專利名稱：血卟啉單甲醚在治療眼科疾病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，更具體地涉及利用血卟啉單甲醚，通過對眼施加光動力治療(PDT)而治療眼科疾病的應用。
背景技術：
視力喪失是與衰老和各種眼病相伴隨的常見問題。衰老和其他病因往往引起角膜、虹膜、視網膜或脈絡膜上有害的新血管形成的發生，造成視力下降乃至視力喪失。在很多已知的眼病，包括黃斑變性、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視和炎癥性疾病中，脈絡膜新血管形成導致出血和纖維化，最終伴有視力喪失。
與年齡相關的黃斑變性(AMD)是老年人視力下降的主要原因，其中10％的AMD病人伴隨脈絡膜新血管形成，導致急劇的視力喪失。據統計，AMD造成老年人新失明中的80％是由脈絡膜新血管形成引起的。
目前對AMD引起的脈絡膜新血管形成，主要采用激光光凝(固)法治療，該方法可以封閉新生血管，延緩視力喪失。但激光光凝的同時也破壞了新生血管周圍的正常脈絡膜組織以及內層的視網膜組織，導致視力下降，患者往往留有萎縮性性瘢痕和視覺盲點。激光光凝法的另一個問題是大部分病人因為新生血管彌散、邊界不清而不適合用激光光凝法治療，或療效不佳，復發率高。
光動力療法是給患者施以光活性化合物，光敏劑在新生血管部位富集，再以低強度激光照射，激發光敏劑使之產生光化學反應，選擇性的封閉新生血管。這一方法選擇性更強，激光強度低，對周圍正常組織損傷小，有望成為治療AMD的有效手段。
用于光動力治療的光敏劑有血卟啉衍生物(HPD)、苯并卟啉衍生物(BPD)、二氫卟吩e6單天冬氨酸酰胺(Npe6)、磺酸鋁酞菁(CASPc)、中介四(間羥基苯基)-二氫卟吩(mTIIPC)、錫乙基初紫紅素(SnEt2)、5-氨基乙酰丙酸(ALA)等，用于腫瘤、皮膚病的光動力治療。然而，這些用于腫瘤、皮膚病的光動力治療的光敏劑并不十分適合用于治療眼科疾病。
美國專利5798349以及相應的中國專利97192957公開了綠卟啉(greenporphyrins)在光動力治療AMD及其他脈絡膜新血管形成上的應用。然而其治療效果仍然不令人滿意。
因此，本領域迫切需要開發新的治療劑和治療方法，以便有效治療因有害血管形成而導致的各種眼科疾病。
發明內容
本發明的目的就是提供一種新的治療劑和治療方法，它們可有效治療因有害血管形成而導致的各種眼科疾病。
在本發明的第一方面，提供了一種血卟啉單甲醚的用途，它被用于制備治療眼科疾病的藥物。
在另一優選例中，所述眼科疾病是因有害的新生血管形成而導致的疾病。
在另一優選例中，所述的新生血管形成發生在角膜、虹膜、視網膜或脈絡膜。更佳地，所述的新生血管形成發生在脈絡膜上。
在另一優選例中，所述的眼科疾病選自下組黃斑變性、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視、或炎癥性疾病。
在另一優選例中，所述的血卟啉單甲醚為如下結構式的化合物 式中，R1為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基；R2為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基。
在另一優選例中，所述藥物的給藥劑量為0.1-100mg/kg體重，按血卟啉單甲醚計算。
在另一優選例中，所述的治療是光動力治療。
在另一優選例中，所述光動力治療條件是照射的光通量為50-200焦耳/cm2，光照度為50-800mW/cm2，波長為630±20nm。
在本發明的第二方面，提供了血卟啉單甲醚的用途，它被用作光動力治療眼科疾病的光敏劑。
圖1顯示了血卟啉單甲醚的結構式。
圖2A和2B顯示了血卟啉單甲醚在雞胚尿囊絨膜(CAM)模型上的效果。
圖3顯示了雞胚尿囊絨膜(CAM)模型實驗組、對照組一級血管、二級血管計數。
圖4顯示了脈絡膜新生血管(CNV)模型熒光造影。
圖5顯示了脈絡膜新生血管(CNV)模型組織切片。
圖6A和6B顯示了血卟啉單甲醚在脈絡膜新生血管(CNV)模型上的效果。其中圖6A為對照組組織切片，箭頭所指為脈絡膜新生血管。圖6B為實驗組組織切片，箭頭所指為脈絡膜新生血管，血管內部已形成血栓。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，篩選了大量化合物，發現化合物血卟啉單甲醚特別適合用于治療眼科疾病。血卟啉單甲醚的最佳吸收波長630nm，清除時間短，光敏感性24小時可以消退，因此適合作為光動力療法治療眼科疾病的光敏劑。在此基礎上完成了本發明。
光活性化合物適合于本發明的化合物是血卟啉單甲醚。許德余、陳文輝等在《中國激光醫學雜志》(1993，23-7)和申請號為01131939的中國專利中公開了血卟啉單甲醚的理化性質、制備方法及其在治療腫瘤中的應用；陳文輝、許德余等在《第二軍醫大學學報》(1990，11118-122)發表了血卟啉單甲醚在荷瘤小鼠體內的分布顧瑛、劉光凡等在《中國激光醫學雜志》(2000，Vol9，1期)發表了血卟啉單甲醚在在動脈組織的吸收和分布特性、血管平滑肌對血啉甲醚的吸收特性，在《中國激光醫學雜志》(2000，Vol9，3期)發表了血卟啉單甲醚治療鮮紅斑痣的應用。在此全部公開作為參考。
具體地，適合于本發明的光活性化合物具有如下結構式 其中R1為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基；R2為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基。較佳地，當R1為1-羥基-乙基時，R2為1-甲氧基-乙基，；當R1為1-甲氧基-乙基時，R2為1-羥基-乙基。
血卟啉單甲醚也可與其他的光活性化合物聯合使用；但治療的有效性依賴于光被光活性化合物吸收，因此，如果使用混合物，則以具有相似的最大吸收峰的化合物混合使用為佳。
治療機理本發明涉及用光動力治療眼科疾病。光動力學治療方案導致有害的新血管形成(特別是脈絡膜的新血管形成)縮減，從而對相關的眼科疾病起到治療作用，改善患者視力。
在本發明的方法中，給需要治療的患者服用適合的光活性化合物，其量足以使患者眼內的光活性化合物達到有效濃度。服用后經過一段時間，使有效濃度的化合物聚集在眼內所需區域后，用被該光活性化合物吸收的光照射該區域。光活性化合物被光激發，產生活性氧和自由基，引起病變區域細胞光化學損傷，封閉病變部位的新生血管，從而治療因有害血管形成而導致的各種眼科疾病，最終改善患者的視力。
給藥和劑量光活性化合物可以各種途徑給藥，如口服、非腸道給藥或直腸給藥，或可將化合物直接放如入眼中。以非腸道給藥為宜，如靜脈內、肌肉內或皮下注射。以靜脈注射為最好。
光活性化合物的劑量可以根據給藥方式、制劑類型、是否偶聯靶向配體而有很大的變化。一般認為，在光活性劑的制劑、給藥方式和劑量水平之間有關聯。通常，血卟啉單甲醚的典型劑量范圍為0.1-100mg/kg，較佳的劑量范圍為0.5-50mg/kg，更佳的劑量范圍為1-10mg/kg。本領域技術人員也可以通過實驗確定合適的劑量。
在本發明中用于有效、選擇性光動力學治療的各種參數是相互關聯的。因此，可以相對于其他參數(例如光動力學治療中所使用的光通量、光照度、持續時間和劑量、給藥與光照射之間的時間間隔等)而調整劑量。使用這些參數都應調整到能顯著提高視力而不產生正常眼組織的明顯損害為宜。本領域技術人員能夠通過實驗確定合適的參數。
換言之，當光活性化合物的劑量降低時，封閉脈絡膜新生血管組織的光通量有增加的趨勢；反之需要降低光通量，則需要增加光活性化合物的劑量或增加靶向性促進增加病變部位光活性化合物的富集程度。
光治療方法光治療參數有關的某些術語在不同的作者和出版物中有所不同。比如光通量，也稱光劑量、光能量密度；光照度，也稱功率強度、功率密度。這些術語是本領域的技術人員使用并理解的，在此加以說明。
在光活性化合物給藥后，將眼的靶組織在被選擇的藥物吸收波長下進行照射。對于血卟啉單甲醚，所選的波長范圍一般在630±20nm左右，更佳地為在630±10nm左右，該范圍波長在機體組織內的穿透力比較好。
照射的結果導致光活性化合物處于激發狀態，并與其他化合物相互作用，形成單線態氧(Singlet Oxygen)和其他自由基，引起血管上皮細胞結構破壞。單線態氧和其他自由基主要損傷細胞膜結構，包括細胞膜、線粒體膜、溶酶體膜和核膜。血管上皮細胞損傷引發后續的血小板凝聚、脫顆粒和血栓形成，造成血管的堵塞和封閉。
根據組織的類型、靶組織深度和其上流體或血液的量，照射的光通量可有很大變動。但較佳的為50-200焦耳/cm2。
光照度一般變化于50-800mW/cm2，以約100-600mW/cm2為佳。然而，選擇使用較高的光照度，可以縮短治療時間而達到同樣的效果。
光活性化合物給藥后至光治療之間的最適時間間隔也根據給藥方式、給藥形式和制劑類型而不同。光敏劑給藥后的時間間隔從1分鐘到2小時，較佳的為5-30分鐘，更佳的為10-25分鐘。
可治療的眼科疾病本發明提供了一種光動力治療眼科疾病的方法，包括給需要這種治療的患者服用足以使受治療患者眼中富集足夠量光敏劑的光活性化合物制劑；允許足夠的時間使有效量的光活性化合物富集于患者眼中；用適合光敏劑吸收的光照射眼睛。
因為在本發明的治療方法中，利用血卟啉單甲醚，通過光動力療法有效地減少或消除角膜、虹膜、視網膜或脈絡膜上有害的新血管形成，因此本發明方法可用于治療因有害血管形成而導致的各種眼科疾病。代表性眼科疾病包括(但并不限于)黃斑變性(與年齡相關的黃斑變性以及其他黃斑變性)、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視和炎癥性疾病。
治療的評價光動力治療的效果在動物模型上可用組織學切片觀察內皮細胞的損傷和脈絡膜新生血管的封閉情況。典型的，新生血管的破壞表現為血管內皮細胞胞漿內出現空泡，細胞核皺縮異常，血管腔內可見血小板聚集和血凝塊的形成。
另一種方法是在治療后特定的時間用血管造影技術觀察新血管減少。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1血卟啉單甲醚和治療劑的制備A.血卟啉單甲醚的制備按CN 01131939的中國專利申請中所述的方法，將20克3，8-二(1-溴乙基)次卟啉IX氫溴酸鹽與3000毫升的甲醇/水混合液攪拌反應2小時，反應液以10mol/L的氫氧化鈉調節pH至13，攪拌4小時，再以冰乙酸調節反應液的pH至4-5，析出沉淀。布氏漏斗濾集析出的沉淀，水洗，干燥，得19.5克粗品。經硅膠柱層析分離純化得3.9克血卟啉單甲醚(圖1)。
重復上述步驟，獲得約20克血卟啉單甲醚。
B.治療劑的制備稱取10克血卟啉單甲醚原料藥，以適量0.2mol/L氫氧化鈉水溶液充分攪拌溶解，然后用0.2mol/L鹽酸調節溶液pH至7-8，加入適量的甘露醇，再以注射用水定容至400毫升；無菌過濾，分裝成每瓶含100毫克，置冷凍干燥機中冷凍干燥，加塞封口，貼標簽。使用時以生理鹽水復溶至所需濃度給藥。
實施例2CAM模型用于光動力治療效果體內測定CAM模型的建立采用以下方法37℃孵化箱，氣室向上，每天轉動3～4次，至孵蛋第9天，消毒種蛋表面后在氣室頂端打1～2mm小孔，在距胎頭前1cm、兩條前卵黃靜脈之間的卵殼投影部位標記1.0cm×1.5cm的長方形區域，磨切透卵殼，在卵殼膜上輕輕劃破直徑約1mm的小孔。滴加少許無菌純凈水分離小孔邊緣的卵殼膜，將無菌的直徑為6mm的微孔濾膜載體放在CAM的血管最少處。
然后在載體中央各加入10ul濃度為1mg/ml實施例1制備的血卟啉單甲醚，對照組加入10ul生理鹽水。加藥后15分鐘用金蒸汽激光進行照光，光斑直徑2000μm，功率密度100mW/cm2，照光時間200s，能量密度20J/cm2。加藥后，用無菌透明膠封窗，標記后再放入37.8℃的孵箱內孵育3天。光處理3天后，每蛋注入1∶1的甲醇、丙酮等量混合固定液2.5ml。室溫下固定20分鐘，待CAM上血管內的血液凝固后，揭去封窗的透明膜，剪除CAM水平以上的蛋殼，以濾膜載體為中心把CAM剪下，放入盛有少量水并鋪有濾紙的平皿里展開，陰干，連同濾紙保存，如圖2A和2B所示。
解剖顯微鏡下以相同放大倍數計數血管，以實驗部位邊緣(即微孔濾膜載體邊緣)1mm范圍內為一級血管，以實驗部位邊緣5mm處為二級血管，凡屬趨向性生長的血管，即以載體為中心發出，與濾膜半徑的夾角小于45度者均予計數；而穿行、繞行的血管則不算在內。一、二級血管分別觀察計數。對照組一級、二級血管數分別為34.7和45.2，實驗組分別為21和32.5，實驗組顯著少于對照組。結果如圖3所示。
實施例3CNV小鼠模型的建立CNV模型按以下方法建立隨機選取20只成年雄性C57BL-6J小鼠，體重均為25g-26g。腹腔內注射0.3％戊巴比妥鈉200μL麻醉小鼠，2％托品卡胺和10％新福林散瞳。經裂隙燈及角膜接觸鏡，將激光(波長810nm、直徑75μm、照射時間0.1s、功率140mW)導入小鼠眼里。在激光照射后1周進行熒光素眼底血管造影(fundus fluorescence angiography，FFA)，選取光凝點無熒光滲漏，光凝點呈乳白色(如圖4)的動物9只，進行組織切片觀察確證造膜情況或者進一步進行光動力治療試驗。
取上述動物1只，用過量戊巴比妥鈉處死，摘取眼球，分別在2％戊二醛和4％多聚甲醛中固定，剖切眼球，通過解剖鏡辨別激光點，將組織條塊以1％四氧化鋨固定，乙醇梯度脫水，環氧乙烷置換，環氧樹脂包埋，連續切片，甲苯胺藍染色，光鏡觀察。
光鏡下可見視網膜下形成巨大管腔的新生血管，色素上皮細胞也異常增殖(圖5)。表明成功建立了CNV小鼠模型。
實施例4血卟啉單甲醚在CNV小鼠模型上的效果試驗方法按實施例3制備的CNV模型小鼠4只，尾靜脈注射劑量為10mg/kg的血啉甲醚凍干制劑。注射后15分鐘用金蒸汽激光進行照光，光斑直徑2000μm，功率密度100mW/cm2，照光時間200s，能量密度20J/cm2。另取實施例3制備的CNV模型小鼠4只，尾靜脈注射相同劑量的生理鹽水，作為對照。
結果判定一周后，用過量戊巴比妥鈉處死小鼠，摘取眼球，分別在2％戊二醛和4％多聚甲醛中固定，剖切眼球，通過解剖鏡辨別激光點，將組織條塊以1％四氧化鋨固定，乙醇梯度脫水，環氧乙烷置換，環氧樹脂包埋，連續切片，甲苯胺藍染色，光鏡觀察。
結果對照組可見大量脈絡膜新血管生成，色素上皮細胞開始包繞新生血管(如圖6A)。
實驗組可見脈絡膜毛細血管血栓形成，視網膜色素上皮層排列失去正常的連貫性，外節排列紊亂、空泡化，外顆粒層細胞固縮，視網膜內層尚正常(如圖6B)。
實施例2和4的結果表明，血卟啉單甲醚可有效抑制有害血管如脈絡膜新血管生成，從而可有效治療因有害血管形成而導致的各種眼科疾病，如角膜、虹膜、視網膜或脈絡膜上有害的新血管形成導致的眼病，特別是年齡相關性黃斑變性。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.血卟啉單甲醚的用途，其特征在于，用于制備治療眼科疾病的藥物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述眼科疾病是因有害的新生血管形成而導致的疾病。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的新生血管形成發生在角膜、虹膜、視網膜或脈絡膜。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的新生血管形成發生在脈絡膜上。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的眼科疾病選自下組黃斑變性、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視、或炎癥性疾病。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血卟啉單甲醚為如下結構式的化合物 式中，R1為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基；R2為1-羥基-乙基、1-甲氧基-乙基。
7.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥劑量為0.1-100mg/kg體重，按血卟啉單甲醚計算。
8.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治療是光動力治療。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述光動力治療條件是照射的光通量為50-200焦耳/cm2，光照度為50-800mW/cm2，波長為630±20nm。
10.血卟啉單甲醚的用途，其特征在于，用作光動力治療眼科疾病的光敏劑。
全文摘要
本發明公開了血卟啉單甲醚用于制備治療眼科疾病的藥物的新用途。血卟啉單甲醚的最佳吸收波長630nm，清除時間短，光敏感性24小時可以消退，因此特別適合作為光動力療法治療眼科疾病的光敏劑。血卟啉單甲醚可有效治療因有害血管形成而導致的各種眼科疾病，如黃斑變性、眼組織胞漿菌病綜合癥、近視、或炎癥性疾病等。
文檔編號A61P27/02GK1589791SQ0315055
公開日2005年3月9日 申請日期2003年8月25日 優先權日2003年8月25日
發明者陳文輝, 陶紀寧, 熊乾斌, 許德余, 李軍, 蘇勇 申請人:上海復旦張江生物醫藥股份有限公司