草屬植物治療的作用。泳道5表示STA-36治療的作用。泳道6是安慰劑治療。用ELISA測量血清Ig G水平。數值為平均值±SEM，條框指示SEM。


圖10表示Der p5(屋塵螨過敏原5)激發和用單獨的草藥或藥物組合物(即，STA-36，下文)治療后，在小鼠脾細胞中IL-4基因的表達。用RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈式反應)確定IL-4基因的表達。泳道1表示沿階草屬植物治療的作用。泳道2表示黨參治療的作用。泳道3表示半夏屬植物治療的作用。泳道4表示生甘草屬植物治療的作用。泳道5表示STA-36治療的作用。泳道6是安慰劑治療。
圖11比較了下述形式的西洋參對Ig G2a和Ig E水平的作用(1)粉末，(2)在95％醇中的水性提取物，(3)在水中的水性提取物，和(4)在50％醇中的水性提取物。數值是平均值±SEM。圖形表示根據降低Ig E和增加IgG，用50％醇提取的西洋參產生了比用水提取的西洋參稍強的作用。
圖12比較了下述形式的長柄菊對IgE、IgG2a、IL-4和IFN-γ水平的作用(1)粉末，(2)在95％醇中的水性提取物，(3)在水中的水性提取物，和(4)在50％醇中的水性提取物。數值是平均值±SEM。*表示與對照明顯的不同。結果指出長柄菊的50％乙醇提取物對抑制IgE和增加IgG最有效。
圖13是雌性BALB/c小鼠血清中，STA-36，STA-34和對照(安慰劑組)對IgG和IgE作用的比較研究。*表示在STA-4和對照之間顯著差異(p＜0.05)。數值是平均值±SEM。STA-36的劑量(20mg/20g小鼠)為STA-4劑量((10mg/20g小鼠)的兩倍(即STA-3∶STA-4＝2∶1)。結果表示根據IgE，盡管STA-36和STA-4均表現對IgE的抑制，但相對于對照而言，僅STA-4是具有統計學意義。對于IgG，STA-36和STA-4均表現IgG的增加。然而，盡管在IgG水平方面，STA-36比STA-4顯示較大的增加，但沒有增加相對于對照而言是具有統計學意義的。
圖14是STA-36和STA-4對肺功能的作用的比較研究。數值是平均值±SEM。與對照相比，在肺功能方面，STA-36和STA-4均表現明顯的改善(如通過測量乙酰膽堿所確定的)。在STA-36和STA-4的治療之間，盡管STA-4比STA-36的作用強，然而STA-36和STA-4之間的差異不具有統計學意義，這可能是由于每組使用的動物數量不足的緣故。STA-36的劑量(20mg/20g小鼠)是STA-4劑量(10mg/20g小鼠)的兩倍。
圖15比較了STA-4和那些傳統藥物(用來治療哮喘)包括酮替芬，強的松龍，和Aminophline對IgE、IgG、IL-4和IFN-γ的作用。數值是平均值±SEM。*表示與對照明顯不同。本研究結果指出STA-4顯著降低了IgE水平，但顯著增加了IgG2a，I1-4和IFN-γ水平。
發明詳述抗原或過敏原介導的哮喘是主要由于慢性炎癥反應導致的呼吸道疾病。炎癥反應通過細胞釋放炎性因子例如血小板激活因子、組胺、前列腺素和白細胞三烯而被介導。炎癥反應刺激T淋巴細胞(T細胞)，特別是CD4+細胞中的抗原應答。存在兩種類型的CD4+細胞，Th1和Th2CD4+細胞。Th1型CD4+細胞分泌細胞因子(IFN-γ)。Th2型CD4+細胞分泌白細胞介素-4(IL-4)。大多數過敏性哮喘患者是Th2型。過敏原刺激Th2細胞產生過量的IL-4，其反過來誘導B淋巴細胞產生和分泌IgE。
本發明提供了7種藥物組合物STA-31，STA-32，STA-33，STA-34，STA-35，STA-36，和STA-4。所有的組合物具有對免疫疾病，特別是對抑制Ig E產生和負調節白細胞介素-4(IL-4)基因合成的藥物作用。草藥藥物組合物的草藥含量示于表1中。表1.藥物組合物中的草藥組成
aq.ext.＝用水提取的水性提取物；沿階草屬植物＝沿階草屬植物塊莖；生甘草屬植物＝甘草根；黨參＝Radix Codonopsitis；人參＝西洋參；Adenostema＝下田菊(HerbaAdenostemmatis)；魚腥草＝魚腥草；Tridax＝長柄菊。
在7種組合物中，優選STA-36組合物，最優選STA-4組合物。STA-36和STA-4治療免疫疾病包括抑制IgE產生特別有效。
每種藥物組合物包含5種草藥，其中3種是必需的草藥。必需的草藥是沿階草屬植物(也已知為黑韭蔥)，半夏屬植物和生甘草屬植物。第四種草藥可以是黨參或西洋參。第五種草藥選自臺灣adenostema，長柄菊和魚腥草。依照可利用的草藥文獻，僅在臺灣發現了臺灣adenostema和魚腥草。在臺灣和南美州發現了長柄菊。組合物的藥名，植物名，科和主要成分示于表2中。表2.STA藥物組合物中草藥的藥名/植物名和主要成分
沿階草屬植物(沿階草屬植物根)屬于百合科。沿階草屬植物的塊莖(根)具有藥用的作用。沿階草屬植物的最佳收獲季節是夏季。收獲后，清洗干凈沿階草屬植物的塊莖，以去除不需要的污垢或支根，在陽光下干燥后保存以備后用。沿階草屬植物的塊莖是根的增大部分。可在中國的一些省份如浙江，四川和江蘇找到沿階草屬植物。Yu等.(1991)，China Journal of Chinese Materia Medica，16584-585報道了沿階草屬植物的水提取物可促進小鼠中靜脈注射炭顆粒的清除，拮抗由clophosphamide引起的白細胞減少。為了在草藥組合物中被有效地利用，可用由水或其它有機溶劑提取的水性提取物來制備沿階草屬植物塊莖。優選草藥的劑型是用水提取的提取物。
黨參屬于桔梗科。黨參的藥用部分在根部。可收集野生或栽培的黨參。黨參的典型收獲季節是秋季。收獲后，在陽光下干燥黨參的根，并切成段以備用。可在臺灣的南投縣和臺中縣找到黨參。為了在草藥組合物中被有效地利用，可通過用水或其它有機熔劑提取的水性提取物或研磨未加工的草藥得到的粉末來制備草藥。優選的草藥制劑是通過用水提取的水性提取物或研磨的粉末。
西洋參屬于五加科。西洋參的藥用部分在根部。可在北美和加拿大找到西洋參。在法國和中國北方也廣泛栽培有西洋參。西洋參的最佳收獲季節是秋季。為了在草藥組合物中被有效地利用，可通體用水或其它有機溶劑提取的水性提取物或研磨的粉末形式來制備。優選的草藥劑型是通過用水提取的水性提取物或研磨的粉末。
半夏屬植物(半夏屬植物塊莖，Rhizoma Pinellia Ternata)屬于天南星科。半夏屬植物的塊莖(去除木栓層后)具有藥用的作用。這類植物生長在中國的四川，河北，河南，貴州和安徽省。半夏屬植物的正常收獲季節是在7月和9月之間。半夏屬植物可在臺灣的臺中縣找到。為了在草藥組合物中被有效地利用，可通過用水或其它有機溶劑提取的水性提取物或研磨的粉末來制備草藥。優選的草藥劑型是用水提取的水性提取物或研磨的粉末。
生甘草屬植物(甘草節(梢))屬于豆科。生甘草屬植物的具有(未削皮)或不具有(削皮)周皮的根和生殖根具有藥用的作用。以干燥的材料來計算，生甘草屬植物包含不少于2.5％的甘草酸(C42H62O16)，其可用作生甘草屬植物的化學標記。可在中國內蒙古，甘肅，新疆和中國東北找到生甘草屬植物。生甘草屬植物的最佳收獲季節是春季或秋季。在臺灣，可在臺中縣找到生甘草屬植物。甘草屬植物的根具有抗炎癥性能，并且可單獨使用，以有助于緩解哮喘的癥狀。參見H.W.Morningstar，Sentient TimesAlternative for Personal and Community Trans(1998)，616-17。甘草屬植物的根還可用于治療支氣管炎。參見T.David，Miracle Medicines of the RainforestA Doctor′s Revolutionary Work WithCancer And AIDS Patients(1997)，66-79頁。為了在草藥組合物中被有效地利用，可通過用水或其它有機溶劑提取的水性提取物或以研磨的粉末形式來制備草藥。優選的草藥劑型是用水提取的水性提取物或研磨的粉末。
長柄菊屬于菊科。長柄菊的藥用作用來自于干燥的整株植株。可在臺灣的南頭縣，臺中縣和云林縣和臺中市找到長柄菊。也能在南美找到長柄菊。Diwan等.，Indian Journal of Physiology & Pharmacology(1983)，2732-36公開了長柄菊葉的葉汁提取物具有類似于地塞米松對傷口收縮和肉芽形成的作用，但明顯中和了地塞米松對抗張強度和上皮形成的作用。Gan等.，China Medical College Annual Bulletin(1977)，8526公開了長柄菊的葉可用于減輕炎癥，緩解發熱的癥狀，和治療肺炎和咳嗽。
為了在草藥組合物中被有效地利用，可通過用水或其它有機溶劑提取的水性提取物或以研磨粉末的形式來制備長柄菊。優選的草藥劑型是研磨的粉末或用醇，優選用50％的醇提取的水性提取物。
臺灣adenostema(Herba Adenostemmatis)屬于菊科。臺灣adenostema通常生長在近水或濕地。臺灣adenostema的藥用作用來自于整株植株，可以新鮮或干燥的形式使用。最佳收獲季節是夏季或早秋。不僅可在臺灣，而且可在中國的云南，廣西，貴州，江西和浙江找到臺灣adenostema。臺灣adenostema包含11-羥基化的kauranic acid。為了在草藥組合物中被有效地利用，可以研磨的粉末形式來制備草藥。優選的草藥劑型是研磨的粉末。
魚腥草(Heartleaf houttuynia或Houttuynia Herb)(Houttuyniae cumRadice Houttuyniae Cordatae)是蕺菜的地上部分。它屬于三白草科。魚腥草遍布長江流域和中國的南方生長。最佳收獲季節是晚夏和早秋之間的開花季節。可在臺灣的臺中縣找到Hanhong魚腥草。為了在草藥組合物中被有效地利用，可以研磨粉末的形式來制備草藥。優選的草藥劑型是研磨的粉末。
通常，如下制備組合物A.STA-31，STA-32，STA-33，STA-34，STA-35和STA-36的制備(1)切下半夏屬植物、生甘草屬植物和西洋參的根和長柄菊的整株植株，脫水，研磨并通過篩網(優選40-120目)，以產生草藥粉末。
(2)將沿階草屬植物的根切成小片，并浸入到煎藥容器的水中，其中水的體積至少高于沿階草屬植物頂部10cm。在97-103℃下加熱被浸沒的沿階草屬植物約60分鐘，煎煮兩次，以產生沿階草屬植物提取物溶液。然后，將沿階草屬植物提取物溶液通過篩網(約100目)。收集濾液。然后在50-60℃，壓力為400-650mm-Hg的真空條件下濃縮沿階草屬植物濾液，以獲得具有理想濃度的液體濃縮物。優選液體濃縮物為沿階草屬植物濾液的約1/14。
(3)將沿階草屬植物的液體濃縮物與其余草藥的草藥粉末混合。然后將混合物移至流化制粒機中，并置于由過濾用的織物制成的噴射管中。將制粒機的溫度調至90-110℃。預熱約5分鐘后，以每次約40-55秒的時間噴射混合物，噴射適當的次數，并以每10秒鐘的頻率輕拍噴射管。制粒后，干燥顆粒，然后冷卻。使顆粒通過篩網，并包裝在PE袋中。顆粒的優選的水含量為少于6％。可將顆粒進一步包囊于任何傳統的膠囊中，所述膠囊包括，但不局限于天然明膠，果膠，酪蛋白，膠原質，蛋白質，改性淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。B.STA-4草藥組合物的制備用下述方法制備STA-4草藥組合物I.對于長柄菊(1)將長柄菊的整株植株切成小片。
(2)加入約20倍(以體積計)的50％醇(體積/體積)(即，提取劑)，并與約1倍(以重量計)的小片長柄菊混合。
(3)通過回流加熱來加熱草藥和它的提取劑，加熱約30分鐘。該過程產生了長柄菊的醇提取物。
(4)提取物冷卻后，通過篩網(約100目)過濾長柄菊醇提取物。收集濾液。然后用減壓濃縮法，在50-60℃(優選55℃)的溫度下，在真空條件下(30托)濃縮濾液，以獲得濃縮物。優選地，濃縮物的固體含量為原材料重量的約7.8％。濃縮物的固體內容物是除50％醇外的濃縮物。對于長柄菊而言，濃縮物的固體內容物約與濃縮物相同(因為在濃縮物中僅存在非常少量的水)。
(5)向濃縮物中加入適量的玉米淀粉(作為賦形劑)，以產生草藥膏。
(6)用噴霧-干燥法干燥草藥膏，以形成長柄菊顆粒(優選約為原材料重量的42％)。
II.對于半夏屬植物，生甘草屬植物和西洋參(1)分別將半夏屬植物的塊莖和甘草屬植物的根和西洋參的根切成小片。
(2)對于每種草藥，分別加入約20倍(以體積計)的水，并與約1倍(以重量計)的單個草藥小片混合。
(3)通過煎煮加熱浸沒在水中的每種草藥約30分鐘，導致分別產生沿階草屬植物，半夏屬植物，生甘草屬植物和西洋參的水提取物。
(4)冷卻各自的提取物后，將每種提取物分別通過篩網(約100目)過濾。收集每種濾液，然后用減壓濃縮法在50-60℃(優選55℃)的溫度下，在真空條件下(30托)濃縮濾液，以獲得每種草藥的液體濃縮物。優選地，半夏屬植物濃縮物的固體內容物為半夏屬植物原材料的約20％；生甘草屬植物濃縮物的固體內容物為生甘草屬植物原材料的約20％；西洋參濃縮物的固體內容物為西洋參原材料的約24.3％。半夏屬植物、生甘草屬植物或西洋參的濃縮物的固體內容物是除水以外的濃縮物。
(5)向每種濃縮物中加入適量的玉米淀粉(作為賦形劑)，然后用噴霧-干燥法制粒以產生各自的顆粒。
(6)將各自的顆粒與長柄菊顆粒一起混合以形成混合的顆粒。
III.對于沿階草屬植物按照程序II(1)-(4)濃縮沿階草屬植物的塊莖。在沿階草屬植物的濃縮物與半夏屬植物、生甘草屬植物和西洋參的濃縮物之間的差別在于沿階草屬植物濃縮物包含大量的水，而其余的濃縮物幾乎不含水。對于9g的沿階草屬植物原材料，濃縮物約為5.4g，其中固體內容物約為2.25g和水為3.15g。
將沿階草屬植物的液體濃縮物與其余的草藥顆粒相混合。
作為比較，在下表3a中舉例說明了原材料，STA-36和STA-4的克重量表3a.STA-36和STA-4的內含物和重量
*SC＝固體內容物(其為干燥的濃縮物[排除了水或溶劑的濃縮物])。
在表3a中，“原材料”行表示加工前每種草藥的重量。“STA-36”和“STA-4”行表示(1)每種草藥的最終劑型；和(2)每種草藥的最終重量。例如，在STA-36中，除了為濃縮物形式的沿階草屬植物，半夏屬植物，生甘草屬植物，西洋參和長柄菊均為草藥粉末形式。同樣，在STA-36中，除了沿階草屬植物以外，其重量少于它的原材料，其余草藥的草藥粉末均保持與它們的原材料相同的重量。
在STA-4中，僅沿階草屬植物保持與STA-36中相同的最終劑型，即，濃縮物。如表3a中所示，經歷了提取、濃縮和制粒后，其余草藥的克重量已被大幅減少。另外，為有助于在制粒過程中穩定濃縮物，向每種草藥濃縮物中加入賦形劑(如玉米淀粉)。向每種濃縮物中加入的玉米淀粉的量依據濃縮物的穩定性而改變。即使STA-4和STA-36衍生自相同量的原材料，但顆粒形式的STA-4的終產品約為STA-36的終產品重量的一半。STA-4在總的克重量的減少，但保持了與STA-36相同或更好的對免疫疾病的治療作用，使得它獲得了來自STA-36的另一種改進，因為這意味著患者不需為獲得相同或更好的治療效果而攝入兩倍量的草藥。
下述實施例是解釋本發明，不應被理解為限制本發明。在未脫離本發明的范圍的條件下，在此處可進行合理的改變，例如技術人員進行那些合理的改變。
(1)除了沿階草屬植物，將所有適用的草藥，用量如表3所示，切片，脫水，研磨，并通過篩網(優選40-120目)，以產生草藥粉末。
(2)將用量如表3所示的沿階草屬植物浸沒在煎-煮容器的水中，其中水的體積至少高于沿階草屬植物頂部10cm。在97-103℃下加熱浸沒的沿階草屬植物約60分鐘，進行兩次，以產生沿階草屬植物提取物溶液。然后，將沿階草屬植物提取物溶液通過篩網(約100目)。收集濾液。然后在50-60℃，在400-650mm-Hg壓力的真空條件下濃縮沿階草屬植物濾液，以獲得具有理想濃度的液體濃縮物。優選液體濃縮物約為沿階草屬植物濾液的1/14。
(4)將沿階草屬植物的液體濃縮物與其余草藥的草藥粉末混合。然后將混合物移至流化制粒機中，并置于由過濾織物制成的噴射管中。將成粒機的溫度調至90-110℃。在預熱約5分鐘后，以每次約40-55秒的時間噴射混合物，噴射適當的次數，并以每10秒鐘的頻率輕拍噴射管。制粒后，干燥顆粒，然后冷卻。使顆粒通過篩網，并包裝在PE袋中。顆粒的優選的水含量為少于6％。可將顆粒進一步包囊于任何傳統的膠囊中，所述膠囊包括，但不局限于天然明膠，果膠，酪蛋白，膠原質，蛋白質，改性淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。
在組合物中使用的草藥的HPLC分析，其包括方法、主要標記，每種草藥的檢測波長，歸納于表7中。STA-36的HPLC色譜示于圖1-5。表7.在STA-36中使用的草藥的HPLC分析
HPLC分析前，將0.5g草藥樣品與20ml含70％甲醇的溶液混合。室溫下將樣品溶液超聲15分鐘，并置于40℃的以160rpm轉速轉動的水浴20分鐘。然后將樣品溶液靜止約30分鐘，以使得碎屑沉淀。然后吸出10ml的上清液并通過0.45μm的濾器。濾液用于HPLC分析。取20μl的濾液用于HPLC分析。結果沿階草屬植物的HPLC色譜圖示于圖1。如表7所示，使用HPLC分析的方法在214nm的波長處檢測沿階草屬植物。在沿階草屬植物HPLC色譜上鑒定了兩個獨特的峰，6115-1和6115-2。6115-1具有11.5分鐘的保留時間。6115-2具有13分鐘的保留時間。盡管在這兩個峰中化學成分尚未鑒定，但它們可用于保證沿階草屬植物的質量的目的。
半夏屬植物的HPLC色譜圖示于圖2。如表7所示，使用HPLC分析的方法2在250nm的波長處檢測半夏屬植物，半夏屬植物顯示兩種獨特的化學標記，即腺嘌呤和鳥苷，兩種均是核酸的組成成分。腺嘌呤還具有增加血清縮醛酶的作用。腺嘌呤具有14.8分鐘的保留時間。鳥苷具有17分鐘的保留時間。
甘草的HPLC色譜圖示于圖3。如表7所示，使用HPLC分析的方法1在250nm的波長處檢測甘草，在甘草HPLC色譜中發現化學標記“甘草甜(glycyrrhizini)”。甘草甜(C42H62O16)是非常甜的物質。已知其具有解毒、抗炎癥和溶血作用，并且已用于治療阿狄森氏病。甘草甜的保留時間是46.4分鐘。
西洋參的HPLC色譜圖示于圖4。如表7所示，使用方法3在250nm波長處檢測西洋參，在西洋參HPLC色譜中發現化學標記“人參皂甙Rb1”。人參皂甙Rb1具有擴張血管，緩解疲勞和避免溶血的藥物作用。
長柄菊的HPLC色譜圖示于圖5。如表7所示，使用HPLC分析的方法1在250nm波長處檢測長柄菊，鑒定了四個獨特的峰，FY-1-FY-4。FY-1具有28.0分鐘的保留時間。FY-2具有31.6分鐘的保留時間。FY-3具有33.5分鐘的保留時間。FY-4具有18.3分鐘的保留時間。由于這四個峰連續出現，即使與這四個峰相關的化學內容物尚未鑒定，它們也可用于鑒定和保證長柄菊質量的目的。
依據草藥的特征，TLC方法使用硅膠60 F254(其結合到TLC板上)和三種流動相(或分散)溶劑。第一種溶劑包含乙酸乙酯，4N氨水，和乙醇，它們的體積比為4∶1∶2(體積/體積/體積)。第一種溶劑特別用于表征生甘草。第二種溶劑包含丁醇，4N氨水和乙醇，它們的體積比為5∶2∶1(體積/體積/體積)。第二種溶劑特別用于表征沿階草屬植物和西洋參。第三種溶劑包含氯仿(CHCl3)和甲醇，它們的體積比為5∶1(體積/體積)。第三種溶劑特別用于表征長柄菊。對于每個TLC測定，在TLC板的起始點，加入5μl樣品。將板置于施用了流動相溶劑的TLC室中。允許移動最多9cm的溶劑。TLC測定結果描述如下(A)生甘草屬植物使用附著于TLC板的硅膠60 F254固定相和含乙酸乙酯∶4N氨水∶乙醇＝4∶1∶2(體積/體積/體積)的流動相溶劑，通過TLC分析生甘草。施用樣品后，將TLC板置于包含流動相溶劑的TLC室中，所述TLC室具有不超過樣品施用點的上部液體標記。從樣品施用點計算，允許移動最多9cm的溶劑。然后，將TLC板從TLC室中取出，并空氣干燥。用含香蘭醛/H2SO4的噴射劑噴霧干燥的TLC板。然后，在105℃溫度下加熱活化2分鐘。在TLC板的約Rf＝0.5處顯示表示生甘草屬植物的黃色斑點。Rf＝(斑點和樣品施用點間的距離[cm])/總的遷移距離[即，9cm]。(B)沿階草屬植物使用附著于TLC板的硅膠60 F254固定相和含丁醇∶4N氨水∶乙醇＝5∶2∶1(體積/體積/體積)的流動相溶劑，通過TLC分析沿階草屬植物。施用樣品后，將TLC板置于包含流動相溶劑的TLC室中，所述TLC室具有不超過樣品施用點的上部液體標記。從樣品施用點計算，允許移動最多9cm的溶劑。然后，將TLC板從TLC室中取出，并空氣干燥。用含香蘭醛/H2SO4的噴射劑噴霧干燥的TLC板。然后，在105℃溫度下加熱活化2分鐘。在TLC板的約Rf＝0.4處顯示表示沿階草屬植物的棕色斑點。(C)西洋參使用附著于TLC板的硅膠60 F254固定相和含丁醇∶4N氨水∶乙醇＝5∶2∶1(體積/體積/體積)的流動相溶劑，通過TLC分析西洋參。施用樣品后，將TLC板置于包含流動相溶劑的TLC室中，所述TLC室具有不超過樣品施用點的上部液體標記。從樣品施用點計算，允許移動最多9cm的溶劑。然后，將TLC板從TLC室中取出，并空氣干燥。用含香蘭醛/H2SO4的噴射劑噴霧干燥的TLC板。然后，在105℃溫度下加熱活化2分鐘。在TLC板的約Rf＝0.3處顯示表示西洋參的略帶紫色的斑點。(D)長柄菊使用附著于TLC板的硅膠60 F254固定相和含氯仿∶甲醇＝5∶1(體積/體積)的流動相溶劑，通過TLC分析長柄菊。施用樣品后，將TLC板置于包含流動相溶劑的TLC室中，所述TLC室具有不超過樣品施用點的上部液體標記。從樣品施用點計算，允許移動最多9cm的溶劑。然后，將TLC板從TLC室中取出，并空氣干燥。將干燥的TLC板置于UV檢測儀下，并在366nm處檢測波長。在TLC板的約Rf＝0.3處顯示表示長柄菊的淺黃色熒光斑點。實施例4五種傳統中國草藥煎劑對小鼠中過敏原誘導的IgG、IgE和IL-4的作用利用D.P.(屋塵螨Dermatophagoides pteronyssimus)過敏原“Der p5”致敏的BALB/c小鼠研究五種傳統中國草藥煎劑對過敏原誘導的免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)合成的抑制的作用和對白細胞介素-(IL-4)表達的作用。屋塵螨是充當抗原，并且在哮喘人群中產生過敏性哮喘反應。
這些傳統中國煎劑示于表8中。已知這些傳統中國煎劑對治療患有肺相關疾病例如哮喘的患者具有特殊的作用。表8.五種傳統中國草藥煎劑
試驗設計(A)草藥材料的制備
將50mg每種上述指定的草藥制劑(所有均來自Sun Ten Sci.Pharm.Corp.，臺北，臺灣)分別與180μl吐溫80混合，并均化(均化器DC-3S，Xinguang Precision Instrument Industrial Limited，Inc.，臺灣)。向勻漿中加入水，使得終體積至2ml，終濃縮為25mg/ml。每隔一天對每只小鼠施用0.4ml/每20g體重的一種草藥組合物溶液或安慰劑，持續14天。(B)動物4-6周齡的雌性BALB/c小鼠獲自中國國家動物飼養中心(NationalAnimal-breeding Center，Republic of China)，并用于該研究。小鼠的年齡和性別與每個試驗相匹配。(C)免疫原Derp5(屋塵螨種群5免疫原)純化pGEX-2T質粒用于在大腸桿菌中表達Der p5-谷胱甘肽S轉移酶(GST)。融合蛋白的分子量約為42KD。通過谷胱甘肽結合的瓊脂糖凝膠柱層析純化蛋白。通過在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB肉湯上培養被轉染的大腸桿菌來篩選Der p5-GST陽性細菌菌株的單克隆。進一步培養Der p5-GST陽性大腸桿菌克隆，以生產足量的Der p5-GST。然后，收集細菌培養物并離心。棄去上清液，用TBS(pH7.5)洗滌沉淀，并收集于離心管中。然后立即用TBS洗滌，向沉淀中加入0.1M苯基甲基磺酰氟，然后加入DNase I，吐溫20和溶菌酶。通過凍-融過程裂解沉淀，以釋放Der p5+GST蛋白。隨后，向細胞裂解物中加入EDTA，然后離心。棄去沉淀，將上清液倒到谷胱甘肽結合的瓊脂糖凝膠吸附柱上，該瓊脂糖凝膠吸附柱已吸附了Der p5-GST蛋白。首先在4℃用TBS緩沖液洗滌該柱，然后在Tris-堿(pH8.0)中還原谷胱甘肽以從瓊脂糖凝膠柱中分離Der p5-GST。用SDS-PAGE確定Der p5-GST蛋白的純度。用常規的蛋白分析方法測定蛋白量。(D)動物致敏化起初用10μg屋塵螨種群5(“Der p5”)免疫原和4mg氫氧化鋁(WyethPharmaceuticals，Punchbowl，澳大利亞)在腹膜內致敏BALB/c小鼠。第一次致敏后7天，除了安慰劑對照組，用中國草藥煎劑喂養小鼠。
第一次致敏后3周，用Der p5再次激發小鼠。第二次加強注射后3天，將小鼠置于圓形的塑料容器中，在該容器中小鼠被0.1％Der p5噴霧進一步激發。
每次加強注射后，在第二天，從每只小鼠的尾靜脈采集50μl血樣。將血樣置于室溫1小時，然后離心。收集血清并保存于-80℃，用于ELISA(參見如下)分析。(E)Der p5-特異的IgG和IgE的測定通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定Der p5-特異的IgG和IgE的量。用100μl純化的Der p5包被蛋白質高度結合的培養板，所述Der p5在包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH8.2)中稀釋至5μg/ml的濃度。在4℃過夜孵育后，洗滌培養板三次，并用3％(重量/體積)BSA-PBS緩沖液于25℃封閉2小時。在重復試驗中，以1∶100的稀釋度使用血清來測量IgG，以1∶10的稀釋度使用血清測量IgE。在4℃過夜孵育后，加入在0.05％明膠緩沖液中稀釋的生物素結合的單克隆大鼠抗小鼠IgE mAb或大鼠抗小鼠IgG mAb，持續加入1小時。然后加入抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(1∶1000)，并在25℃孵育1小時，然后洗滌六次。加入磷酸酶底物對-硝基苯基磷酸氫二鈉進行顯色。在微量培養板自動讀數儀(Metertech，臺灣)中于405nm處對培養板進行讀數。讀數參考市售的異型標準物小鼠抗TNP mAb，IgG1(107.3)，IgG2a(G155-178)和IgE(IgE-3)。(F)通過RT-PCR(逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應)在脾細胞中表達IL-4基因在用Der p5免疫原致敏和激發動物，然后分別用列于表8的五種草藥煎劑或安慰劑處理后，從BALB/c小鼠中分離脾細胞。用Der p5(15μg/ml)孵育脾細胞4小時。用Tridzol試劑(Gibco BRL，Life Technologies，)美國)提取RNA。利用已市售(ready to go)的T-引發的第一鏈試劑盒(Pharmacia Biotch，美國)，使用提取的RNA生產cDNA。CDNA用作聚合酶鏈式反應(PCR)的模板。具有下述序列的IL-4特異引物對
5’-GAATGTACCAGGAGCCATATC-3’(序列號1)；和5’-CTCAGTACTACGAGTAATCCA-3’(序列號2)；用于PCR擴增和檢測IL-4基因。具有下述序列的HPRT(次黃嘌呤-鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶)特異引物對5’-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3’(序列號3)；和5’-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3’(序列號4)；用于PCR擴增和檢測HPRT。在下述條件下用熱循環儀(Thermo-cycler)進行PCR95℃變性5分鐘，然后95℃1分鐘，72℃1分鐘和55℃3分鐘進行35個循環。然后在2％瓊脂糖凝膠上電泳PCR產物。(G)統計學分析為評估Der p5激發后Der p5-特異的IgG，IgE和IL-4/HPRT比率的變化，重復測量ANOVA以比較各組之間的差異。分析變化后，用Duncan多程檢驗法來區分試驗和對照組之間的差異。p＜0.05用于表示統計學的顯著差異。結果如圖6所示，在Der p5激發，然后用五種傳統中國草藥煎劑處理的小鼠中，IgG和IgE的水平與對照(安慰劑)組無明顯的差異。在White-Draining粉末組(A)，little green-bluedragon煎劑組(B)，沿階草屬植物煎劑組(C)，Dryness-Clearing Lung-Rescuing煎劑組(D)，蘇子Qi-Downbearing煎劑組(E)和安慰劑組(F)中IgE的ELISA單元分別為99.3±23，106.3434，104.9±23，105.7±23，93.9±21和97.8±19。
圖6的結果證實五種傳統中國草藥煎劑不抑制IgE的產生。
如圖7所示，除了沿階草屬植物煎劑顯示IL-4/HPRT明顯減少，其余的傳統中國草藥煎劑對抑制IL-4基因產生無作用。
使用被D.P.免疫原“Der p5”致敏的BALN/c小鼠研究單獨草藥和STA-36對免疫原誘導的IgG，IgE和IL-4的作用，所述單獨草藥包括沿階草屬植物，半夏屬植物，生甘草屬植物和黨參。本實施例的試驗設計與實施例4(Example 5)中所描述的相同(見上文)。結果用免疫原Der p5激發，然后用沿階草屬植物，黨參，半夏屬植物和生甘草屬植物處理后，小鼠血清中IgG水平示于圖8中。結果指出，在沿階草屬植物，黨參和半夏屬植物處理組和安慰劑處理組之間IgG水平無顯著差異。生甘草屬植物處理后的IgG水平明顯低于安慰劑處理組的水平。
然而，如圖9所示，用Der p5激發，然后用沿階草屬植物，黨參和STA-36組合物處理后，小鼠血清中的IgE水平明顯低于安慰劑處理組的水平。事實上，用STA-36組合物處理后，IgE水平被減少了約超過2.5倍。半夏屬植物和生甘草屬植物處理后IgE水平與安慰劑處理的IgE水平無顯著差異。
如圖10所示，用Der p5激發，然后分別用沿階草屬植物、黨參、半夏屬植物和生甘草屬植物處理后，小鼠脾細胞中IL-4基因的表達(通過RT-PCR測量并表示為IL-4/HPRT比率)與用安慰劑處理組無顯著差異。然而，用STA-36處理后，IL-4基因的表達比率明顯低于安慰劑處理組的表達比率，表明STA-36可負調節IL-4基因的表達。
在21天結束時，給小鼠第二次加強注射Der p5。第二次加強注射48小時后，將小鼠置于圓形塑料容器中，在該容器中通過0.1％Der p5噴霧進一步激發小鼠。
激發后幾小時，用100mg/ml苯巴比妥麻醉小鼠。從尾靜脈或心臟采集血樣。將血樣置于室溫下1小時，然后1000rpm離心約10分鐘，以收集血清，保存于-80℃用于IgE和IgG2a的ELISA(參見下文)分析。1000rpm離心洗滌肺泡獲得的流體10分鐘。流體的上清液用于分析細胞因子，白細胞介素-4(IL-4)和干擾素γ(IFN-γ)。用PBS重新解離流體的沉淀(含細胞)，并用細胞離心涂片器(cytospin)計數炎性細胞。(D)Der p5特異的IgG和IgE的ELISA測定同酶聯免疫吸附測定(ELISA)確定Der p5特異的IgG和IgE的量。用100μl(10mg/ml)純化的Der p5包被高蛋白高度結合的微孔培養板(Costar，No.3590)，所述純化的Der p5在包被緩沖液中稀釋至5μg/ml的濃度。在4℃過夜孵育后，在含0.05％吐溫20的PBS溶液中(pH7.4)洗滌培養板三次，并在25℃用3％(重量/體積)BSA-PBS緩沖液封閉2小時。
在重復試驗中，IgG測量使用1∶100稀釋的血清，IgE測量使用1∶10稀釋的血清。4℃過夜孵育后，加入在0.05％明膠緩沖液中稀釋的生物素結合的單克隆大鼠抗小鼠IgE mAb(PharMinge 02122D)或大鼠抗小鼠IgGmAb(PharMinge，02022D)，持續加入2小時。然后加入抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(1∶1000)(Strptavidin-AP，PharMinge 13043E)，并在25℃孵育1小時，然后洗滌六次。加入磷酸酶底物對-硝基苯基磷酸氫二鈉(pNPP堿性磷酸酶底物，Sigma N-2770)進行顯色。在微量培養板自動讀數儀(ELISAreader，Dynex MRX)中于405nm處對培養板進行讀數。讀數參考市售的異型標準物小鼠抗TNP mAb，IgG1(107.3)，IgG2a(G155-178)和IgE(IgE-3)。(F)細胞因子(IL-4和IFN-γ)的FLISA測定用純化的抗細胞因子抗體(對于IL-4，使用2μg/ml PharMinge 18191D的IL-4抗體；對于IFN-γ，使用3μg/ml PharMinge 18181D的IFN-γ抗體)包被高蛋白高度結合的微孔培養板(Costar，No.3590)。用含3％BSA、pH7.4的PBS溶液包被培養板，然后用含0.05％吐溫20、pH7.4的PBS溶液洗滌。
然后，向微孔中加入100μl來自肺泡的流體的上清液和細胞因子標準物溶液，4℃過夜反應。然后，向微孔中加入100μl生物素-抗-小鼠-IL-4(PharMinge 18042D，1μg/ml)或生物素-抗-IFN-γ(PharMinge 18112D，1μg/ml)。反應2小時后，向微孔中攪動加入100μl抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(1∶1000)(streptavidin-AP，PharMinge 13043E)1小時。向微孔中加入200μl磷酸酶底物對-硝基苯基磷酸氫二鈉(pNPP堿性磷酸酶底物，Sigma N-2770)以顯色。在微量培養板自動讀數儀(ELISA讀數儀，DynexMRX)中于405nm對培養板進行讀數。(F)肺功能的測量向小鼠靜脈內注射100mg/ml苯巴比妥后，將PE 50管插入到氣管中。將該管與壓力檢測裝置連接以測量在吸氣和呼氣過程中呼吸壓力的變化。將另一個PE 50管插入到食道中以測量代替跨肺壓(TPP)的食道壓力。當將壓力信號傳遞至Bio-Recorder BR8000，信號被擴大，并轉換成氣體體積和跨肺壓，以計算氣管壓力。在試驗過程中，在尾靜脈保留注射乙酰膽堿(Ach)的針以誘導氣管壓力的變化。4.統計所有試驗中包含的數據以“平均值±SEM”來計算。轉變到PC100后，由乙酰膽堿誘導的氣管阻力變化以μg/kg測量。基于光吸收值顯示Ig E和Ig G2a測量。不成對的學生t檢驗(student’s t test)用來確定各組之間的差異顯著性。p＜0.05用來表示統計學上的顯著差異。
檢驗(1)粉末，(2)95％醇提取物，(3)水提取物和(4)50％醇提取物形式的西洋參對抑制IgE和IgG2a的藥用作用。如圖11所示，用50％醇提取的西洋參產生最佳的IgE抑制作用，盡管它對IgG2a減少的作用不如95％醇提取的西洋參。由于抗原誘導的免疫疾病主要是IgE介導的疾病，似乎在草藥組合物中使用50％醇提取的西洋參可為組合物提供最佳的IgE減少結果。然而，當將產自西洋參的醇提取物的顆粒加入到其余的顆粒中時，產自西洋參水提取物的顆粒提供抑制IgE和增加IgG的較好的作用。因此，在STA-4組合物中，西洋參從水中提取。
同樣檢測(1)粉末，(2)95％醇提取物，(3)水提取物和(4)50％醇提取物形式的長柄菊對抑制IgE，IgG2a，IL-4和IFN-γ的藥用作用。如圖12所示，用50％醇提取的長柄菊產生最佳的IgE和IgG2a抑制作用，盡管已證實長柄菊的水提取物對IL-4和IFN-γ具有最佳的抑制作用。然而，由于在研究過程中，長柄菊的水提取物誘導動物血液凝固，故不考慮將其用于人類。
圖13表示STA-36和STA-4的草藥組合物在小鼠中對IgG和IgE的作用的比較研究。如圖13所示，證實與對照相比，STA-36和STA-4的草藥組合物均抑制IgE，STA-4的作用遠比STA-36的作用強。STA-4對IgE的抑制作用在統計上顯著高于對照。然而，證實STA-36和STA-4均對IgG無抑制作用。但事實上，相反，與對照相比，STA-36和STA-4處理組中IgG水平均增加。
圖14表示STA-36和STA-4對小鼠肺功能的作用。STA-36和STA-4均比對照顯示肺功能的明顯改善(p＜0.05)。在兩者中，STA-4比STA-36顯示對肺功能更好的改善，盡管可能由于每個試驗組中不足的動物數(n)，使得STA-4和STA-36之間的數值無顯著差異。
圖15比較了STA-4與傳統哮喘藥物即酮替酚、潑尼松龍和aminophline對IgE，IgG，IL-4和IFN-γ的作用。結果顯示，僅STA-4表現IgE顯著減少和IgG、IL-4和IFN-γ的顯著增加，因此，推測STA-4比酮替酚、潑尼松龍和aminophline在治療哮喘方面具有更好的治療作用。
圖15中的結果還表明STA-4的治療作用可能與常規機制不同，所述常規機制即藥物抑制IL-4合成，其隨后間接降低IgE水平。在本發明中，攝入STA-4后，IL-4和IFN-γ均充分增加，因此IgE的減少不是由于IL-4的降低所致。正相反，STA-4處理后，IFN-γ(由TH1細胞產生和分泌)的量顯著增加。IFN-γ刺激B細胞合成并分泌IgG2a，這解釋了為什么在STA-4治療過程中IgG2a的量增加。因此，推測STA-4作用至少部分衍生自IgG2a，其依據與免疫原的第二次接觸，與免疫原相互作用，以減少過敏反應。
已詳細描述了本發明和通過參考優選的實施方案，對于本領域的技術人員是明顯的，即在未脫離本發明的范圍的條件下，可以進行修改和改變，所述本發明的范圍如后附的權利要求所限定。
序列表序列表<110>許清祥許順吉<120>治療免疫疾病的草藥藥物組合物<130>33211-176057<140>NO<141>NO<160>4<170>MICROSOFT WORD<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1gaatgtacca ggagccatat c21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2ctcagtacta cgagtaatcc a21<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>3gttggataca ggccagactt tgttg 25<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>4gattcaactt gcgctcatct taggc2權利要求
1.一種治療免疫疾病的藥物組合物，其包含有效量的沿階草屬植物塊莖；半夏屬植物塊莖；甘草根；和一種選自長柄菊，Herba Adenostemmatis和魚腥草的草藥。
2.依照權利要求1的藥物組合物，其中所述草藥是長柄菊。
3.依照權利要求2的藥物組合物，其中沿階草屬植物塊莖是水性提取物形式，所述半夏屬植物塊莖，所述甘草根和所述長柄菊是粉末形式。
4.依照權利要求2的藥物組合物，其中沿階草屬植物塊莖，半夏屬植物塊莖，甘草根和長柄菊的重量比約為3∶2∶1∶1。
5.依照權利要求2的藥物組合物，其還包含有效量的黨參。
6.依照權利要求2的藥物組合物，其中所述黨參是粉末形式。
7.依照權利要求5的藥物組合物，其中所述沿階草屬植物塊莖，所述半夏屬植物塊莖，所述甘草根，長柄菊和所述黨參的重量比約為3∶2∶1∶1∶1。
8.依照權利要求2的藥物組合物，其還包含有效量的西洋參。
9.依照權利要求8的藥物組合物，其中所述草藥是所述西洋參，其為粉末形式。
10.依照權利要求8的藥物組合物，其中所述沿階草屬植物塊莖，所述半夏屬植物塊莖，所述甘草根，所述長柄菊和所述西洋參的重量比為3∶2∶1∶1∶1。
11.依照權利要求8的藥物組合物，其中所述沿階草屬植物塊莖，所述半夏屬植物塊莖，所述甘草根，長柄菊和所述西洋參是水性提取物形式。
12.依照權利要求11的藥物組合物，其中每一種所述沿階草屬植物塊莖、半夏屬植物塊莖、甘草根、長柄菊和西洋參的水性提取物被單獨過濾和濃縮，以形成每種沿階草屬植物塊莖，半夏屬植物塊莖，甘草根，長柄菊和西洋參的濃縮物。
13.依照權利要求12的藥物組合物，其中每一種所述半夏屬植物塊莖、甘草根、長柄菊和西洋參的濃縮物被單獨制粒，以形成各自的顆粒；其中所述來自半夏屬植物塊莖，甘草根，長柄菊和西洋參的顆粒與所述沿階草屬植物塊莖的濃縮物相混合，以形成混合的顆粒。
14.依照權利要求13的藥物組合物，其中在制粒前，向每一種所述半夏屬植物塊莖，甘草根，長柄菊和西洋參的濃縮物中加入賦形劑。
15.依照權利要求14的藥物組合物，其中所述賦形劑是玉米淀粉。
16.依照權利要求11的藥物組合物，其中所述沿階草屬植物塊莖的水性提取物是沿階草屬植物的水提取物。
17.依照權利要求11的藥物組合物，其中所述半夏屬植物的水性提取物是半夏屬植物的水提取物。
18.權利要求11的藥物組合物，其中所述甘草根的水性提取物是甘草根的水提取物。
19.權利要求11的藥物組合物，其中所述長柄菊的水性提取物是長柄菊的醇提取物。
20.權利要求19的藥物組合物，其中所述長柄菊的醇提取物是50％醇提取物。
21.權利要求11的藥物組合物，其中所述西洋參的水性提取物是西洋參的水提取物。
22.依照權利要求12的藥物組合物，其中所述沿階草屬植物塊莖濃縮物的固體內容物為沿階草屬植物塊莖重量的約20-30％；所述半夏屬植物塊莖濃縮物的固體內容物為半夏屬植物塊莖重量的約15-25％；所述甘草根濃縮物的固體內容物為甘草根重量的約15-25％，所述西洋參濃縮物的固體內容物為西洋參重量的約19-29％，所述長柄菊濃縮物的固體內容物為長柄菊重量的約5-10％。
23.依照權利要求13的藥物組合物，其中所述半夏屬植物顆粒為半夏屬植物重量的約10-20％，所述甘草根顆粒為甘草根重量的約2-10％，所述西洋參顆粒約為西洋參重量的約5-15％，所述長柄菊顆粒為長柄菊重量的約9-15％。
24.依照權利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物治療患有免疫疾病的患者。
25.依照權利要求24的藥物組合物，其中所述免疫疾病包含至少一種選自過敏性鼻炎，過敏性結膜炎，過敏性哮喘，特異反應性濕疹，特異反應性皮炎，食物過敏，高IgE綜合征，和類風濕性關節炎。
26.一種制備依照權利要求3的藥物組合物的方法，其包含研磨半夏屬植物塊莖，甘草根和長柄菊，以形成草藥粉末；在水中煎煮沿階草屬植物塊莖，以形成沿階草屬植物塊莖的水性提取物；將所述草藥粉末與所述沿階草屬植物塊莖的水性提取物混合，以形成一種草藥混合物。
27.依照權利要求26的方法，其還包含研磨黨參，以形成黨參粉末；并將所述黨參粉末與所述草藥混合物相混合。
28.依照權利要求26的方法，其還包含研磨西洋參，以形成西洋參粉末，并將所述西洋參粉末與所述草藥混合物相混合。
29.依照權利要求26的方法，其中所述草藥混合物被制成顆粒。
30.依照權利要求29的方法，其中所述制粒的草藥混合物被包入膠囊。
31.一種治療患有免疫疾病的患者的方法，其包含對所述患者給藥有效量的依照權利要求2的藥物組合物。
32.依照權利要求31的方法，其中所述免疫疾病選自過敏性鼻炎，過敏性結膜炎，過敏性哮喘，特異反應性皮炎，食物過敏，高IgE綜合征，特異反應性濕疹，和類風濕性關節炎。
33.一種免疫疾病藥物，其包含有效量的依照權利要求2的藥物組合物。
34.一種制備依照權利要求11的藥物組合物的方法，其包含通過煎煮，在水中提取沿階草屬植物塊莖；過濾并濃縮所述沿階草屬植物塊莖的水提取物，以形成沿階草屬植物塊莖的濃縮物；通過煎煮，在水中提取半夏屬植物塊莖；過濾并濃縮所述半夏屬植物塊莖的水提取物，以形成半夏屬植物塊莖的濃縮物；通過噴霧-干燥制粒所述半夏屬植物塊莖的濃縮物；通過煎煮，在水中提取甘草根；過濾并濃縮所述甘草根的水提取物，以形成甘草根的濃縮物；通過噴霧-干燥制粒所述甘草根的濃縮物；回流條件下，在醇中提取長柄菊；過濾并濃縮所述長柄菊，以形成長柄菊的濃縮物；通過噴霧-干燥制粒所述長柄菊的濃縮物；將半夏屬植物塊莖、甘草根、西洋參和長柄菊顆粒與沿階草屬植物塊莖濃縮物相混合，以形成混合的顆粒。
35.依照權利要求34的方法，其中所述長柄菊的醇提取物是50％醇提取物。
36.依照權利要求34的方法，其中在制粒前，向每一種所述半夏屬植物塊莖，甘草根，和長柄菊濃縮物中加入賦形劑。
37.依照權利要求34的方法，其中所述賦形劑是玉米淀粉。
38.依照權利要求34的方法，其還包含通過煎煮在水中提取西洋參；過濾并濃縮所述西洋參的水提取物，以形成西洋參的濃縮物；通過噴霧-干燥制粒所述西洋參濃縮物；和將所述西洋參的所述顆粒與混合的顆粒相混合。
39.依照權利要求34的方法，其中所述沿階草屬植物塊莖的所述濃縮物的固體內容物為所述沿階草屬植物塊莖重量的約20-30％；所述半夏屬植物塊莖的所述濃縮物的固體內容物為所述半夏屬植物塊莖重量的約15-25％；所述甘草根的所述濃縮物的固體內容物為所述甘草根重量的約15-25％；所述西洋參的所述濃縮物的固體內容物為所述西洋參重量的約20-30％；所述長柄菊的所述濃縮物的固體內容物為所述長柄菊重量的約5-10％。
40.依照權利要求34的方法，其中所述半夏屬植物塊莖的顆粒為所述半夏述植物塊莖重量的約10-20％，所述甘草根的所述顆粒為所述甘草根重量的約2-10％，所述西洋參的所述顆粒為所述西洋參重量的約5-15％，所述長柄菊的所述顆粒為所述長柄菊重量的約9-15％。
41.依照權利要求34的方法，其中在約55℃溫度和約30托真空條件下，通過減壓濃縮來濃縮每一種所述濃縮物。
42.依照權利要求34的方法，其中在約105℃的入口溫度和約76-77℃的出口溫度下，噴霧-干燥每一種所述濃縮物。
43.一種治療患有免疫疾病的患者的方法，其包含對所述患者給藥有效量的依照權利要求11的藥物組合物。
44.依照權利要求43的方法，其中所述免疫疾病選自過敏性鼻炎，過敏性結膜炎，過敏性哮喘，特異反應性皮炎，食物過敏，高IgE綜合征，特異反應性濕疹，和類風濕性關節炎。
45.一種免疫疾病藥物，其包含有效量的依照權利要求11的藥物組合物。
全文摘要
本發明提供了藥物組合物，其包含沿階草屬植物(沿階草屬植物塊莖)，半夏屬植物(半夏屬植物塊莖)，生甘草屬植物(甘草根)和一種選自下述物質的草藥長柄菊，臺灣adenostema，或魚腥草。備選地，可以加入第五種草藥，其可以是黨參或西洋參。這些藥物組合物對于治療患有免疫疾病，特別是IgE介導的疾病的患者是有效的，所述IgE介導的疾病例如哮喘，特異性反應性濕疹，特異性反應性皮炎，過敏性鼻炎和類風濕性關節炎。本發明還提供了制備藥物組合物的方法。
文檔編號A61K36/185GK1479625SQ01820422
公開日2004年3月3日 申請日期2001年12月3日 優先權日2000年12月14日
發明者許清祥, 許順吉 申請人:順天堂藥廠股份有限公司