血小板生成素模擬肽二聯體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：血小板生成素模擬肽二聯體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術與基因工程制藥領域，具體涉及血小板生成素模擬肽二聯體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應用。
背景技術：
在臨床上常會遇到由各種原因引起的原發性和繼發性血小板減少癥，如原發性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血以及腫瘤化/放療造成的血小板減少等。對于這類疾病， 比較適合應用長效升血小板藥物進行救治，一方面，可以減少用藥次數，使病人的針痛之苦減少；另一方面，可以減少藥物用量，降低治療費用。血小板由巨核細胞產生，促進巨核細胞的增殖、分化是提高血小板水平的主要手段。血小板生成素(Thrombopoietin，ΤΡ0)，又稱巨核細胞生長發育因子(MGDF)，是骨髓巨核細胞增殖、分化和血小板生成的最重要調控因子。1994年TPO基因被首次成功克隆后不久，人們即研制出一種聚乙二醇化的重組功能型TPO基因工程產品-PEG-rHuMGDF。動物實驗結果表明，PEG-rHuMGDF不僅具有突出的促血小板生成活性，而且在體內具有較長的半衰期，單次應用即可達到顯著升高血小板的效果。然而，在臨床試驗過程中人們發現，一些健康受試者在接受該藥物治療后所產生的抗體與內源性TPO存在交差中和反應，導致受試者出現血小板減少，從而使得PEG-rHuMGDF乃至重組人TPO的研制在1998年時即被美國FDA 叫停。受其影響，在美、歐、日本等國家至今重組人TPO都未被批準進入臨床。鑒于此，人們轉而尋找和開發TPO的模擬物或類似物，以期研制出新一代的升血小板藥物。所謂TPO的模擬物或類似物是指與TPO —樣具有結合并激活TPO受體、促進巨核細胞增殖、分化和血小板生成的功能，但又與TPO完全不同源的多肽或化合物。1997 年 Cwirla 等(Cwirla SE et al.，Science，1997，276 :1696-1699)通過噬菌體展示技術篩選到一種可特異性結合并激活TPO受體的短肽，該短肽由14個氨基酸殘基組成，其化學合成的二聯體多肽與TPO受體的親和力以及促巨核細胞增殖活性都與重組人TPO相當，但其氨基酸序列又與天然TPO完全不同源，所以不會誘導體內產生TPO中和性抗體，因此稱之為 TPO 模擬肽(Thrombopoietin mimetic peptide, TMP)。然而，由于 TMP 二聯體多肽分子量小，在體內的生物半衰期非常短，因此體內應用效果并不理想。為了增大分子量以促進體內應用效果，有研究者嘗試將TMP 二聯體的氨基末端共價結合聚乙二醇 (Serres M et al. ,Stem Cells, 1999,17 :203-209)，也有研究者將TMP與免疫球蛋白(IgG) 的Fc段進行了融合(EP1144454B1)。人血清白蛋白(HSA)是血漿中的主要蛋白成分，約占血漿總蛋白的50-60%。HSA 是一種非糖基化單鏈蛋白，共由585個氨基酸殘基組成，其分子量為66. 5kDa(A. Dugaiczyk et al.，PNAS，1982，79 :71-75)，血漿半衰期長達兩周以上。HSA在宿主細胞中是以一種原肽形式合成的，其中含M個氨基酸殘基組成的信號肽和前肽，在轉運和分泌過程中信號肽和前肽被切除。HSA是一個穩定的惰性蛋白，并能作為藥物載體。HSA已成功地在多種宿主中表達(EP330451和EP361991)，尤其在酵母細胞中可實現HSA較高水平的穩定表達。當目的多肽與HSA融合表達時不僅可以提高多肽藥物的穩定性，還可以增加多肽藥物在體內的半衰期。

發明內容
本發明的目的在于提供一種血小板生成素模擬肽二聯體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應用。本發明所述的血小板生成素模擬肽TMP 二聯體與人血清白蛋白HSA的融合蛋白， 包含1個人血清白蛋白HSA和2個血小板生成素模擬肽TMP。人血清白蛋白HSA存在天然多態性，本發明融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括這些多態型。優選地，所述血小板生成素模擬肽TMP具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列， 或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述血小板生成素模擬肽 TMP的活性的氨基酸序列。優選地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列。 優選地，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，2個所述血小板生成素模擬肽TMP串聯成二聯體位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP之間均設有連接肽L，所述融合蛋白用結構式表示為HSA-L-(TMP)2，具體地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 5所示。優選地，所述2個血小板生成素模擬肽TMP串聯成二聯體位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP之間均設有連接肽L，所述融合蛋白用結構式表示為(TMP)2-L-HSA,具體地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 6所示。優選地，所述人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP之間的連接肽L均由1-50個氨基酸殘基組成。更優選地，所述人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯體之間的連接肽L由1-30個氨基酸殘基組成，兩個血小板生成素模擬肽TMP之間的連接肽L由1-15個氨基酸殘基組成。優選地，組成所述連接肽L的氨基酸主要是Gly、Ser, Pro, Tyr或Ala。本發明還提供上述融合蛋白的制備方法，主要包含步驟1)獲取人血清白蛋白HSA的基因，并將該基因克隆至載體質粒1中，獲得含HSA基因的質粒2 ；2)以步驟1)獲得的質粒2為模板，通過PCR擴增得到加載了編碼TMP 二聯體序列的PCR產物，將所述PCR產物克隆至載體質粒3然后轉化大腸桿菌，獲得含編碼HSA與TMP 二聯體的融合蛋白的基因的質粒4 ；
3)通過限制性內切酶酶切、連接、轉化，將編碼HSA與TMP 二聯體的融合蛋白的基因從質粒4亞克隆至表達載體質粒5中，獲得含編碼HSA與TMP 二聯體的融合蛋白的基因的重組表達質粒6 ；4)將步驟幻所述的重組表達質粒6轉化到感受態細胞，再轉化到宿主表達系統進行表達，即得所述融合蛋白。其中步驟1)的質粒1和步驟2)的質粒3均為可用于基因克隆的常見質粒載體， 優選的是PUC57質粒。其中步驟幻的質粒5為可用于重組基因表達的常見質粒載體，優選酵母表達質粒載體，更優選的是pPICZa質粒。其中步驟4)所述宿主是酵母。本發明還涉及含有上述融合蛋白的編碼基因的重組表達載體。可用于攜帶編碼本發明融合蛋白的基因的表達載體包括但不局限于原核、真核表達系統常用的質粒。本發明還涉及含有上述重組表達載體的宿主表達系統。宿主可以是細菌、酵母及哺乳動物細胞等，其中優選的是酵母，更優選的是畢赤酵母；對于重組表達的本發明融合蛋白可以通過多種方法從相應的細胞培養物中進行提取、純化，這些方法包括離心、超濾及液相層析等技術，其中液相層析又包括了離子交換、疏水和分子篩等層析技術。本發明所述的融合蛋白可用于制備治療原發性或繼發性血小板減少癥的藥物。本發明所述融合蛋白可以與藥物載體一起組成藥物制劑使用，這些藥物載體包括水、鹽水、糖類、醇類及氨基酸等。由本發明融合蛋白制成的藥物制劑優選的是含水量低于3%或不含水的凍干制劑。這些藥物制劑可以用于多種原發性和繼發性血小板減少癥的治療，給藥方式包括靜脈輸注、注射(包括皮下和肌肉注射)、鼻內、呼吸道等，其中優選的是皮下或肌肉注射。本發明采用基因重組技術，將兩個血小板生成素模擬肽TMP序列的二聯體和人血清白蛋白HSA融合，HSA和TMP 二聯體之間及兩個TMP之間設置有合適長度的連接肽，所產生的融合蛋白在保持TMP 二聯體具有突出促巨核細胞增殖分化和血小板生成特性的基礎上顯著延長其在體內的半衰期，可用于制備治療原發性或繼發性血小板減少癥的藥物。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1為pPICZ α /HSA-L- (TMP) 2重組質粒的構建流程；圖2Α-2Β為HSA-L-(TMP)2編碼序列的5’末端和3’末端測序結果，其中圖2Α為 5’末端的測定序列(包含了部分載體序列，以及編碼HSA信號肽、前肽和N端成熟肽的序列)，圖2Β為3’末端的測定序列(包含HSA的C末端氨基酸的編碼序列，以及編碼連接肽和TMP 二聯體的序列)；圖3為純化所得HSA-L-(TMP)2融合蛋白的SDS-PAGE分析結果，其中M為蛋白 Marker, 1為純化后的HSA-L-(TMP)2融合蛋白；圖4為HSA-L-(TMP)2融合蛋白的體外促巨核細胞增殖分化活性分析，其中1為空白對照組，2為TMP 二聯多肽處理組，3為HSA處理組，4為HSA-L-(TMP)2融合蛋白處理組；
圖5為HSA-L-(TMP)2融合蛋白的體內藥代動力學分析。
具體實施例方式主要實驗材料1. Pyrobest DNA Polymerase 試劑盒(TaKara 公司產品，中國大連)2.限制性核酸內切酶Asu II、Not I.Sac I (TaKara公司產品，中國大連)3. QIAprep Spin質粒提取試劑盒OiIAGEN公司，美國)4. DNA膠回收試劑盒(Omega公司，美國)5. T4 DNA連接酶試劑盒(Takara公司產品，中國大連)6.質粒載體pPICZa、畢赤酵母菌株X-33(InVitrogen公司產品，美國)
7.大腸桿菌DH5 a (本室保存)8. M07e細胞(本室保存)9. Zeocin(Invitrogen 公司產品，美國)10. SP陽離子層介質、Q陰離子層析介質、疏水和分子篩等層析介質及層析柱(GE 公司產品，美國)11.酵母提取物、胰蛋白胨(Oxford公司產品，美國)12.磷酸鹽緩沖液
NaClSgKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g溶于1000ml去離子水中，并用濃HCl調節pH值至7. 4，高壓蒸氣滅菌。13. LB 培養基酵母提取物 5g胰蛋白胨 IOgNaClIOg溶于1000ml去離子水中，并用lmol/L的NaOH調節pH值至7. 0，高壓蒸氣滅菌。14. YPD 培養基酵母提取物 IOg胰蛋白胨20gAgar20g溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻后加入100ml經濾器除菌后的20%的右旋糖和適當濃度的kocin。15. YPDS 培養基酵母提取物 IOg胰蛋白胨 20g
山梨糖醇 182. 2g溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻后加入IOOml經濾器除菌后的20 %的右旋糖和適當濃度的kocin。16. BMGY液體培養基
酵母提取物IOg
胰蛋白胨20g
無氨基酸酵母氮源134g 甘油IOg
磷酸鉀26.631g溶于IOOOml雙蒸水中高壓滅菌，冷至室溫，調節pH至6. 0，4°C保存備用。實施例1 人血清白蛋白HSA的全基因合成1、首先根據畢赤酵母偏愛密碼子對編碼HSA (包括M個氨基酸殘基組成的信號肽和前肽)的基因序列進行優化，優化后的HSA的全長基因序列如SEQ ID NO 10所示，其中 5’端1-72個bp為編碼HSA信號肽和前肽的堿基序列。信號肽和前肽在酵母細胞中表達分泌過程中會自動切除。2、委托上海生工生物工程公司合成優化后的HSA的全長基因并將其裝載到PUC57 質粒中(pUC57質粒載體由上海生工生物公司提供)，獲得PUC57-HSA。實施例2 :pPICZ α /HSA-L- (TMP) 2重組表達載體的構建
1、編碼HSA-L- (TMP) 2的cDNA片段的獲得(1)設計合成PCR引物Pl (SEQ ID NO 7) -age ttc gaa acg—atg aag tgg gta acc ttt att tcc ctt c 3'P2 (SEQ ID NO :8) :5' -ggc tct age age caa cca ttg tct caa agt tgg acc ctc aat acc aga tcc acc gcc tcc aga tcc acc tcc gcc gga tcc taa gcc taa ggc age ttg ac~3'P3 (SEQ ID NO :9) :5' -at cgc ggc cgc tta tgc tct age tgc aag cca ctg tct cag ggt agg tcc ctc gat tgg acc aga tgg ggc tct age age caa cca ttg-3'其中Pl中下劃線部分堿基為限制性內切酶Asu II識別位點序列；P2中5'端為編碼TMP的序列，中間斜體部分為HSA與TMP之間的Linker序列，3'端為HSA基因C-末端的特異性識別序列；P3中下劃線部分堿基為限制性內切酶Not I識別位點序列，斜體部分為兩個TMP之間的Linker序列。(2)PCR擴增以實施例1所得的pUC57-HSA質粒DNA為模版，以Pl和P2分別作為上、下游引物，進行PCR擴增。反應條件如下①變性94°C，5min ；②變性94°C，lmin ；③ 復性:55°C,lmin ；④延伸72°C，2min ；⑤返回步驟“②”，35循環；⑥延伸:72°C，lOmin，總循環次數為35次。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示擴增出約1. 9kb大小的 DNA條帶。然后，以所得PCR產物為模版，再以Pl和P3分別作為上、下游引物，進行PCR擴增，反應條件同前，擴增獲得約2. Okb大小的DNA片段。(3) HSA-L-(TMP) 2的cDNA片段克隆與測序將步驟(2)所得PCR產物與載體pUC57 進行連接，轉化大腸桿菌DH5 α，涂于氨芐抗性LB板37°C培養過夜，篩選陽性克隆，具體實驗步驟參照T載體克隆試劑盒操作說明(TaKara公司產品)。所得克隆送上海生工生物工程公司測序，序列正確的克隆命名為pUC57/HSA-L- (TMP) 2。2、酵母表達載體pPICZ α /HSA-L-(TMP)2的構建提取測序正確pUC57/HSA-L-(TMP)2的質粒DNA，Asu II和Not I雙酶切質粒DNA， 膠回收HSA-L- (TMP) 2對應的DNA片段。同時，Asu II 和 Not I 雙酶切pPICZ α-A (Invitrogen 公司產品)質粒DNA，膠回收pPICZ α -A載體片段。T4DNA酶連接兩個膠回收的DNA片段， 轉化大腸桿菌DH5 α，涂于kocin抗性LB板37°C培養過夜，次日挑取細菌克隆，LB液體培養基過夜培養，提取質粒DNA，再用Asu II和Not I雙酶切鑒定，將能夠切下約2. 01Λ 大小DNA片段的質粒送上海生工生物工程公司測序，測序正確的克隆即命名為pPICZ α / HSA-L-(TMP) 2。pPICZ α /HSA-L-(TMP)2 的構建流程如圖 1 所示，HSA-L-(TMP)2 編碼序列的測序結果如圖2Α-2Β所示，由于編碼HSA-L-(TMP)2的序列較長，為了清楚顯示測定序列的正確性，特別選擇了關鍵部位的測序結果在圖2中進行展示，其中圖2Α為5’末端的部分測定序列(包含了部分載體序列，以及編碼HSA信號肽、前肽和成熟肽N端數個氨基酸的序列)，圖2Β為3’末端的部分測定序列(包含HSA的C末端數個氨基酸的編碼序列，以及編碼連接肽和TMP 二聯體的序列)。將測序正確的pPICZ α /HSA-L-(TMP) 2質粒DNA用&ic I酶切回收后，轉化X-33 感受態細胞。電擊轉化參數為1500V，200 Ω，25 μ F。然后將轉化菌液接種于kocin抗性 YPDS平板，30°C培養3-4天，挑取克隆，采用Pl和P3作為引物對所挑取克隆的基因組DNA 進行PCR擴增鑒定，對能夠擴增出約2. 01Λ大小DNA片段的克隆進行編號登記。將得到陽性克隆分別接種BMGY液體培養基，30°C培養M小時，然后轉接至培養瓶，繼續培養96小時， 7500rpm低溫離心15分鐘，取上清，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況，并用TMP 二聯多肽的抗體(第三軍醫大學全軍復合傷研究所研制)進行Western blot分析，顯色陽性且分子量約70kD蛋白條帶即為HSA-L-(TMP)2融合蛋白，選擇表達水平最高的菌株作為工程菌，凍存于-70°C保種。實施例3 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的表達與純化取-70°C凍存的整合有pPICZ α /HSA-L-(TMP)2的酵母工程菌種接種于YPDS平板 30°C過夜培養活化，挑選外觀優良的單個菌落接種于BMGY培養基，30°C恒溫搖床220rpm振蕩培養16 18h至OD6tltl ^ 3 5，然后按1 10轉種1次培養至OD6tltl約為4，以此菌液為種子液。然后將種子液移種于裝有7L基礎鹽培養基的15L發酵罐(比歐公司，瑞士)進行高密度培養發酵。每1升基礎培養基中含有甘油50g、濃磷酸laiil，KOH 2. 6g，CaSO4 · 2H20 0. 6g, K2SO4 9. 5g，MgSO4 ·7Η20 7. 8g，生物素 0. 3ang，YTB 溶液(內含有 65g/L 的!^eSO4 ·7Η20， 6g/L 的 CuSO4 · 5H20, 20g/L 的 ZnSO4 · 7H20,6g/L 的 MnSO4 · 5H20 和 0. 5 % 的濃硫酸)2ml。發酵溫度控制在30°C (開始甲醇誘導后控制為)，溶解氧控制在30% 40%之間，pH值控制在6.0以下，培養至甘油耗盡后開始流加甘油，繼續培養至OD6tltl 150時開始流加甲醇誘導，甲醇流加速率控制在1 %左右。誘導表達60h后停止發酵，低溫離心取上清，隨后進行純化。
首先將上清進行超濾層析，以去除部分色素和降低高強度的鹽離子濃度，并將目的多肽濃縮，同時用20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7. 0)更換緩沖體系。接著過SP Sepharose Fast Flow柱進行陽離子交換層析，去除絕大部分殘留色素和雜蛋白，收集含有目的多肽的組分，再上Phenyl Sepharose Fast Flow柱進行疏水層析，最后再過Supdex 200層析柱，將收集分離組分即為純化的融合蛋白，分子量約為70KD (如圖3所示)，HPLC測定其純度大于98%。實施例4 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的體外生物活性測性采用CCK-8法(改良MTT法)檢測HSA_L_ (TMP) 2融合蛋白對人巨核細胞株M07e 細胞的促增殖活性，具體操作如下取對數生長期的M07e細胞，離心洗滌，再用僅含10%胎牛血清的1640培養液重新懸浮細胞，培養18-24h后收集進行細胞計數，并按5 X 105/ml轉接至96孔U型板中，每孔lOOul。分別設立空白對照組(培養液中不含任何細胞因子)、 HSA對照組(IOnM)、TMP 二聯肽處理組(IOnM)及等摩爾濃度的HSA-L-(TMP)2融合蛋白處理組(IOnM)，每組6個復孔，置于37°C、5% CO2孵箱培養，培養7 后每孔加入CCK-8試劑 10ul,37°C,5% CO2孵箱培養Mi后于酶標儀490nm波長檢測細胞光密度值并分析細胞的增殖情況。結果顯示，把44-01^)2可以顯著促進巨核細胞的增殖(如圖4所示)，說明本發明融合蛋白保留了 TMP 二聯肽的促巨核細胞增殖活性。實施例5 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的體內半衰期測定給小鼠體內皮下注射HSA-L-(TMP)2融合蛋白O00ug/kg)，于給藥后1、4、對、48、 96、144、192h時間點取樣采血，采用自行制備的TMP 二聯肽抗體，通過酶連免疫吸附方法 (ELISA)檢測小鼠血清中的HSA-L- (TMP) 2融合蛋白濃度，并計算藥代動力學參數，求出融合蛋白在血液中的半衰期。結果顯示HSA-L-(TMP)2融合蛋白的半衰期約為120h(如圖5所示)，而文獻報道皮下注射TMP 二聯肽在小鼠體內的半衰期約為lh，說明通過于HSA融合顯著延長了 TMP 二聯肽在體內的半衰期。雖然本發明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發明，任何所屬技術領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作些許的更動與改進，因此本發明的保護范圍當視權利要求所界定者為準。
權利要求
1.一種血小板生成素模擬肽TMP的二聯體與人血清白蛋白HSA的融合蛋白，其特征在于，包含1個人血清白蛋白HSA和2個血小板生成素模擬肽TMP。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述血小板生成素模擬肽TMP具有 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述血小板生成素模擬肽TMP的活性的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列。
4.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，所述2個血小板生成素模擬肽TMP串聯成二聯體位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP 之間均設有連接肽L，所述融合蛋白用結構式表示為HSA-L-(TMP)2。
5.根據權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO :5所示。
6.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述2個血小板生成素模擬肽TMP串聯成二聯體位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP 之間均設有連接肽L，所述融合蛋白用結構式表示為(TMP)2-L-HSA。
7.根據權利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 6所示。
8.根據權利要求4至7中任一項所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA 與血小板生成素模擬肽TMP 二聯體之間以及兩個血小板生成素模擬肽TMP之間的連接肽L 均由1-50個氨基酸殘基組成。
9.根據權利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯體之間的連接肽L由1-30個氨基酸殘基組成，兩個血小板生成素模擬肽 TMP之間的連接肽L由1-15個氨基酸殘基組成。
10.根據權利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，組成所述連接肽L的氨基酸主要是 Gly、Ser> Pro、Tyr 或 Ala。
11.一種權利要求1所述的融合蛋白的制備方法，其特征在于，包含步驟1)獲取人血清白蛋白HSA的基因，并將該基因克隆至載體質粒1中，獲得含HSA基因的質粒2 ；2)以步驟1)獲得的質粒2為模板，通過PCR擴增得到加載了編碼TMP二聯體序列的 PCR產物，將所述PCR產物克隆至載體質粒3并轉化大腸桿菌，獲得含編碼HSA與TMP 二聯體的融合蛋白的基因的質粒4;3)通過限制性內切酶酶切、連接并轉化大腸桿菌，將編碼HSA與TMP二聯體的融合蛋白的基因從質粒4亞克隆至表達載體質粒5中，獲得含編碼HSA與TMP 二聯體的融合蛋白的基因的重組表達質粒6;4)將步驟幻所述的重組表達質粒6轉化到感受態細胞，再轉化到宿主表達系統進行表達，即得所述融合蛋白。
12.根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，步驟1)的質粒1和步驟幻的質粒 3均為pUC57質粒；步驟3中的質粒5為pPICZ α質粒。
13.根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述宿主是酵母。
14.一種含有權利要求1所述的融合蛋白的編碼基因的重組表達載體。
15.一種含有權利要求14所述的重組表達載體的宿主表達系統。
16.權利要求1所述的融合蛋白在制備治療原發性或繼發性血小板減少癥的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種血小板生成素模擬肽TMP的二聯體與人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制備方法和應用。所述融合蛋包含1個HSA和2個TMP，其中HSA位于融合蛋白的N-末端，2個TMP序列串聯成二聯體位于融合蛋白的C-末端，或HSA位于融合蛋白的C-末端，2個TMP序列串聯成二聯體位于融合蛋白的N-末端；在HSA與TMP二聯體之間以及兩個TMP之間均設有連接肽。所述融合蛋白具有顯著促進血小板生成的特性，且在體內具有較長的半衰期，可用于制備治療多種原發性或繼發性血小板減少癥等疾病的藥物。
文檔編號C12N1/21GK102408485SQ201110420870
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者王軍平, 王崧, 王艾平, 申明強, 粟永萍, 許楊, 陳芳, 陳默 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學