專利名稱：血清β2-糖蛋白I功能肽段在制備促溶栓藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明是申請號為00135779.4的專利申請的分案申請，原案的申請日是2000年12月20日，發明創造名稱為“血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質的應用及其功能肽段”。本發明涉及血清β2-糖蛋白I功能肽段的新用途，特別是涉及血清β2-糖蛋白I功能肽段在制備促溶栓藥物中的應用。
背景技術：
心血管病被稱為是威脅人類健康與生命的第二殺手，血栓的產生與發展既是心血管疾病發生的重要環節，又是造成中風，心肌梗塞的直接原因。溶栓藥物的開發研究一直在心血管疾病防治的研究中處于重中之重的位置，而且在相當長時期內都將是生物工程研究與產品開發的重點。
機體存在著凝血與纖溶(使凝血塊溶解)兩個對立與統一的系統，維持和調節兩者間的平衡，才能保證血液循環的暢通。基于機體具有的這種凝血與纖溶機制，人們研究與開發防止血栓形成和溶(血)栓的方法和藥物。目前國內外最廣泛使用的有效的溶栓生物制品有組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)，尿激酶(uPA)，鏈激酶等，它們都是基于這樣的機制血液中不具活性的血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)在其激活因子(tPA，uPA)的作用下轉變為具有活性的血纖維蛋白酶(plasmin)，后者能夠溶解由血纖維蛋白形成的凝血塊[1.Machovich，R.，Litwiller，R.D.and Owen，W.G.(1992)Biochemistry.31，11558-11561；2.Hoylaerts，M.，Rijken，D.C.，Lijnen，H R.and Collen，D.(1982)J. Biol.Chem.257，2912-2919.]。但是，現有上述溶栓藥物普遍存在藥效持續時間短，給藥量小時療效不佳，而大劑量使用又會損傷機體凝血機制的缺點。
事實上，在體外實驗中，如果沒有某些輔助因素(cofactors)存在，血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系(plasminogen-tPA/uPA fibrinolysis system)的纖溶活性很低。因此，在機體內應該存在有促進或激活纖溶體系的活性物質。目前發現的相關輔助因素或因子有三類形成血凝塊的纖維蛋白本身(fibrin)，某些細胞膜表面受體聚合體(如annexin II complex)，某些高溫等激烈處理產生的不可逆變性蛋白[1.Machovich，R.and Owen，W.G.(1997)Arch.Biochem.Biophy.344，343-349；2.Ellis，V.(1997)TCM，7(7)，227-234.]。然而，它們都不是天然的可溶性血清活性因子，與人體的親和和相容性均存在著問題，顯然不宜開發為臨床應用的促溶(血)栓活性物質藥物。
發明內容
本發明的目的是提供血清β2-糖蛋白I的功能肽段作為促溶栓活性物質在制備促溶栓藥物中的新用途。
實驗表明，血清β2-糖蛋白I的功能肽段Gly1-Pro62具有促進tPA活化血纖維蛋白溶酶原為血纖維蛋白溶酶的作用，可以作為促溶栓活性物質而得到廣泛應用，特別是應用于制造各類的溶栓藥物。
血清β2-糖蛋白I的功能肽段Gly1-Pro62的主要作用肽段為Ser38-Arg-Gly-Gly-Met-Arg-Lys44，和Cys47-Pro-Leu-Thr-Gly-Leu-Typ-Pro-Ilu-Asn-Thr-Leu-Lys-Cys60。
促溶(血)栓活性物質(promoting fibrinolysis activators)血清β2-糖蛋白I是由血清提取純化和基因工程生產的β2-糖蛋白I(β2-Glycoprotain I)，也稱載脂蛋白H(apolipoprotein H，簡稱ApoH)。該分子為一種單鏈蛋白分子，具有326個氨基酸，分子量為43-50KD。其氨基酸序列及提純、制備方法見Lozier，J.，Takahashi，N.and Putnam，F.W.(1984)Proc.Natl.Sci.USA，81，3640-3644.血清β2-糖蛋白I的功能肽段也可以由常規方法制備。
實驗證明，在沒有其它輔助因素(cofactors)存在的情況下，加入血清β2-糖蛋白I或本發明的血清β2-糖蛋白I功能肽段，顯著促進tPA活化血纖維蛋白溶酶原為血纖維蛋白溶酶，進而激活和顯著提高血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系(plasminogen-tPA/uPA fibrinolysis system)的纖溶活性。
與不加血清β2-糖蛋白I或本發明的血清β2-糖蛋白I功能肽段的對照組相比較，在加入血清β2-糖蛋白I或本發明的血清β2-糖蛋白I功能肽段時，tPA促纖溶活性和血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性均可大大提高，可高達20多倍，其活性的提高與加入的β2-糖蛋白I或其活性片斷存在效應劑量關系。
血清β2-糖蛋白I或本發明的血清β2-糖蛋白I活性片斷有雙向調節作用，不僅能夠提高血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性，而且在一定劑量下，能夠降低由某些輔助因子(如annexin II)對血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性的增強作用。
下面結合附圖對本發明的具體實施例作進一步說明。
圖1為實施例1的對比曲線圖2為實施例1當加入不同濃度的ApoH時的促纖溶活力曲線圖3為實施例2的對比曲線圖4為實施例2當加入不同濃度的ApoH時的促纖溶活力曲線圖5為顯示ApoH各活性片段促溶纖活性的直方圖具體實施方式
在下面的所有實施例中，以熒光強度表示促纖溶活力，用I360/465nm表示，其中360nm是激發光，465nm是發射光，也可以用促纖溶活力的絕對速度K(I/Min2)表示，即強度與時間平方的比值。
實施例1ApoH對tPA-依賴的血纖維蛋白溶酶纖溶活性的影響實驗反應體系為250nM(100-500nM均可)血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)25nM(10-50nM均可)tPA600nM(200-1000nM均可)血纖維蛋白酶的反應底物(H-D-Val-Leu-Lys-AMC)實驗組加入1μM ApoH(0.25-5μM均可)反應溫度恒溫30℃(25℃-37℃均可)熒光光度測量激發光360nm/發射光465nm在反應0-60分鐘期間內，每隔5分鐘，測量一次反應體系的熒光強度。
如圖1所示(曲線1為對照組，曲線2為實驗組，橫坐標是反應時間的平方，縱坐標為熒光強度I360/465nm)，較之于不加ApoH的對照組，在加入了ApoH時，反應產物的熒光強度所表示的血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性可大大提高，最高可達20多倍。當用上述操作方法，實驗組中加入0.2-10.0μM不同濃度的ApoH時，如圖2所示(橫坐標為ApoH的濃度，縱坐標為促纖溶活力K(I/Min2)，圖中的各點表示實際測得的不同ApoH濃度下促纖溶活力K(I/Min2)的數字)，表明纖溶活性的提高與加入的β2-糖蛋白I存在效應劑量關系，但當β2-糖蛋白I的濃度達到一定時，反應速度不再增加，保持穩定，與上述的β2-糖蛋白I促纖溶的作用原理相吻合。
實施例2、ApoH對tPA促纖溶活性的影響實驗反應體系為30nM tPA(10-50nM均可)700nM(200-1000nM均可)的tPA反應底物(Glutaryl-Gly-Arg-AMC)實驗組加入0.5μM ApoH(0.25-5μM)
反應溫度恒溫32℃(25℃-37℃均可)熒光光度測量激發光360nm/發射光465nm在反應0-60分鐘期間內，每隔5分鐘，測量一次反應體系的熒光強度。
如圖3所示(曲線3為對照組，曲線4為實驗組，橫坐標是反應時間的平方，縱坐標為熒光強度I360/465nm)，較之于不加ApoH的對照組，在加入了ApoH時，反應產物的熒光強度所表示的tPA促纖溶活性可大大提高，最高可達20多倍。當用上述操作方法，實驗組中加入0.2-5.0μM不同濃度的ApoH時，如圖2所示(橫坐標為ApoH的濃度，縱坐標為促纖溶活力K，圖中的各點表示促纖溶活力K(I/Min2))，表明纖溶活性的提高與加入的β2-糖蛋白I存在效應劑量關系。
實施例3ApoH各活性片段的促溶纖活性400nM(100-500nM均可)血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)40nM(10-50nM均可)tPA 200-1000nM血纖維蛋白酶的反應底物(H-D-Val-Leu-Lys-AMC)實驗組分別加入1μM ApoH的相關片段CCP1，CCP1-1，CCP1-2。
反應溫度恒溫30℃(25℃-37℃均可)熒光光度測量，激發光360nm/發射光465nm在反應0-60分鐘期間內，每隔5分鐘，測量一次反應體系的熒光強度。
實驗結果表明，較之于不加ApoH的對照組，在加入上述ApoH活性片段時，反應產物的熒光強度所表示的血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性可有不同程度的提高。如圖5所示，為ApoH各活性片段在反應體系中反應60分鐘時的直方圖，橫坐標依次為對照、CCP1、CCP1-1和CCP1-2，縱坐標為熒光強度I360/465nm，可以看出，雖然各活性片段之間的纖溶活性有差別，但較對照組均有較大的提高。
權利要求
1.血清β2-糖蛋白I的功能肽段Gly1-Pro62在制備促溶栓藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述功能肽段Gly1-Pro62的作用肽段為Ser38-Arg-Gly-Gly-Met-Arg-Lys44，和Cys47-Pro-Leu-Thr-Gly-Leu-Typ-Pro-Ilu-Asn-Thr-Leu-Lys-Cys60。
全文摘要
本發明公開了血清β2－糖蛋白I功能肽段在制備促溶栓藥物中的應用。血清β2－糖蛋白I的功能肽段為Gly
文檔編號A61P7/00GK1528450SQ20041000639
公開日2004年9月15日 申請日期2000年12月20日 優先權日2000年12月20日
發明者蔡國平 申請人:清華大學