專利名稱：抗肺腺癌藥物，其制備方法和其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗肺腺癌藥物，該藥物的制備方法，以及該藥物活性成分在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。
背景技術：
升麻是我國十分常用的著名中藥，主要為毛茛科植物三葉升麻Cimicifuga heracleifolia Kom、興安升麻C.dahurica Maxim、升麻或綠升麻C.foetida L.的干燥根莖，這三種藥用植物的根莖已經作為中藥升麻Cimicifugafoetida L.收載入《中華人民共得國藥典》(2001年版)。升麻具有發表透疹，清熱解毒，升舉陽氣的功效；常被用于風熱頭痛，齒痛，口瘡，咽喉腫痛，麻疹不透，陽毒發斑，脫肛，子宮脫垂等病癥。中藥升麻Cimicifuga foetida L.主要產于云南、貴州、四川、湖北等地，是大量栽培的常用中藥材。現有技術中未見有從中藥升麻中提取分離的化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三環氧-12-乙酰氧基-27-羥基-9，19-環羊毛甾錠-3-O-β-D-吡喃木糖甙以及提取分離的活性部位BF作為抗肺腺癌藥物活性成分的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種以有效量的化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三環氧-12-乙酰氧基-27-羥基-9，19-環羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙或升麻提取的活性部位BF為活性成分并配于藥學上可接受的載體組成的抗肺腺癌藥物。
本發明的另一目的在于提供上述藥物的制備方法。
本發明的進一步目的在于提供本發明活性化合物或活性成分在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。
本發明的上述目的是通過下述技術方案予以實現的一種抗肺腺癌的藥物，其中含有有效量的化合物阿特因即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三環氧-12-乙酰氧基-27-羥基-9，19-環羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙和藥學上可接受的載體。
一種抗抗肺腺癌的藥物，其中含有有效量的升麻提取活性部位BF和藥學上可接受的載體。
上述抗肺腺癌藥物的制備方法，取升麻Cimicifuga foetida L.的根莖，粉碎后用甲醇提取三次，每次3-4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣后，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚后，濃縮得到石油醚提取部位，然后水層再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，用硅膠柱層析分離2-3次，洗脫液用氯仿∶甲醇或氯仿/丙酮梯度洗脫，得到活性部位BF，該活性部位BF用硅膠柱層析分離，氯仿/甲醇梯度洗脫，結晶純化得到化合物阿特因；BF或阿特因加入藥學上可接受的載體，得抗肺腺癌藥物。
更具體的制備方法為取升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根莖，粉碎后用甲醇提取三次，每次4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣后，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋之后，用石油醚萃取三次，回收石油醚后，濃縮得到石油醚提取部位，然后水層再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，再用1000g硅膠柱層析分離，洗脫液用氯仿∶甲醇從100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脫，由氯仿/甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部位Fr.4，該分離部位Fr.4用2000g硅膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從50∶1；40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脫，由氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.1；由氯仿∶甲醇30∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.2；由氯仿∶甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.3；Fr.4.2用1000g硅膠柱層析再次分離，用氯仿∶甲醇40∶1，30∶1洗脫液洗脫得由化合物阿特因和其他升麻甙類化合物的醇混合體組成的活性部位BF、分離部位Fr.4.2.1和分離部位Fr.4.2.2等；活性部位BF用300g硅膠柱層析分離，用氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到化合物阿特因；BF或阿特因加入藥學上可接受的載體，得抗肺腺癌藥物。
此外，本發明還提供了化合物阿特因以及升麻提取活性部位BF在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。
本發明的化合物阿特因即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三環氧-12-乙酰氧基-27-羥基-9，19-環羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙或活性部位BF用作藥物上時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用，該藥物組合物含有0.1-99％，優選0.5-90％的(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三環氧-12-乙酰氧基-27-羥基-9，19-環羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙或BF，其余為藥物學上可接受的，對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、超填料以及藥物制品輔劑。將所述的有效成分以單位體重服用量的形式使用。
本發明的藥物可經口服給藥。口服可用其固體或液體制劑，如片劑、散劑、糖衣劑、膠囊、針劑等。
本發明抗肺腺癌藥物的制備方法可采用取中藥升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根莖，的根莖，粉碎后用甲醇提取三次，每次3-4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣后，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚后，濃縮得到石油醚提取部位，然后水層再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，用硅膠柱層析分離2-3次，洗脫液用氯仿∶甲醇或氯仿/丙酮梯度洗脫，得到活性部位BF，該活性部位用硅膠柱層析分離，氯仿/甲醇梯度洗脫，結晶純化得到化合物阿特因；BF或阿特因加入藥學上可接受的載體即得抗肺腺癌藥物。
具體實施例方式下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質，但本發明的內容并不局限于此。
實施例11、阿特因即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三環氧-12-乙酰氧基-27-羥基-9，19-環羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙(以下簡稱K-314)以及活性部位BF的提取分離及制備取升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根莖2.5Kg，粉碎后用甲醇提取三次，每次約4小時甲醇提取液過濾除去藥渣后，減壓濃縮至蒸不出甲醇；再加一定量的水稀釋之后，用石油醚萃取三次，回收石油醚后，濃縮得到187g石油醚提取部位；然后水層再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，濃縮得到214.5g乙酸乙酯提取部位。214.5g乙酸乙酯提取部位用1000g硅膠柱層析分離，洗脫液用氯仿∶甲醇從100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脫，由氯仿/甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部位Fr.4重約135g。該分離部位135g Fr.4用2000g硅膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從50∶1；40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脫，由氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.1重約30g；由氯仿∶甲醇30∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.2重約80g；由氯仿∶甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.3重約23g。分離部位80g Fr.4.2用1000g硅膠柱層析再次分離，用氯仿∶甲醇40∶1，30∶1洗脫液洗脫得到各種部分，如由化合物K314和其他升麻甙類化合物的混合體組成的活性部位BF，分離部位Fr.4.2.1和分離部位Fr.4.2.2三部分；活性部位BF30g用300g硅膠柱層析分離，用氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到化合物K314，結晶析出K314的純品約850mg。
2、K-314化合物的結構確定K-314化合物C37H56O11，無色棱晶，mp232-234℃，[α]D＝-66.0°(c 1.80，MeOH∶CHCl31∶1)。
氫核磁共振譜數據δ(ppm)(溶劑Py-d5)5.66(1H，s，27-H)，5.05(1H，dd，J＝9，4Hz，12-H)，4.57(1H，dd，J＝14，7Hz，16-H)，3.86(1H，s，24-H)，3.42(1H，dd，J＝11，4Hz，3-H)；2.69(1H，dd，J＝16，9Hz)1.20(1H，m)(11-H)；2.23(1H，m)1.80(1H，m)(2-H)；2.20(1H，m)1.63(1H，m)(22-H)；1.93(1H，m)1.53(1H，m)(15-H)；1.80(1H，m，20-H)，1.75(1H，s，26-H)，1.72(1H，m，17-H)，1.59(1H，m，8-H)，1.34(3H，s，18-H)；1.56(1H，m)1.15(1H，m)(1-H)；1.43(1H，m)0.64(1H，m)(6-H)；1.27(3H，s，29-H)；1.23(1H，m)0.90(1H，m)(7-H)；1.22(1H，s，5-H)，0.97(3H，d，J＝6Hz，21-H)，0.96(3H，s.30-H)，0.79(3H，s，28-H)，0.59(1H，d，J＝4Hz)0.25(1H，d，J＝4Hz)(19-H).12-COCH3部分2.11(3H，s，2’-COCH3)。木糖部分4.78(1H，d，J＝7.0Hz，1’-H)，3.94(1H，t，J＝6.7Hz？，2’-H)，4.10(1H，dd，J＝2.7，7.6Hz？，3’-H)，4.18(1H，m，4’-H)；3.67(1H，m，5’-H)，4.30(1H，dd，J＝5，10Hz，5’-H)。
碳核磁共振譜數據δ(ppm)(溶劑Py-d5)105.84(s，23-C)，98.42(s，26-C)，88.08(d，3-C)，78.08(d，12-C)，73.06(d，16-C)，65.60(s，25-C)，63.46(s，24-C)，56.44(d，17-H)，48.74(s，13-C)，47.84(s，14-H)，46.98(s，5-C)，45.69(s，8-C)，43.57(t，15-C)，41.22(s，4-C)，37.61(t，22-C)，36.71(t，11-C)，31.91(t，1-C)，29.94(t，2-C)，29.52(t，19-C)，26.74(s，10-C)，26.00(d，20-C)，25.69(t，7-C)，25.69(q，29-C)，21.00(q，21-C)，20.10(t，6-C)，20.10(s，9-C)，19.50(s，28-C)，15.33(q，30-C)，13.54(q，18-C)，13.12(q，27-C)。12-COCH3部分171.61(s，CO)，21.67(q，COCH3)。木糖部分107.60(s，1’-C)，75.63(d，2’-C)，78.69(d，3’-C)，71.27(d，4’-C)，67.16(t，5’-C)。
紅外光譜數據vmax(KBr)(cm-1)3500-3350(OH)，1715(C＝O).
化合物K-314的化學結構為Actein(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三環氧-12-乙酰氧基-27-羥基-9，19-環羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙[(20R，24R)-24，25-16-23-23，27-triepoxy-12-acetoxyl-27-hydroxyl-9，19-Cyclolanostanel-3-O-β-D-xylopyranoside]
K-314化合物的化學結構為 2、抗腫瘤生物活性測定材料和方法抗腫瘤活性的評價采用改良的MMT方法。MMT方法是一種日益受到重視的體外抗癌活性評價方法，此方法客觀性強，能實現半自動化，比同位素核酸前體參入法簡便。但以往該法多用酸化異丙醇等溶劑作為溶解液，使MMT的還原產物---甲臜和蛋白質沉淀等的溶解很不完全，造成更換培養液和劇烈振搖等步驟煩瑣，結果的可靠性也隨之降低。周建軍等針對MMT方法的一些缺陷，做了進一步的改良[3]改良的MMT方法采用了溶解作用強的三聯溶解液，可以不象原來方法中，加MMT之前，需要吸棄或離心去除更換原先的培養液，達到除去其中血清蛋白等成分以免造成干擾，也不必在加MMT生成甲臜后，劇烈振蕩培養板助溶。這樣不僅操作煩瑣，更換培養液要損失20-30％的細胞。周建軍等的改良方法簡化了操作，還提高了可靠性，更適合于大量抗癌藥物的體外篩選和藥敏測定。因而本專利中的抗腫瘤活性實驗采用改良的MMT方法。
試驗前準備樣品用二甲亞砜溶解成10毫克每毫升的濃度作為儲藏液并且在4攝氏度黑暗下保存。樣品的儲藏液在使用前用未免疫的鹽水稀釋到試驗濃度。
細胞排列和培養小鼠艾氏腹水癌細胞株、人胃癌細胞株和人乳腺癌細胞株是來自美國模式菌種收集中心。所有的細胞在RPMI-1640介質中生長，加入10％的熱鈍化的無活性的免疫血清，2納摩的L-谷氨酸鹽，100效價的盤尼西林，100ug/ml的鏈霉素和PH7.4的10毫摩的HEPES。細胞被保存在37攝氏度下、潮濕的含5％CO2的培養箱中。
細胞生長抑制方法樣品對腫瘤細胞的生長抑制是通過微量培養四唑分析法測量的，只有較小的調整。簡單地，黏附的腫瘤細胞被播種到96孔的微量培養皿，在加入藥劑之前使其粘著24小時，懸浮細胞是在藥品加入前播種。每個腫瘤細胞列在不同階段(粘著細胞是72小時，懸浮細胞是48小時)加入5個濃度(0.01，0.1，1，10，100mg/ml)的樣品，并且每個濃度重復三次。在加入樣品后的末期把5mg/ml的MTT加入到每個孔中，并把培養皿放在37攝氏度的條件下培養4小時，然后再加入三相混合溶液(10％的SDS，5％的異丙醇和0.012摩的鹽酸)，再把培養皿放在37攝氏度下培養12-20小時。在570納米的感光鏡上讀取光密度。樣品對腫瘤的細胞毒性是用IC50值表達的，并且用LOGIT方法進行計算。
生物活性測試參考文獻1.Mosmman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survivalApplication to proliferation and eytotoxicity assays.J.Immunol.Meth.1983；6555-632.Alley MC，Scudiero DA，Monks A et al.Feasibility of drug screenig withpanels of human tumor cell lines using a microculture assay.CancerRes.1988；48589-6013.Zhou JJ，Yue XF，Han JX et al.Improved MTT assay for activity ofantitumor agents.Chin J Pharm(中國醫藥工業雜志)1993，24(10)455-457從表1和表2可以看出化合物K-314具有十分顯著的抑制人肺腺癌細胞株(K549)的活性，IC50為0.37μg/mL；特別是化合物K-314對人肺腺癌細胞株(K549)的細胞毒活性已經超過陽性對照常用的著名抗癌藥物順鉑(cis-platin)，其IC50僅為0.72μg/mL。而順鉑對人類紅白血病細胞株(K562)也有顯著活性，IC50為0.34μg/mL。但是化合物K-314對人類紅白血病細胞株(K562)抑制作用非常弱，幾乎沒有活性，IC50＞100μg/mL；說明化合物K-314的抗腫瘤活性，具有十分明顯的選擇性，對人肺腺癌細胞株(K549)的抑制活性遠遠超過著名的臨床抗腫瘤藥物順鉑，而化合物K-314對人類紅白血病細胞株(K562)則基本上沒有抑制腫瘤細胞的活性。由此可以化合物K-314與順鉑(cis-platin)的抗腫瘤活性在靶點上具有相當的不同之處和特殊性，是十分有意義的抗腫瘤化合物。
表1 化合物K-5，K-6樣品對腫瘤細胞的抑制率 A549人肺腺癌細胞株；K562人類紅白血病細胞株；K-314抗腫瘤生物活性的測定結果表2 化合物K-314對人肺腺癌細胞株(A549)、人類紅白血病細胞株(K562)的細胞毒活性IC50(μg/mL)試驗化合物 分子量(MW) K562 A549化合物K-314 676 ＞1000.37cis-platin 0.34 0.72(陽性對照，順鉑)實施例2按實施例1制得K-314，按K-314與賦形劑重量比1∶5的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實施例3片劑K-314 20mg淀粉100mg玉米漿 適量硬脂酸鎂適量實施例4按實施例1制得K-314，按常規膠囊制劑方法制成膠囊。
實施例5膠囊劑K-314 20mg淀粉 100mg葡萄糖200mg硬脂酸鎂 適量制備方法將K-314與助劑研勻混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊。
實施例6按實施例1制得乙酸乙酯提取的活性部位BF，按BF與賦形劑重量比1∶1的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實施例7片劑BF 1g淀粉150mg玉米漿 適量硬脂酸鎂適量實施例8膠囊劑BF1g淀粉 150mg葡萄糖300mg硬酯酸鎂 適量制備方法將BF.與助劑研勻混合，過篩。在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊。
權利要求
1.一種抗肺腺癌的藥物，其中含有有效量的化合物阿特因即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三環氧-12-乙酰氧基-27-羥基-9，19-環羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙和藥學上可接受的載體。
2.一種抗抗肺腺癌的藥物，其中含有有效量的升麻提取活性部位BF和藥學上可接受的載體。
3.權利要求1或2抗肺腺癌藥物的制備方法，其特征在于取中藥升麻的根莖，粉碎后用甲醇提取三次，每次3-4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣后，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚后，濃縮得到石油醚提取部位，然后水層再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，用硅膠柱層析分離2-3次，洗脫液用氯仿∶甲醇或氯仿/丙酮梯度洗脫，得到活性部位BF，該活性部位用硅膠柱層析分離，氯仿/甲醇梯度洗脫，結晶純化得到化合物阿特因；BF或阿特因加入藥學上可接受的載體即得抗肺腺癌藥物。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于取升麻Cimicifuga foetidaL.的干燥根莖，粉碎后用甲醇提取三次，每次4小時，甲醇提取液過濾除去藥渣后，減壓濃縮至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀釋之后，用石油醚萃取三次，回收石油醚后，濃縮得到石油醚提取部位，然后水層再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，濃縮得到乙酸乙酯提取部位，再用1000g硅膠柱層析分離，洗脫液用氯仿∶甲醇從100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脫，由氯仿/甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部位Fr.4，該分離部位Fr.4用2000g硅膠柱層析再次分離，繼續用洗脫液用氯仿∶甲醇從50∶1；40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脫，由氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.1；由氯仿∶甲醇30∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.2；由氯仿∶甲醇20∶1洗脫液洗脫得到的部分，濃縮后得到分離部位Fr.4.3；Fr.4.2用1000g硅膠柱層析再次分離，用氯仿∶甲醇40∶1，30∶1洗脫液洗脫得出化合物阿特因和其他升麻甙類化合物的混合體組成的活性部位BF、分離部位Fr.4.2.1和分離部位Fr.4.2.2等；活性部位BF用300g硅膠柱層析分離，用氯仿∶甲醇40∶1洗脫液洗脫得到化合物阿特因；BF或阿特因加入藥學上可接受的載體，得抗肺腺癌藥物。
5.化合物阿特因在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。
6.升麻提取活性成分BF在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。
全文摘要
提供一種以有效量的化合物(20R，24R)－24，25－16，23－23，27－三環氧－12－乙酰氧基－27－羥基－9，19－環羊毛甾烷－3－O－β－D－吡喃木糖甙或升麻提取的活性部位BF為活性成分并配于藥學上可接受的載體組成的抗肺腺癌藥物，上述藥物的制備方法，以及本發明活性化合物或活性成分在制備治療肺腺癌的藥物中的應用。
文檔編號A61K31/7048GK1650880SQ200410079519
公開日2005年8月10日 申請日期2004年10月22日 優先權日2004年10月22日
發明者邱明華, 孫麗榮, 卿晨, 張雁麗, 李忠榮, 周琳, 裴盛基 申請人:中國科學院昆明植物研究所