專利名稱：用于治療il-6產生所致疾病的藥物組合物的制作方法
本申請是1995年10月20日提交的申請號為95196357.0、發明名稱為“用于治療IL-6產生所致疾病的藥物組合物”的發明專利申請的分案申請。
本發明涉及用于預防或治療因白介素-6(IL-6)產生所致疾病的藥物組合物，該組合物包括對抗白介素-6受體(IL-6R)的抗體(抗-IL-6R抗體)。
背景技術：
IL-6為一種多功能細胞因子，目前認為在免疫，血液及急性期反應的各個階段都有該因子參與(Taga，T.et al.，Critical Reviews inImmunol.11265-280，1992)，該因子在許多疾病的發病中也起著重要的作用，例如件隨漿細胞增多的疾病如類風濕(Hirano，T.et al.，Eur.J.Immunology 181797-1801，1988；Houssiau，F.A.et al.，Arth Rheum.31784-788，1988)，Castleman氏病(Yoshizaki，K.et al.，Blood 741360-1367，1989；Brant，S.J.et al.，J.Clin.Invest.86592-599，1990)，腎小球膜細胞增殖性腎炎(Ohta，K.et al.，Clin.Nephrol.(Germany)38185-189，1992；Fukatsu，A.et al.，Lab.Invest，6561-66，1991；Horri，Y.et al.，J.Immunol.1433949-3955，1989)，伴隨腫瘤生長的惡病質(Strassmann，G.et al.，J.Clin.Invest.891681-1684，1992)等，另外還可做為生長因子引起多發性骨髓瘤。
在H-2LdhIL-6轉基因小鼠(IL-6 Tgm)中，由于其通過基因工程的方法使人類IL-6(hIL-6)表達過多，已經觀察到IgG漿細胞增多，腎小球膜細胞增殖性腎炎，貧血，血小板減少，出現自身抗體等現象或疾病(Miyai，T，et al.，a presentation at the 21st Meeting ofJapan Immunology Society“Hematological changes in H-2LdhIL-6transgenic mice with age，”1991)，上述這些表明IL-6與多種疾病的發生有關。然而現在還不知道抗白介素-6受體的抗體對白介素產生而引起的疾病是否有效。
本發明披露依照本發明，本發明提供了用來預防或治療由IL-6所致疾病的藥物組合物。
為了解決上述的問題，本發明提供一種用來預防或治療由IL-6產生所致疾病的藥物組合物，該組合物含有抗白介素-6受體抗體。
附圖的簡要說明
圖1所示為每組動物體重增加的變化。
圖2所示為每組尿蛋白陽性率的變化。除組1和組3，其它組尿蛋白陽性率為零。
圖3所示為每組血紅蛋白濃度的變化。
圖4所示為每組血紅細胞數的變化。
圖5所示為每組血小板的變化。
圖6所示為每組白細胞的變化。
圖7所示為每組血清中IgG1濃度的變化。
圖8所示為組1到組5人IL-6濃度的變化。
圖9為在組1和組2通過熒光抗體技術使用對照抗體IgG和Gr-1抗體對細胞進行分類的結果。
圖10為在組6和組7通過熒光抗體技術使用對照抗體IgG和Gr-1抗體對細胞進行分類的結果。
圖11為每組動物在實驗結束時脾臟的重量。
圖12為每組動物體重的變化。
圖13為在實驗的第11天，小鼠血中甘油三酯的濃度。
圖14為在實驗的第15天，小鼠的血糖濃度。
圖15為在實驗的第11天，小鼠血中鈣離子的濃度。
圖16所示為腫瘤對照組小鼠的生存率。
圖17為實驗開始后的第10天和12天小鼠的體重。
圖18為實驗開始后的第10天和第12天，小鼠血中的鈣離子濃度。
詳細的說明白介素-6產生所致疾病包括有漿細胞增多性疾病如類風溫病及Castleman氏病；高免疫球蛋白血；貧血；腎炎如小球系膜增殖性腎炎；惡病質等。
用于本發明中的白介素-6受體抗體，只要能阻止IL-6的信號傳導并抑制IL-6的生物活性就可以是任何一種來源或類型的抗體(單克隆，多克隆)。但最好是由哺乳類動物產生的單克隆抗體。抗體通過抑制IL-6與IL-6R的結合，阻斷IL-6的信號傳導并抑制其生物活性。
產生單克隆細胞的動物種類可為哺乳類動物的任何一種，可以是人類抗體或者是除人以外的一種動物的抗體。從容易制備這個角度考慮，除人以外的單克隆抗體，還是以兔或鼠類產生的單克隆抗體較好。鼠類產生的單克隆抗體較好，包括小鼠，大鼠，豚鼠等，但不局限于此。
這樣的白介素-6受體抗體包括例如MR16-1抗體(Tamura，T.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9011924-11928)，PM-1抗體(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.1432900-2906，1989)等。
單克隆抗體的制備基本上可通過下述的本領域已知方法來進行。采用常規的方法免疫動物，即使用IL-6R做為免疫抗原，然后通過常規的細胞融合方法將所得的免疫細胞與已知的母細胞融合，通過常規的篩選方法篩選產生抗體的細胞。
更具體地講，單克隆抗體是通過下述的方法來制備的。如免疫抗原可通過歐洲專利申請EP325474中所述的采用人IL-6R基因序列來得到。先將人IL-6R基因序列插入一個已知的表達載體內，以轉化適合的宿主細胞，之后純化宿主細胞或培養液上清產生的所要的IL-6R蛋白質，用該純化的IL-6R蛋白質做為免疫抗原。
另外，也可采用與上述人IL-6R基因序列相同的方法，使用日本未審查專利公開3(1991)-155795中所述的小鼠IL-6R基因序列來得到上述的來源于小鼠的免疫抗原。
做為IL-6R，除了細胞膜上表達的外，還可有從細胞膜解吸的IL-6R(sIL-6R)也可做為抗原。sIL-6R主要是由與細胞膜結合的IL-6R的細胞外部分組成，其與和細胞膜結合的IL-6R不同之處sIL-6R缺乏貫穿膜的區或者貫穿膜的區及細胞內區都缺乏。
免疫抗原免疫的哺乳類動物種類沒有特別限制，但是如考慮到其與用做細胞融合的母細胞的相容性，優選使用小鼠，大鼠，豚鼠及兔等哺乳類動物。
可根據本領域技術人員已知的方法用免疫抗原免疫動物。例如，常用的方法是經腹腔或皮下給哺乳類動物注射免疫抗原。更具體地講，將免疫抗原用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)，生理鹽水稀釋或混懸至一定的體積，然后如需要再與適量的佐劑如弗氏完全估劑混合并乳化，此后優選每4-21天給哺乳類動物注射該乳劑幾次。此外，在用免疫抗原免疫動物時可使用適當的載體。
在如上所述免疫動物且測定血清中抗體濃度已達到所希望的濃度后，從哺乳類動物取出免疫細胞并進行融合。具體提到的取出的免疫細胞以脾細胞較好。
本發明中，用于與免疫細胞融合的配對母細胞優選骨髓瘤細胞，其包括許多種已知的細胞系，如P3(p3x63Ag8.653)(J.Immunol 1231548，1978)，p3-U1(Current Topicsi Micro-biology and Immunology811-7，1978)，NS-1(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)，MPC-11(Cell 8405-415，1976)，SP2/0(Nature 276269-270，1978)，FO(J.Immunol. Meth.351-21，1980)，S194(J.Exp.Med，148313-323，1978)及R210(Nature 277131-133，1979)等。
骨髓瘤細胞與所述免疫細胞的融合可按照Milstein等人所述的方法來進行(Milstein et al.，Methods Enzymol.733-46，1981)。
更具體地講，上述細胞融合可在普通的營養液中加入細胞融合促進劑來進行。為了增加細胞融合的效率可使用聚乙烯乙二醇及Sendai病毒等做為細胞融合促進劑，還可按需要直接加入二甲基亞砜等作為佐劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞的比值優選多于骨髓瘤細胞的1-10倍免疫細胞。用于上述細胞融合的液體細胞培養液可使用RPMI1640液體培養液及MEM液體培養液，這些培養液非常適合骨髓瘤細胞系的生長，也可使用普通的培養肉湯進行細胞培養，另外還可使用血清添加劑如小牛血清(FCS)等。
制備所需的融合細胞(雜交瘤)需在上述的營養肉湯中按上述的比例加入免疫細胞及骨髓瘤細胞并充分混合，另外還需要向培養液中加入事先預熱至37℃的PEG溶液。PEG溶液中PEG的平均分子量應在1000至6000這個范圍，而PEG的濃度為30至60％(w/v)。在按順序加免適宜培養介質后，進行離心以去除上清及細胞融合劑等，這些物質均對雜交瘤生長不利。
可通過常規的篩選培養液培養來篩選上述的雜交瘤，該篩選培養液如HAT液體培養液(含有次黃嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶的液體培養液)。將在HAT培養液中進行的細胞培養持續進行足夠的時間，以使除雜交瘤以外的細胞(非隔合細胞)死亡，通常這樣的細胞培養需要數天乃至數周。隨后采用常規的有限稀釋方法篩選并克隆產生所需抗體的雜交瘤。
可通過常規的液體培養液傳代培養所得的產生單克隆抗體的雜交瘤，并可在液氮中長期保存該雜交瘤。
為了獲得雜交瘤產生的單克隆抗體，可采用下述方法，如按照常規方法培養雜交瘤，然后取培養液上清，或者將雜交瘤植入并生長在一種合適的哺乳類動物體內，通過腹水等獲取抗體。前一種方法可獲取高純度抗體，而后一種方法則可獲取大量抗體。
另外，上述方法所得的單克隆抗體可采用常規的方法進行純化，如鹽析，凝膠過濾，及親和層析等。
可采用常規的免疫方法如放射免疫分析，酶免疫分析(EIA，ELISA)，熒光抗體方法(免疫熒光分析)等來確定所得單克隆抗體識別抗原的高親和力及高度特異性的能力。
本發明中所使用的單克隆抗體并不局限于雜交瘤產生的單克隆抗體，也可是為減小對人的異種免疫原性而經人工改造過的單克隆抗體。例如使用含有小鼠單克隆抗體可變區及人抗體不變區的嵌合抗體。可通過已知的方法(主要是基因工程的方法)來制備嵌合抗體。
另外，本發明也可使用重構的人類抗體。在該抗體中可由除人類抗體外的其它哺乳動物抗體如小鼠抗體的互補決定簇區域替換人類抗體的互補決定簇區域。可采用已知的基因工程的通用方法來制備該種類型抗體。使用該方法可獲取用于本發明中的重構人類抗體。
如必要，可替換抗體可變區域中框架區域(FR)的氨基酸，這樣可使重建過的人類抗體的互補決定簇區域形成一合適的抗原結合位點(Sato et al.，Cancer Res.531-6，1993)。這種重構人類抗體舉例有如人類化PM-1(hPM-1)抗體(見國際專利申請WO 9219759)。
編碼如Fab或Fv，單鏈Fv(ScFv)(其中Fv的H鏈和L鏈已通過連結劑連結起來)的抗體片段的基因，可在合適的宿主細胞內構建并表達，只要該片段可結合抗原并抑制IL-6的活性(參見Bird et al.，TIBTECH 9132-137，1991；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883，1988)。進一步講，上述抗體的重構V區可用于制備Sc H鏈和L鏈的Fv來制備ScFv。
只要能阻斷IL-6信號傳導，有效治療由IL-6產生所致疾病，本發明中用于預防或治療由IL-6產生所致疾病的藥物組合物包括活性成分為抗IL-6受體的抗體。
用于預防或治療由IL-6產生所致疾病的藥物組合物優選經非腸道途徑給藥，例如經靜脈，肌內，腹膜內或皮下注射等途徑給藥，即可全身也可局部用藥。此外，藥物組合物可與至少一種藥物載體或稀釋液混合為藥物組合物或藥盒形式。
雖然本發明中藥物組合物的劑量可根據病情，病人年齡或給藥方式而有所不同，但還是需要選用合適的劑量。例如，每個病人可在1至1000mg的范圍內有最多分4種不同的劑量供選用。也可按照1至10mg/kg/周的劑量進行給藥。但是本發明中用于治療或預防的藥物組合物并不局限于上述的劑量。
本發明中藥物組合物可采用常規的方法來配制。例如，非腸道制劑的制備可用一種溶劑如生理鹽水，緩沖溶液等溶解純化的IL-6R抗體，再向其中加入抗吸附劑如吐溫80，明膠，人血清白蛋白(HSA)等，或制劑也可是通過使用前溶解再重組的凍干形式，用于凍干的賦形劑有糖醇如甘露糖醇，葡萄糖等，或者是糖類。
實施例本發明將通過下述的實施例做更詳細地說明，但本發明并不局限于下述的實施例。
參考實施例1.B6Ld-IL-6轉基因小鼠的構建按照Yamarnura等人所述的方法(Yamamura et al.，J.Biochem.96357，1984)通過顯微注射將帶有連結有H-2Ld啟動子的人IL-6cDNA的一個3.3Kbp Sphl-XhoI片段(Ld-IL-6)(Suematsu et al.，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.867547，1989)注入(57BL/6)(B6)小鼠(Nihon Clea)受精卵的卵原核內。
將受精卵移植入一個經過假孕治療的雌性ICR小鼠的輸卵管。以后新生小鼠有關hIL-6 cDNA的整合可采用32P標記的含有人IL-6 cDNATaq I-BanII片段的探針與EcoRI內切酶消化的DNA尾部進行Southern印跡分析來篩選。整合試驗陽性的小鼠可與B6小鼠繁殖建立具有同種基因型的小鼠系。
參考實施例2.大鼠抗IL-6R抗體的制備可采用Saito等人所述的方法(J.Immunol.147168-173，1991)制備產生小鼠可溶性IL-6R的CHO細胞。細胞在αMEM培養液中培養，該培養液含有5％小牛血清(FBS)，培養條件為37℃，及含5％ CO2有一定濕度的空氣。收集所得的培養液并用來制備小鼠sIL-6R。培養液中小鼠sIL-6R的濃度可使用單克隆抗小鼠IL-6R抗體RS15(Saito et al.，J.Immunol.147168-173，1991)及兔多克隆抗小鼠IL-6R抗體采用三明治ELISA方法來測定。
使用吸附有單克隆抗小鼠IL-6R抗體(RS12)的親和柱由小鼠sIL-6R制劑純化小鼠sIL-6R。溶于完全弗氏佐劑的50微克純化的小鼠sIL-6R經皮下注入Wistar大鼠，此后，從第二周開始每周皮下注射一次溶于不完全弗爾佐劑的小鼠IL-6R，共注射四次以對動物增強免疫。第一次增強免疫注射一周后，對大鼠靜脈注射溶于100μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的50μg小鼠sIL-6R。
三天后，從大鼠體內取出脾臟，然后用大鼠脾細胞與小鼠p3ul骨髓瘤細胞以10∶1的比例進行融合。在96孔板(Falcon 3075)的孔內用100μl含有10％ FBS的RPMI1640培養液在37℃的溫度下過夜培養細胞，然后加入含有次黃嘌呤/氨基喋呤/胸腺嘧啶(HAT)的培養液100μl。以后每天以HAT培養液更換一半的培養液，共4天。
7天后，通過小鼠sIL-6R結合分析的方法(ELISA)篩選出產生抗小鼠sIL-6R的雜交瘤。簡言之，將100μl的雜交瘤培養液上清孵育在一個事先涂有1μg/ml的兔多克隆抗大鼠IgG抗體的板上。沖洗該孵育的板，然后再與100μg/ml的小鼠SIL-6R一起孵育。沖洗后，再加入2μg/ml的兔多克隆抗小鼠IL-6R抗體，沖洗該板，然后再與結合有堿性磷酸酶的山羊多克隆抗兔IgG抗體(Tago)一起孵育60分鐘。
沖洗后，最后再將該板與堿性磷酸酶的底物(sIGMA 104；p-硝基苯磷酸鹽)一起孵育，并使用板讀數器(Toso)在405nm處讀數。采用有限稀釋的方法克隆2次識別小鼠sIL-6R的雜交瘤。如用腹水制備單克隆抗體，可先給BALB/c nu/nu小鼠注射2次0.5ml的降植烷，3天后將已建立起來的4×106個雜交瘤細胞注入腹腔。10到20天后，收集腹水，并采用G蛋白柱子(Oncogene Science)純化單克隆抗體MR16-1。
由MR16-1產生的抗體對IL-6的中和作用可采用3H胸腺嘧啶對MH60.BSF2細胞的插入情況來測定(Matsuda et al.，Eur.J.Immunol.18951-956，1988)。將MH60.BSF2細胞以1×104個細胞/200μl/孔的數量等分加入96孔板，然后向孔內加入小鼠IL-6(10pg/ml)和MR16-1或RS12抗體，隨后在37℃及5％CO2的條件下孵育細胞44小時。然后將3H胸腺嘧啶(1mCi/孔)加入板的每個孔中，4小時后測定3H的插入情況。
實施例1取31只經B6IL-6轉基因小鼠(B6 IL-6 Tgm)繁殖具有人IL-6 cDNA的轉基因小鼠，B6IL-6轉基因小鼠的制備見參考實施例1，另外取正常的不攜帶人IL-6 cDNA的同窩小鼠11只(均為4周齡，雄性)。將B6IL-6 Tgm分為5組(組1-組5)，每組6只動物，只有組1有7只動物。組6有5只正常的同窩小鼠，組7有6只。
給藥計劃如下組1(B6 IL-6 Tgm)給4周齡小鼠(實驗第1天)靜脈注射大鼠IgG1抗體(KH5)(對照抗體)，劑量為2mg/0.2ml，5周齡后(實驗的第8天)，每周皮下注射2次100μg的KH5抗體(每3到4天注射1次)。
組2(B6 IL-6 Tgm)給4周齡小鼠靜脈注射MR16-1抗體，劑量為2mg/0.2ml，5周齡以后，每周皮下注射2次100μg的MR16-1。
組3(B6 IL-6 Tgm)給4周齡小鼠靜脈注射0.2ml的磷酸緩沖鹽溶液，5周齡以后，每周皮下注射2次100μg的MR16-1。
組4(B6 IL-6 Tgm)給4周齡小鼠靜脈注射2mg/0.2ml的MR16-1，5周齡以后每隔1周皮下注射400μg的MR16-1。
組5(B6 IL-6 Tgm)給4周齡小鼠靜脈注射2mg/0.2ml的MR16-1，5周齡以后每隔周皮下注射1mg的MR16-1。
組6(正常的B6同窩小鼠)給4周齡小鼠靜脈注射2mg/0.2ml的對照抗體KH5，5周齡以后每周皮下注射2次100μg的KH5。
組7(正常的B6同窩小鼠)給4周齡小鼠靜脈注射2mg/0.2ml的MR16-1，5周齡以后每周皮下注射2次100μg的MR16-1。
所采用的實驗方法如下測量體重并測定尿蛋白每周測量體重并以尿蛋白試紙(Combistics Sankyo)測定尿蛋白。3個加號尿蛋白(100至300mg/dl)或更高的尿蛋白記為陽性。
血樣的采用從實驗開始(4周齡)每隔1周從眶后靜脈竇取血1次，實驗結束時(18周齡)從下腔靜脈采集全部血液。
血細胞計數采用微型細胞計數儀(Sysmex F-800)，測定血紅蛋白含量(HGB)，白細胞數(WBC)，紅細胞數(RBC)，及血小板數(PLT)。實驗結束時，在一些組(組1，2，6及7)制備血液涂片，并測定白細胞分類百分比。
血中IgG1濃度的測定使用一種骨髓瘤蛋白為標準通過小鼠IgG1特異性的ELISA方法進行測定。
血IL-6濃度的測定通過一種hIL-6特異的ELISA方法進行測定。
血抗大鼠IgG抗體(IgG類型)滴度的測定由于所給的抗體對小鼠來說是一種異類抗體，對所給予抗體產生的抗體可使用大鼠IgG做為抗原通過ELISA方法來測定。結果以給予大鼠抗體的成年動物的標準IL-6Tgm血清為單位來表示。
血中化學參數的測定實驗結束時，使用自動分析儀(COBASFARA II，Roche)測定組1，2，3，6和7小鼠血清的總蛋白(TP)，白蛋白(Alb)，葡萄糖(Glu)，甘油三脂(TG)，肌酐(CGE)，血尿素氮(BUN)，鈣(Ca)，堿性磷酸酶(ALP)，谷草轉氨酶(GOT)，及谷丙轉氨酶(GPT)。
骨髓及脾細胞的FACS分析實驗結束時，從組1，2，6及7中取1只動物采集骨髓及脾細胞標本，并通過FACS can(BecktonDickensian)進行細胞表面抗原分析。所用抗體相應地為Gr-1(骨髓細胞)，CD4，CD8，及B220(脾細胞)抗體(Pharmingen)。
尸檢實驗結束時，進行尸檢，測量脾臟重量并用眼檢查主要臟器。
體重每組體重的變化見圖1。在組1和組3，體重增加。其它組中未見有體重不同的變化。
尿蛋白在組1中從13周齡開始出現尿蛋白陽性動物(圖2)，7只動物中的4只在尸檢時已經死亡(2只在16周齡時死亡，2只在17周齡時死亡)。然而在其它組未見有死亡動物。在組3，6只動物中也有2只在實驗結束時尿蛋白呈陽性，而在其它組未見有尿蛋白呈陽性的動物。
血液學所見在組1可見血紅蛋白濃度減少(圖3)及紅細胞數減少(圖4)，并隨著年令增大程度加重。血小板數(圖5)呈現一過渡升高但隨后很快減少。在組3雖然較組1稍遲些也可見相似的傾向。在組2，4和5，既沒有觀察到血紅蛋白濃度及紅細胞數的減少，也未見到血小板數增加及隨后的減少。有關血涂片血細胞計數的分類，組1可見中性細胞及單核細胞增加及淋巴細胞部分相應的減少，但在組2則為正常值(表1)。組6和組7之間也未見有顯著性差異。
表1
*SD標準差血中IgG1濃度在組1實驗開始后，血IgG1濃度立即明顯上升，最后達到正常小鼠濃度的100倍(圖7)。在組3IgG1濃度的上升較組1稍晚。反過來，在組2，4和5未見IgG1濃度上升，在整個實驗中其濃度幾乎保持不變。另外，對于正常小鼠未見給予抗體后有關的變化。
血hII-6濃度血hIL-6濃度的變化與IgG1變化的方式相同(圖8)，即在組1和組3有增加，而其它組在整個實驗過程中幾乎無變化。
血抗大鼠IgG抗體的滴度可在組1，3和6檢測到抗大鼠IgG抗體(表2)。組1和組3的所有動物呈高滴度，而在組65只動物中只有2只呈現滴度升高。另外，其它組未見有明顯的升高。
小鼠抗大鼠抗體(單位/毫升)表2組別年齡(周)4 68101214161810.15 0.78 1.69 7.41 100＜ 100＜ 100＜ 100＜20.22 0.34 0.45 0.38 0.43 0.50 0.39 0.3030.14 0.61 0.69 0.67 2.27 4.74 14.25 41.244N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 0.575N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 0.286N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 3.557N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 0.20N.D.未檢測血中化學參數的測定在組1和組3可見TP升高，Alb減低，在組1和組3還可見到TG和Alp減低，在組1甚至血糖也減低。在組2未見這些改變。
表3組別總蛋白 白蛋白 葡萄糖 甘油三脂 肌酐尿素氮鈣堿性磷酸 谷草轉氨 谷丙轉氨(g/dl) (g/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) 酶(U/l) 酶(IU/L) 酶(U/l)1 均值142.4177.420.7 0.4 34.88.6 27.6733.33 6標準差 1.33 0.3 14.58.33 0.2 23.70.355.69 5.86 1.732 均值5.68 3.31199 62.3 0.5128.38.67156.537.5 5.6標準差 0.3 0.2 29.510.9 0.224.080.5814.318.22 1.143 均值12.6 2.92253 410.6126.49.8254.1727.33 6.83標準差 2.85 0.6460.216.3 0.176.250.8342.625.65 1.726 均值5.9 3.84289 105 0.8727.98.9 181 33.2 9.6標準差 0.65 0.4698.928.8 0.226.320.7421.248.9 5.817 均值5.86 3.63300 940.7526.88.98196.83 34.5 6.5標準差 0.53 0.3425.5200.2 5.260.8221.684.89 3.08
FACS分析對組1，2，6，7中的骨髓細胞(BM)及脾細胞(sp)的分析表明在組1BM細胞中Gr-1陽性的顆粒細胞祖細胞明顯增加(圖9和圖10)，但在組2中則與正常的同窩小鼠的數值相類似。組6和組7之間無明顯不同。有關sp CD4-，CD8-，和B220-陽性細胞的比值除組1由于漿細胞的增加CD8-和B220陽性細胞減少外(表4)，在其它組未見有不同。
表4脾細胞表面抗原的分析組別 CD4+CD8+B220+113.2％5.4％ 23.1％218.5％14.3％50.0％319.9％15.0％53.1％413.9％10.6％57.3％尸檢所見在組1和組3可見全身淋巴結及脾臟明顯腫大(圖11)，另外還可見腎臟退色。另外還可見部分肝臟腫大。而在其它組未見上述改變，除在組2，4和5與正常的同窩小鼠比較可見脾臟稍有腫大，未見有其它的明顯改變。
下面對上述實驗結果進行說明。在服用對照抗體的IL-6 Tgm組(組1)，可見到IgG1漿細胞增多，貧血，血小板增多，血小板減少，腎衰及血化學指標異常等若干表現。然而上述這些表現均可被MR16-1抑制。
已知IL-6可使B細胞最終分化為漿細胞(Muraguchi，A.et al.，J.Exp.Med.167332-344，1988)，在IL-6 Igm組，IL-6的生成可致血IgG1濃度增加，血清中TP濃度增加及Alb濃度減少。這些表現表明已經出現IgG1漿細胞增多。
盡管在組1和組3由于疾病進展而總的情況惡化，但由疾病引起的全身淋巴組織如淋巴結及脾臟的明顯腫大會導致體重增加。MR16-1不僅可完全抑制上述這些情況，而且可抑制血IL-6濃度的升高。這樣證實在IL-6 Tgm組中與年齡相關的血IL-6濃度升高與漿細胞增殖有直接的關系。所以認為增殖的漿細胞本身可促進IL-6產生，而IL-6又可進一步促進漿細胞的生長，其結果為IL-6大量產生。
有關IL-6對血細胞的作用，已知IL-6可引起血小板增加(Ishibashi，T.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.865953-5957，1989；Ishibashi，T.et al.，Blood 741241-1244，1989)并引起巨細胞貧血(Hawley，R.G.et al.，J.Exp.Med.1761149-1163，1992)。除上所述，在IL-6 Tgm組與年齡相關的血小板減少與多克隆B細胞激活所致的自身免疫有關(Miyai，Tatsuya et al.，ibid)。
MR16-1可完全抑制IL-6對血細胞所產生的直接和間接作用，但并不影響正常同窩小鼠的血細胞計數。所以可以肯定抗IL-6受體抗體根本不會影響血細胞。在IL-6 Tgm組可見到被認為是顆粒細胞祖細胞的Gr-1陽性細胞的比值及外周血中性細胞的比值升高。雖然已知IL-6可增加中性粒細胞，但其詳細的機制尚不清楚。本研究發現產生這一現象的作用發生在骨髓祖細胞的水平。本研究還發現MR16-1可完全抑制IL-6的作用，但并不影響骨髓及外周血的中性粒細胞水平。
在IL-6 Tgm組還可觀察到MR16-1可抑制腎炎的發生。已經有報道認為IL-6與系膜細胞自主生長因子所致的小球系膜細胞增殖型腎炎的發生有密切關系。雖然在IL-6 Tgm組中所發生的腎炎已確定為小球系膜細胞增殖型腎炎，但也不能排除因IL-6增加免疫系統是否在發病中也起一定的作用(Katsume，Asao et al.，a presentation at the21st Meeting of Japan Immunology Society，“Characterization ofSCID×(SCID×H-2LdhIL-6 transgenic mice)，”1991)。總之，由于可抑制尿蛋白的出現，降低死亡數，抗IL-6受體抗體可有效地抑制因IL-6產生所致的腎炎發生這一點是很明確的。
在IL-6 Tgm組可見有關惡病質的指標如血Glu和Tg濃度有明顯下降。在本實驗中由于組1Glu和Tg減少，而在組2這些指標幾乎回到正常動物的正常水平，所以認為給予MR16-1可有效緩解惡病質。
由于MR16-1為一種大鼠IgG1，對于小鼠來講屬于異種蛋白，所以很容易想到對于所服用抗體所產生的抗體將使得所服用的抗體失去效果。
在本實驗第一次致敏時，為了通過暴露大劑量抗原引發免疫耐受，每組第1次給予抗體時靜脈注射抗體2mg/鼠。在給予MR16-1的組中(組1，4，及5)，經過上述免疫耐受法處理過的組無論給藥間隔及給藥劑量如何未檢測出抗大鼠IgG抗體，而且可以完全抑制疾病的發生。雖然給予對照抗體的組3抗大鼠IgG抗體升高，最終組3還是表現出與組1相同的表現，只是疾病的發生稍晚于組1。
這樣就說明引起免疫耐受的治療是有效的，但是在以同樣方式給予對照抗體的組1所有動物及組6 2/5的動物仍可檢測出抗大鼠IgG抗體。由于在IL-6 Tgm組中漿細胞增多引起多克隆B細胞激活，所以不能認為在組1和組3中檢測出的抗大鼠IgG抗體為所給予抗體的特異性抗體。但是仍可以推斷在組2，4和5由于第1次致敏時給予大量的抗原，加之由于給予大量MR16-1特異性抗體所產生的抑制作用可引發完全的免疫耐受反應。
本實驗可以明確抗IL-6受體抗體可在不影響正常抗體水平的情況下非常有效地治療由IL-6產生所致的各種疾病。
實施例2研究了有關小鼠IL-6受體抗體對結腸26所致惡病質模型的作用。所用小鼠為6周齡雄性BALB/C小鼠，在實驗的第1天給小鼠側腹部皮下植入一段2mm的結腸26。在實驗第1天植入結腸26前立即給動物靜脈注射劑量為2mg/小鼠的小鼠IL-6受體抗體MR16-1(見參考實例2)，以后在7，11，14和18天皮下注射劑量為0.5mg/小鼠的抗體(n＝7)。前面的實驗已經證實使用該方法并不容易產生抗異種蛋白的中和抗體。對腫瘤對照組的動物中按同樣的方式給予大鼠IgG1對照抗體(KH5)(n＝7)。另外對非腫瘤對照組的動物給予PBS(n＝7)。實驗開始后，每天測量體重，并在實驗的11和15天測定血中的化學參數及血鈣濃度。
10天后與非腫瘤組比較，腫瘤組體重有明顯下降，而在給予了MR16-1的組中(圖12)，可以部分抑制體重的下降。圖13和圖14分別給出了11天時血甘油三脂的濃度及15天時血糖的濃度。與非腫瘤對照組比較，這些指標在腫瘤對照組有明顯減少，而在給予MR16-1的組中可觀察到對上述的血糖降低有抑制傾向，而對上述甘油三脂的降低則有明顯的抑制作用。
與非腫瘤對照組比較，腫瘤對照組在實驗的第11天血鈣離子濃度明顯上升，而在給予MR16-1的組中則對此有明顯的抑制作用(圖15)。
采用與上述類似的方法(n＝10)進行的旨在確定生存時間效果的實驗中，結果在給予MR16-1的組中可觀察到有延長生存時間的作用(圖16)。
實施例3該實驗研究了IL-6受體抗體對由OCC-1引起的伴有高血鈣的惡病質模型的作用。所用小鼠為6周齡雄性裸鼠。實驗第1天，在小鼠腹部外側皮下植入鱗癌細胞系OOC-1。實驗第1天植入腫瘤細胞系前經靜脈給予劑量為2mg/小鼠的小鼠IL-6受體抗體MR16-1(見參考實施例2)，此后在第7和10天皮下注射劑量為100μg/小鼠的上述抗體(n＝6)。前面的實驗已經證實使用該方法并不容易產生抗異種蛋白即大鼠抗體的中和抗體。對腫瘤對照組按同樣的方法給予大鼠IgG1對照抗體(KH5)。另外一組動物給予PBS做為非腫瘤對照組(n＝7)。實驗開始后在第10天和12天測定體重及血鈣濃度。
在腫瘤組體重有所下降，而在給予MR16-1的組則與非腫瘤對照組體重的變化類似，表明有抑制體重下降的作用(圖17)。
與非腫瘤對照組相比，腫瘤對照組的血鈣濃度明顯升高，而在給予MR16-1的組則血鈣升高被強烈的抑制(圖18)。
權利要求
1.白介素-6受體抗體在制備用于預防或治療白介素-6產生所致疾病的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述的由白介素-6產生所致的疾病為漿細胞增多癥。
3.權利要求2的用途，其中所述的漿細胞增多癥是由風濕病引起的。
4.權利要求2的用途，其中所述的漿細胞增多癥是由Castleman氏病引起的。
5.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述的抗體是單克隆抗體。
6.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述的抗體是由雜交瘤PM-1(FERM BP-2998)產生的單克隆抗體衍生的PM-1抗體。
7.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述的抗體是包含小鼠單克隆抗體的可變區和人抗體的恒定區的嵌合抗體。
8.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述的抗體是重建的人抗體，其中人抗體的互補決定區已被非人抗體的哺乳動物抗體的互補決定區所置換。
9.權利要求8的用途，其中所述的抗體是重建的人PM-1抗體，其中人抗體的互補決定區已被雜交瘤PM-1(FERM BP-2998)產生的單克隆抗體的互補決定區所置換。
全文摘要
用于預防或治療因IL－6產生所致疾病的藥物組合物，該組合物中含有白介素－6受體抗體(IL－6R抗體)。IL－6R抗體可采用除人類以外其它動物的抗體如小鼠，大鼠等抗體，也可采用介于這些抗體和人類抗體之間的嵌合抗體，還可采用重建的人類抗體等。藥物組合物可用來預防或治療因白介素－6產生所致的疾病，例如漿細胞增多癥，抗IgG1血癥，貧血及腎炎等。
文檔編號A61P43/00GK1535728SQ20041000496
公開日2004年10月13日 申請日期1995年10月20日 優先權日1994年10月21日
發明者岸本忠三, 勝目朝夫, 齊藤浩之, 之, 夫 申請人:岸本忠三, 中外制藥株式會社