專利名稱：制備n－末端修飾的趨化因子的方法
技術領域：
本發明涉及一種從重組體制得的Gln-MCP-1制備pyroGlu-MCP-1的方法，以及含有pyroGlu-MCP-1制劑的組合物。
MCP-1(單核細胞化學吸引蛋白-1；也已知稱為單核細胞趨化性和活化因子‘MCAF’、巨嗜細胞趨化因子‘MCF’、腫瘤壞死因子刺激的基因-8‘TSG-8’‘HC-11’、平滑肌細胞趨化因子‘SMC-CF’、淋巴細胞衍生的趨化因子‘LDCF’以及神經膠質瘤衍生的趨化因子‘GDCF’)是CC-趨化因子家族中的一員。人的MCP-1-蛋白最初描述在美國專利US 5714578中。是在自然條件下在有機體(天然的)內合成為99個氨基酸長度的前體蛋白，隨后將其處理為具有76個氨基酸基的肽。成人MCP-1(hMCP-1)是分子量為14kDa的一種糖蛋白，并由多種細胞(例如平滑血管肌細胞和內皮細胞)所分泌(Leonard和Yoshimura(1990)，Immology Today 11，97-101)。其含有兩個分子內的二硫橋并且在自然表達下被O-糖基化和唾液酰化(sialylyliert)(J.Yan Ling等(1990)，Joumal of Biological Chemistry，265，18318-18321)。
所述蛋白質是染色體定位為17ql 1.2-q21.1的JE-基因的產物。該基因定位也已知為SCY A2(“小誘導細胞因子(small inducible cytokine)A2”)。所述人體基因最初描述在美國專利US 5212073中。該基因的表達可被例如腫瘤壞死α因子的多種細胞因子所誘導以及也被例如免疫球蛋白G所誘導。所述基因序列和其他基因和基因產物的信息可以通過保藏號M37719在NCBI-數據庫中得到(參見表1)。
表1
堿基數 700a 727c 565g 781t 3其他來源1cagttcaatg tttacacaat cctacagttc tgctaggctt ctatgatgct actattctgc61 atttgaatga gcaaatggat ttaatgcatt gtcagggagc cggccaaagc ttgagagctc121 cttcctggct gggaggcccc ttggaatgtg gcctgaaggt aagctggcag cgagcctgac181 atgctttcat ctagtttcct cgcttccttc cttttcctgc agttttcgct tcagagaaag241 cagaatcctt aaaaataacc ctcttagttc acatctgtgg tcagtctggg cttaatggca301 ccccatcctc cccatttgcg tcatttggtc tcagcagtga atggaaaaaa gtgctcgtcc361 tcacccccct gcttcccttt cctacttcct ggaaatccac aggatgctgc atttgctcag421 cagatttaac agcccactta tcactcatgg aagatccctc ctcctgcttg actccgccct481 ctctccctct gcccgctttc aataagaggc agagacagca gccagaggaa ccgagaggct541 gagactaacc cagaaacatc caattctcaa actgaagctc gcactctcgc ctccagcatg601 aaagtctctg ccgcccttct gtgcctgctg ctcatagcag ccaccttcat tccccaaggg661 ctcgctcagc caggtaaggc cccctcttct tctccttgaa ccacattgtc ttctctctga721 gttatcatgg accatccaag cagacgtggt acccacagtc ttgctttaac gctacttttc781 caagataagg tgactcagaa aaggacaagg ggtgagcccc aaccacacag ctgctgctcg841 gcagagcctg aactagaatt ccagctgtga acccaaatcc agctccttcc aggattcagg901 atccagctct gggaacacac tcagcagtta ctcccccagc tgcttccagc agagtttggg961 gatcagggta atcaaagaga agggtgggtg tgtaggctgt ttccagacac gctggagacc1021 cagaatctgg tctgtgcttc attcacctta gcttccagag accggtgact ctgcaggtaa1081 tgagtatcag ggaaactcat gaccaggcat agctattcag agtctaaaag gaggctcata1141 gtggggctcc cagctgatct tccctggtgc tgatcatctg gattattggt ccgtcttaat1201 gacacttgta ggcattatct agctttaaca gctcctcctt ctctctgtcc attatcaatg1261 ttatataccc cattttacag cataggaaac tgagtcattg ggtcaaagat cacattctag1321 ctctgaggta taggcagaag cactgggatt taatgagctc tttctcttct cctgcctgcc1381 ttttgttttt tcctcatgac tcttttctgc tcttaagatc agaataatcc agttcatcct1441 aaaatgcttt tctttgtggt ttattttcca gatgcaatca atgccccagt cacctgctgc1501 tataacttca ccaataggaa gatctcagtg cagaggctcg cgagctatag aagaatcacc1561 agcagcaagt gtcccaaaga agctgtgatg tgagttcagc acaccaacct tccctggcct1621 gaagttcttc cttgtggagc aagggacaag cctcataaac ctagagtcag agagtgcact1681 atttaactta atgtacaaag gttcccaatg ggaaaactga ggcaccaagg gaaaaagtga1741 accccaacat cactctccac ctgggtgcct attcagaaca ccccaatttc tttagcttga1801 agtcaggatg gctccacctg gacacctata ggagcagttt gccctgggtt ccctccttcc1861 acctgcgtcc tcctagtctc catggcagct cgcttttggt gcagaatggg ctgcacttct1921 agaccaaaac tgcaaaggaa cttcatctaa ctctgtctcc tcccttcccc acagcttcaa1981 gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag aagtgggttc aggattccat2041 ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga acactcactc cacaacccaa2101 gaatctgcag ctaacttatt ttcccctagc tttccccaga caccctgttt tattttatta2161 taatgaattt tgtttgttga tgtgaaacat tatgccttaa gtaatgttaa ttcttattta2221 agttattgat gttttaagtt tatctttcat ggtactagtg ttttttagat acagagactt2281 ggggaaattg cttttcctct tgaaccacag ttctacccct gggatgtttt gagggtcttt2341 gcaagaatca ttaatacaaa gaattttttt taacattcca atgcattgct aaaatattat2401 tgtggaaatg aatattttgt aactattaca ccaaataaat atatttttgt acaaaacctg2461 acttccagtg ttttcttgaa ggaaattaca aagctgagag tatgagcttg gtggtgacaa2521 aggaacatga tttcagaggg tggggcttac attttgaagg aatgggaaag tggattggcc2581 cnntntcttc ctccactggg tggtctcctc tgagtctccg gtagaagaat ctttatggca2641 ggccagttag gcattaaagc accacccttc cagtcttcaa cataagcagc ccagagtcca2701 atgaccctgg tcacccattt gcaagagccc acccccattt cttttgctct cacgaccctg2761 accctgcatg caattt//在上述US 5714578中已描述，如果是一種從天然源分離的MCP-1蛋白，則N-末端被封端。僅在最近發現，這是由于轉錄后修飾，其中前導序列在成熟蛋白的N-末端分裂后露出谷氨酰胺，失去一個NH3分子環化為焦谷氨酸基。
在US 5212073中對編碼為MCP-1的可讀框的識別使該蛋白的重組體表達成為可能。以重組體法例如在大腸桿菌中制得的MCP-1不具有天然MCP-1典型的N-或O-糖基化樣式。由此方法制得的MCP-1-制劑也不對抗Edman分解，以同樣方式如由天然材料得到的制劑，即它還含有不封端的N-末端(谷氨酰胺)。在基于在巨噬細胞的趨化作用的細胞系中，最初在天然的MCP-1-制劑和以重組體法得到的生物活性之間沒有發現差別。
MCP-1在生理條件下對于β-趨化因子-受體CCR2和CCR4起到一種激動劑作用，這兩者主要在單核細胞上表達，并也在嗜堿細胞以及在T-和B-淋巴細胞上發現。MCP-1在亞納摩爾(subnanomolar)濃度下就可以誘導單核細胞趨化性。受體CCR2和CCR4是G-蛋白-耦合的七-跨膜區-受體，其導致單核細胞的活化并增強整聯細胞的附著。該過程最后導致單核細胞停靠到內皮細胞，并其后單核細胞從血管體系中離開。
WO 98/44953公開了MCP-1對動脈生成的影響，也就是側枝動脈和/或來自存在的動脈連接的其他動脈的生長。基于該發現，在所述國際專利申請中提出MCP-1用于治療目的，即用于治療血管梗阻病，該病癥通過刺激新血管形成而得到緩解。這種血管梗阻病特別是冠狀動脈病(coronary arterydisease，CAD)、末梢動脈閉塞病癥(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)、腦動脈和腸膜(mesenteriale)動脈梗阻癥，等等。此外還提出MCP-1-中和劑，例如抗-MCP-1-抗體，用于預防新血管形成，尤其是其可以抑制腫瘤生長，其依賴于血液供應充足，因而腫瘤組織充分血管化。
如上所述，為了可以將MCP-1-蛋白用于治療用藥，以促進組織血管化，必須提供具有藥用足夠純度的足夠大量的蛋白。人MCP-1最初是以天然形式由培育人的神經膠質瘤細胞系U105MG或者由人末梢血液的單核白細胞得到的。從這些來源分離打算用于治療目的的蛋白由于以下原因而行不通，以此方式只能在難以接受的高成本和/或材料使用下才能獲得足夠大的量不能以所需量得到人的白細胞。神經膠質瘤細胞實際上可以快速不受限制地繁殖，但不適合以生物技術的發酵進行培育，此外還需要例如胎牛血清進行培育，因而帶來所有相關問題。
因此，代替天然表達MCP-1而提出以重組體法制備MCP-1。事實上已經可以買到重組體的人MCP-1，特別是從R & D Systems公司(分類號279-MC)和Peprotech公司(分類號300-04；見表2；所給的分類號是基于2003年1月的標準)購得。按照商購產品說明，購得的重組體MCP-1-制劑含有一種其中所含的MCP-1-蛋白其在N-末端有氨基酸谷氨酰胺(Q)。此外，該產品說明也指出，該蛋白制劑特別是在重組體的液態下很敏感(推薦在4℃下貯存最多1周)。事實上發明人實驗(現有技術內)證實，以溶解狀態貯存常規MCP-1-蛋白制劑時，該(生物活性的)蛋白制劑特別是在超過4℃溫度下，有很快被分解產物污染的跡象(在分析性HPLC-色譜中出現副帶)。
表2(摘自Peprotech公司的互聯網址http//www.peprotechcom/content/details.htm？results＝l&prod＝1392)重組體人MCAF(人MCP-1)
一種重組體制備人MCP-1-蛋白的傳統方法包括通過將蛋白的溫度誘導表達為融合蛋白，純化由此形成的內含體，使其進入溶液中，使蛋白重折疊，隨后從所述融合蛋白酶解釋放hMCP-1蛋白。
在重組體制備人MCP-1-蛋白的常規方法中出現以下問題通過常常得到一種因一個或多個氨基酸而N-端縮短的蛋白質作為副產物。該副產物在生物系統中表現為MCP-1-受體的拮抗劑。
在Van Coillie等人(1998)，Biochemistry 3712672，12673a.E.描述了一種方法，涉及N-末端修飾對MCP-2生物活性影響的實驗，該方法中，一種由重組體法得到的、MCP-2-制劑在0.01M Na2HPO4、pH 8.0中在37℃下培育24小時。在氨基酸序列平面(Ebene)上，MCP-2具有與MCP-1的62％的同源性，區別還在于，與MCP-2相反，在N-末端未修飾的MCP-1是生物活性的(參見表2中“生物活性”一行)。作者沒有確定在上述條件下N-末端的谷氨酰胺-基轉化為焦谷氨酸-基的程度。發明人還發現(現有技術內)，對MCP-1應用可比較的條件，無論如何只能導致N-末端的氨基酸部分環化(參見表3，對比實驗2)。
因此，與上述說明有關的本發明任務是提供一種方法，通過該方法可以制得一種MCP-1-制劑(MCP-1組合物)，該制劑(a)由于其生物活性而適用于治療目的，和(b)就藥物法規許可法提供了優點，其包括生物藥物情況下特別難以滿足的要求，例如關于純度和制備藥物的可再生產性，特別是(c)具有較高的貯存穩定性。因此，相關的另一任務是提供組合物或制劑，其含有以重組體法制得的MCP-1，并適用于上述目的或者提供上述優點。
這些任務是通過權利要求中所述的方法和含有MCP-1的組合物而實現的。
根據本發明，提供一種由重組體制得的Gln-MCP-1制備(焦)pyroGlu-MCP-1的方法，該方法中，在30℃～80℃的溫度，優選在30℃～70℃，更優選在35℃～60℃下，在緩沖溶液中培育Gln-MCP-1，在緩沖液中鹽濃度為10mM～160mM，優選為10mM～100mM，其pH-值為2～7.5，優選3.5～7.5，更優選3.5～6.5，更優選5～6.5，更優選5.5～6.5，更優選約6的pH-值。進行長時間培育，直到含于培育緩沖溶液中的至少90％，優選至少95％，更優選至少96％的MCP-1以焦Glu-MCP-1的形式存在。
根據上下文，本公開范圍內的“MCP-1”是指這樣的MCP-1-蛋白(沒有前(Prpro)序列)，該蛋白具有N-末端的谷氨酰胺-基(“Gln-MCP-1”；參見表1和表2中所示的氨基酸序列)或者具有已轉化/環化為焦谷氨酸-基的N-末端(“pyroGlu-MCP-1”)。不過，對MCP-1-蛋白進行修飾是容易理解的，該修飾不影響其生物功能(特別是單核細胞吸引活性或對CCR-受體的作用)，并且不改變所述蛋白的結構，以致使得上述反應參數不再產生理想的結果(按照本發明方法，所述蛋白也不再能夠轉化為pyroGlu-變體)，不脫離保護范圍。這樣，本發明方法自然也可以用于MCP-1，其中進行保持氨基酸交換，例如絲氨酸成為蘇氨酸或者亮氨酸成為異亮氨酸，只要所述交換既不影響所得蛋白的生物功能或活性，也不影響根據以上方法使N-末端谷氨酰胺轉化為焦谷氨酸。因此，本發明方法也可用于其他哺乳動物的MCP-1蛋白，例如家鼠、老鼠、豚鼠、家兔和鼬(以及更多種)。
用于上述方法中的緩沖溶液優選是磷酸鹽緩沖的(磷酸鈉和/或磷酸鉀緩沖的)較低摩爾濃度或生理摩爾濃度的水溶液，即，10～160mM，10～80mM，10～50mM，20～40mM或約20或40mM。如果經受較長的培育時間，則按照本發明的一個特定實施方案，也可在生理摩爾濃度，例如約150mM鹽濃度下進行處理，該摩爾濃度優選通過使用一種磷酸鹽緩沖的生理鹽溶液或“PBS”而得到。較長培育時間的缺點(伴隨著分解產物、副產物或氧化產物有增加量的危險)可被該特定實施方案的優點所彌補，同樣能夠以具有生理鹽濃度的溶液形式得到蛋白制劑。
此外，用于修飾步驟的緩沖溶液還可以含有例如(溫和的)清潔劑、抗氧化劑、防腐劑、絡合劑、穩定劑、抗微生物試劑，等等。
選擇培育溫度為30℃～80℃，即超過室溫。在較低的溫度下，轉化步驟進展很緩慢。盡管如此，為了實際上實現完全轉化，必須大大加長培育時間，超過一周。這將導致生物工藝方法過程難以接受的使用時間，并且，還顯著提高了蛋白質溶液其他雜質(通過分解產物或氧化產物，通過細菌、病毒和另外的病原菌)的危險。另一方面，培育溫度升高到超過80℃，雖然強烈加速轉化反應，但也更強烈地形成不希望的副產物和分解產物(參見實施例1和2)。如果可接受最多6天的使用時間，則特別優選培育溫度為35～40℃。在可以明顯更短地培育情況下，則對此也可在例如50到60、70或80℃下進行培育。40～50℃的溫度當然也可產生理想的結果。
培育緩沖溶液的pH-值應在2～7.5范圍內，也可在中性到酸性范圍內。優選在3.5～7.5范圍內，更優選在3.5～6.5范圍內，更優選在5～6.5范圍內，更優選在5.5～6.5范圍內，并且更優選選擇約為6的pH-值。
例如在實施例中詳細描述的在合適選擇的上述參數下，可以得到至少90％的純度，也可以更高的純度例如95％、96％或98％的pyroGlu-MCP-1-變體，其中，pyroGlu-MCP-1量(例如以在HPLC-洗脫曲線中以曲線下的面積計算出)的百分數是基于在溶液中存在的總MCP-1量(即包括任何剩余量的Gln-MCP-1部分和可能的氧化產物和其他副產物或分解產物)表示的。
根據本發明另一實施方案，提供一種制備pyroGlu-MCP-1-制劑的方法，該方法至少包括以下步驟-以重組體法制備Gln-MCP-1-制劑，通過在宿主細胞中編碼MCP-1的基因結構的表達而進行，-任選濃縮和/或純化含于Gln-MCP-1-制劑中的Gln-MCP-1，最后-將在Gln-MCP-1-制劑中所含的或在濃縮和/或純化前所含于其中的Gln-MCP-1轉化為含有蛋白分子種類pyroGlu-MCP-1的pyroGlu-MCP-1-制劑，該步驟按照以上描述的“用于從重組體制得的Gln-MCP-1制備pyroGlu-MCP-1的方法”進行。
任選地，該方法還可包括例如重新緩沖(umpuffem)pyroGlu-MCP-1-制劑或進一步純化，例如通過隨后的柱色譜、滲析、超濾等步驟進行。
生物技術制備重組體蛋白的方法是已知的。該方法尤其是包括發酵步驟、純化步驟、濃縮步驟和其他步驟。以上提及的轉化步驟可在不同點插入這種“多步法”內，還可以使用例如很大程度上未純化或者已完全純化的MCP-1-蛋白溶液作為起始溶液。尤其也可考慮以下方法過程，該方法中，以較多純化、較少純化或實際上完全純化形式的尚未(完全)轉化的Gln-MCP-1，冷凍干燥以改善其以尚未轉化的形式的儲存壽命，在給定時間內再次進入溶液中，然后按照以上方法轉化為pyroGlu-MCP-1。當然也可以在轉化為pyroGlu-MCP-1后，將所得的蛋白溶液冷凍干燥。
根據本發明，該方法產物，即進行N-末端修飾(轉化)的pyroGlu-MCP-1-制劑，含有pyroGlu-MCP-1的量以MCP-1的總量計(轉化的加上未轉化的蛋白加上例如通過氧化產生的副產物)，為至少90％，優選至少95％，更優選至少96％。
術語(Gln-或pyroGlu-MCP-1-)“制劑”指的是，在不同方法步驟中，MCP-1-蛋白以溶解方式存在于(緩沖-)溶液中，因此除了MCP-1還可存在其他成分，其中肯定有所用緩沖鹽的離子，以及可能還有其他鹽、抗氧化劑、穩定劑、抗微生物試劑、清潔劑、防腐劑、絡合劑，等等。
根據本發明另一方面提供一種組合物，該組合物含有按照上述方法制得的pyroGlu-MCP-1或pyroGlu-MCP-1-制劑，其中，組合物(轉化的加上未轉化的蛋白加上副產物；即例如HPLC洗脫色譜中“曲線下的面積”)中所含至少90％的MCP-1以pyroGlu-MCP-1的形式存在。
因此，本發明的主題還在于一種以重組體法尤其是以原核生物并且特別優選以大腸桿菌制得的MCP-1-制劑，其中至少90％的MCP-1-蛋白是以pyroGlu-MCP-1存在。在常見的表達細胞中進行制備時，該蛋白(與天然產物不同)常常不呈現天然的糖基化樣式。尤其是在原核生物例如大腸桿菌中進行制備時，與人體天然表達時存在的形式相反，所得的pyroGlu-MCP-1或所得的pyroGlu-MCP-1-制劑沒有被糖基化和/或唾液酰化，并因此不同于這種天然蛋白或由天然源得到的蛋白制劑。
這種本發明的組合物尤其可以是一種藥物或一種藥物組合物，其除了含有占總MCP-1-含量(轉化的加上未轉化的蛋白加上副產物)的至少為90％、95％或96％的pyroGlu-MCP-1部分外，還含有常見的助劑和載劑、鹽、抗氧化劑、穩定劑、抗微生物試劑、清潔劑、防腐劑、絡合劑，等等。本發明組合物可用于治療患有動脈梗阻癥例如尤其是PAOD或CAD的病人。所述治療包括以合適途徑給藥以治療有效量的這種組合物，例如經動脈內注入或者以動脈周圍安放的凝膠形式，從該凝膠MCP-1-蛋白長時間地進行釋放。
令人驚訝地還發現，與預料不同，在水溶液和在較高溫度下培育以重組體法制得的MCP-1-蛋白制劑不會導致其分解和生物失活，相反，以適當選擇多個參數情況下，通過從生物技術角度看很不常用的并且通常不希望的方法步驟，可以得到驚人的均勻的、生物很活性的pyroGlu-MCP-1-制劑，此外，該制劑本身即使在長期貯存情況下也可以保持其均勻性，而且比Gln-MCP-1-制劑(起始制劑)更穩定。
當局如USA或歐洲EMEA的食物和藥品管理局批準一種藥物以藥物合法地準入市場，要依賴于該藥物能夠滿足于加到藥品制造商的很多的條件、其最終目的是保護患者。所以每個生產者必須提供證明來表明例如藥品的純度、貯存穩定性和生產的可重復性。所述三個方面只是小選擇，但在生物藥物的許可中確實起重要作用，生物藥物是，含有大分子、由天然物質構成的或由其衍生的活性物質(蛋白質、核酸、蛋白多糖、多糖，等等)的藥物。這些在許可范圍內所提出的對(生物-)藥物的要求常常很難滿足。例如，基于蛋白質的活性物質在一個多多少少復雜的細胞有機體中進行制備后必須進行強烈的且復雜的多步純化，并且不應例如因氧化或其他自發的化學反應而以不受控的方式改變其結構。此外，最終產物應具有可接受的貯存穩定性，目的是為了不需要在生產者和使用產品的醫生或患者或者醫療機構之間提供復雜且昂貴的供應網，特別是對于蛋白質而言，重要的是要滿足保持其正確的二次結構(折疊)的要求，這通常只有在相當努力下才能滿足。
在MCP-1-蛋白情況下，市售購得的制劑質量在很多方面常常是足夠的，例如用于體內-試驗。不過如發明人在其工作過程中發現，同一制劑完全不適用于制備許可的藥物。在發明人的實驗中，在對患者給藥前在室溫下將其短時間放在溶液中，例如在醫生診室或病房中不能完全排除，例如，導致在MCP-1-制劑中產生起初被視為雜質的“分解”產物。對起初作為物質的Gln-MCP-1進行更強的純化，雖然短期可回收較高純度，但在溶液中和在室溫下短期保存后，該制劑重新變得不穩定。如果簡單方法不是沒有希望，基于這種不穩定有效物質制劑促進藥物法規許可的方法是相當困難的。
令人驚訝地，根據本發明的教導可以克服這些問題，在原來的制備和純化方法中包括一個不常用的、第一眼看上去高度違反生產性的方法步驟，即，在較高溫度下進行培育(按照早先的觀點，只有多相性才要求這樣)。可以在本發明人詳細分析并優化的條件下進行這種培育，即，原來活性物質Gln-MCP-1快速定量轉化為起初被視為雜質的pyroGlu-MCP-1-形式。后一形式對于蛋白質改性的影響，如在較高溫度下等進行培育，是很穩定的。因此可以得到一種MCP-1-制劑，由于較高純度和均勻性、杰出的可重復制備性和其貯存穩定性，使該制劑適合用作藥物活性物質，有希望滿足在相應許可方法中提出的嚴格要求，并可以使其在MCP-1作用基礎上實施新治療方法。
根據本發明一個部分方面，使用一種按照上述和權利要求所述方法制得的pyroGlu-MCP-1-制劑-用來治療性處理血管梗阻病，特別諸如冠狀動脈病(coronary arterydisease，CAD)、末梢閉塞性血管病(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)、腦動脈和腸膜動脈梗阻癥，或者-用來制備一種用于治療血管梗阻病，特別是象冠狀動脈病(coronaryartery disease，CAD)、外周閉塞性血管病(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)、腦動脈和腸膜動脈梗阻癥的藥物。
本發明還能夠實施用于治療患有所述血管梗阻病患者的方法，其中，對患者例如以注射或輸入方法給藥通過轉化制得的pyroGlu-MCP-1-制劑或者使用這種pyroGlu-MCP-1-制劑制得的藥物。
還需說明有關各個優化的方法參數，在較高溫度例如甚至60℃，經過較長時間，必要時經過數天培育蛋白制劑，對于生物技術來說有些勉強。對于以上作為最佳公開的，培育溶液為中性至酸性的pH-值違反原來的化學邏輯從谷氨酰胺轉化為環形焦谷氨酸是親核的取代反應，該反應中，在谷氨酸的C-α-氨基的攻擊性氮原子上的一對自由電子對進攻C-γ-酰基的C-原子。酸性pH-值將使C-α-氨基質子化增強，因而對反應速度起到負面作用。但根據發明人的證實則并非如此。可考慮的解釋(并不限于該解釋)是，折疊的MCP-1-蛋白對于N-末端形成一個微環境，其中，盡管周圍的水溶液是酸性pH-值，但氨基以非質子化存在，即一對自由電子對可用于親核攻擊。
實施例實施例1根據本發明方法制備pyroGlu-MCP-1-制劑發酵用大腸桿菌K12(W3110)菌株進行發酵。用ColE1-質粒(pBR322-衍生物)使該菌株轉化，其含有以下成分在通常使用的促進劑(磷酸(酯)酶，pPhoA)控制下的hMCP-1的基因序列、ColE1-復制源和用于四環素的抵抗基因。為了發酵，該生產菌株在振蕩燒瓶中在含有四環素的LB培養基中進行預培養。培育在37℃下進行直到OD為1。將預培養體轉移到發酵罐(Fermenter)中，并在攪拌和通風下在37℃進一步培育。培養基含有葡萄糖、各種不同的鹽、微量元素、酵母提取物、氨基酸和四環素。用氨水使pH-值保持在6.8。一旦存在的葡萄糖被消耗，就通過加入葡萄糖使溶解的氧量(pO2)恒定保持為設定值的40％。一旦培育基中的磷酸鹽被消耗，磷酸(酯)酶促進劑的誘導作用就自動實施。39小時后，用管狀離心機(CEPA)收集生物量，并在-70℃下貯存。
細胞溶解和蛋白純化步驟用Ultraturrax使冷凍的細胞沉淀重新懸浮于四倍量的溶胞緩沖液(200mM Tris、55mM NaCl、5mM EDTA，pH 7.5)中。用均質器在460bar下通過兩個通道(passagen)進行細胞溶解。用CEPA離心機除去細胞碎片。上清液任選地用Polysep II(1.2μm)過濾器(Millipore)過濾，然后裝載在由Q瓊脂糖FF和SP瓊脂糖FF所構成的組合柱上。用溶胞緩沖液使柱平衡。
裝柱結束后，用溶胞緩沖液洗滌組合柱，并夾住Q瓊脂糖-柱。再用溶胞緩沖液洗滌SP瓊脂糖，接著用5M脲(在溶胞緩沖液中)洗滌，并再次用溶胞緩沖液洗滌SP瓊脂糖。在線性NaCl梯度液中洗脫產物。
用硫酸銨使洗脫物鹽化，直到其終濃度為1.3mol/L，并在3200g下離心15分鐘。將殘余物裝載在苯基瓊脂糖-柱上，該柱用1.3M硫酸銨(在溶胞緩沖液中)平衡。
將苯基-瓊脂糖流涂覆在用溶胞緩沖液平衡的源30RPC-柱上。用溶胞緩沖液、水和緩沖液A(5％EtOH、0.1％TFA)進行洗滌。以從20％緩沖液B(95％EtOH、0.1％TFA)到70％緩沖液B的線性梯度液以10柱體積淋洗該產物。
轉化步驟洗脫物以不同的緩沖液例如，10-40mM，pH 6.0-7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋，直到1∶10。根據一優選實施方案，作為轉化溶液的最終pH值要求為6.0～6.5。蛋白質濃度為0.2～1.0mg/mL。
以無菌方式過濾該溶液，并在輕微的攪動(60rpm)下在35-80℃的溫度(在不同批料中)下培育。通過HPLC-分析跟蹤反應進程。
最后純化步驟一旦反應達到終點，就將轉化溶液裝載在緩沖液A(40mM磷酸鹽，pH 6.0)中平衡過的SP瓊脂糖HP-柱上。用線性NaCl梯度液洗脫。洗脫物中NaCl濃度約為350mmol/L，蛋白質濃度約為3mg/mL。用緩沖液A稀釋洗脫物直到導電率相當于250mM NaCl。然后用40mM磷酸鹽，pH 6.0、250mM NaCl再次稀釋，直到蛋白質濃度為1mg/mL。無菌過濾所形成的大量溶液，在4℃或-70℃貯存，以進行配制。
分析上述轉化步驟的進程由RP-HPLC跟蹤。記錄從轉化反應開始(t0)到時間點t＝24小時、t＝48小時和t＝120小時的洗脫曲線色譜。可看到
圖1所示的四個色譜，在35℃培育溫度下48小時后，約90％蛋白轉化為pyroGlu-MCP-1。HPLC分析表明準確形成了兩個二硫橋。
圖2表示在所述條件下從Gln-MCP-1到pyroGlu-MCP-1的反應動力學。可以看到，在反應持續時間有一種雜質增加，這種雜質在圖2中以“變體2”表示的，并不再具有特征。
在0.1M乙酸鈉緩沖液，pH 5.5，或者0.1M檸檬酸鈉緩沖液，pH 3.5中進行的轉化步驟中可觀察到類似的反應進程(數據未示出)。
重復以上描述的反應，除了代替35℃的反應溫度，選擇24℃、60℃和80℃的溫度。如表3所歸納的數據可見，在24℃下經過合理的時間后，得不到滿意的pyroGlu-MCP-1產率。反之，在60℃和80℃下，可觀察到明顯較高的反應速度。在80℃下的反應速率約為室溫下速率的50倍。
表3
n.d.＝未測定，在指定時間后未達到反應終點較高的反應溫度有利于副產物或分解產物的形成，并降低純度，尤其是在80℃下進行試驗時更是如此(表3)。
圖3表示以較高分辨率表示pyroGlu-MCP-1-制劑的洗脫曲線色譜，它是在表3所綜述的條件(20mM磷酸鹽緩沖液，35℃、60℃或80℃)下得到的。由此可見，在較高溫度較短培育時間(例如在80℃下3小時)比在35℃下培育5天更明顯出現有MCP-1-副產物或分解產物的更多雜質。
在某些方法方案下，在其他方面恒定的實驗條件(20mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.0)下，在生產技術以乙醇(EtOH)含量(例如5％)為條件對反應速率或產物純度不起負面影響。
實施例2按照本發明的另一個方法制備pyroGlu-MCP-1-制劑發酵、細胞溶解和蛋白純化步驟如實施例1中所述進行。
轉化步驟用PBS，0.02％Tween 20將源30 RPC的洗脫物稀釋到1∶10。蛋白質濃度約為0.2～0.5mg/mL，pH約為7.4。除了緩沖液成分外該溶液還含有來自上述源30 RPC-步驟洗脫物的約3.5％EtOH和0.01％TFA。用Millipak 20(0.2μm，Millipore)將該溶液無菌過濾到聚丙烯瓶中，并在輕微振動下于35℃培育。通過HPLC-分析跟蹤反應進程。一旦反應結束，對PBS 0.02％Tween 20使用Pellikon 2 UDF-膜(3k，Millipore)隔膜超濾(ultra diafiltered)該轉化溶液，并調節蛋白濃度為0.1mg/mL。經過Millipore GV-過濾器(0.22um)以1mL-份無菌裝入玻璃容器中。
分析由RP-HPLC跟蹤轉化步驟進程。從圖4可見，5天后大于90％的蛋白質轉化為pyroGlu-MCP-1，令人驚訝地，盡管經歷較長的培育時間，但得到很高的純度95％(表3)。從含有20mM磷酸鹽緩沖液的配料和含有20mM磷酸鹽緩沖液加150mM鹽的配料(實施例1，表3，行3和行6)相比較可知，在有PBS的配料作為培育溶液中，相對低的速度常數可歸因于較高的鹽濃度、離子強度或滲透性。
實施例3基于實施例1或實施例2制得的MCP-1-制劑制備藥物將實施例1或實施例2中得到的pyroGlu-MCP-1-制劑在PBS(氯化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀；pH 7.0)，此外還含有0.02％Tween 20中稀釋到0.1mg/mL的濃度，并轉移到1-mL-體積的玻璃容器中。制得的藥物溶液是澄清、無色且無味的，可以通過注入或輸入給藥。
實施例4pyroGlu-MCP-1和Gln-MCP-1生物活性的比較測量原則MCP-1結合到MCP-1受體CCR2b并活化MCP-1受體CCR2b。受體活化導致鈣流進入胞液中。這可使用熒光成像平板讀數器(FLIPR；分子器件)進行測量。為此，將失活的熒光顏料酯Fluo-4AM，置入在其表面表達hCCR2b的細胞中，然后通過細胞內的酯酶將這種酯進行分裂。以這種形式使熒光顏料結合Ca2+-離子。用488nm波長激發時，在528nm發射一個峰。發射強度取決于胞液的鈣濃度。發射光的強度變化也與胞液中的鈣濃度相關，該鈣濃度又取決于受體的活化狀態。
在加入MCP-1后一種特征性的時間觸發的測量信號示于圖5。由此可見，加入MCP-1后迅速釋放鈣，鈣與熒光度明顯升高相聯系。施用(a)幾秒后已達到最大值(b)。施用(a)和最大激發(b)之間的時間間隔約為20-30秒。
在以下描述的實驗中使用最大值進行評價，因諸如鈣誘導的鈣流入的二級效應影響較小，因而可以進行更準確的測量。
制備穩定表達CHO/hCCR2B-K1細胞人CCR2b受體(基因庫-保藏號D29984)的編碼區經PCR放大。然后1.08kb BamHI-XbaI片段被克隆進一個表達載體。用這作為表達載體的質粒將CHO-K1-細胞轉染。
所述細胞在基于Ham′s F12介質的培養基中進行培養，并有規律地傳代。在測量的前一天，5000細胞鋪在有40μl培養基的384-孔-試驗板(CorningCostar)中，在37℃、5％CO2、95％相對濕度下使其粘附過夜(約24小時)。所有試樣進行四次測量。
在實驗的一天首先制備物質板。對于不同的MCP-1-制劑，使用具有0.1％BSA(無蛋白酶)的Hanks緩沖液作為稀釋緩沖液。使用具有0.1％BSA的Hanks緩沖液作為空白對比。然后向細胞加入40μl/孔的Fluo-4染料介質，在37℃、5％CO2、95％相對濕度下培育制劑45分鐘。然后用60μl洗滌緩沖液洗滌著色的細胞四次，其中，每孔中保留25μl洗滌緩沖液的剩余量。然后在室溫下用洗滌緩沖液再培育細胞5分鐘。
為了進行熒光測量，調節FLIPR測量儀器，使得著色和未著色的細胞以至少1∶5因子而不同，并且著色的孔具有約11000熒光計數。其他的FLIPR-的設定值如下激發488nm
發射510-570nm(帶通)負校正Hanks/BSA(＝和空白對比)偏差減值(substraction)6(＝加入物質前使所有孔相等于0)預浸潤尖端使用來自物質板的25μl有關物質溶液(＝使附著假象(artefakts)為最小化)測量過程由以下步驟組成6次5秒間隔的進程加入15μl的物質60次1秒間隔的進程18次5秒間隔的進程為了評價，使用加入物質后78間隔的最大信號。作為對比配料，使用空白對比用于負校正正對比(ATP)用于檢查著色參考對比(“標準”)-監視細胞上受體表達-用于測定未知樣品活性的計算基礎在相同的稀釋步驟中，使待測試的樣品和參考對比平行滴加。選擇試驗中所使用的濃度，以使得其位于參考對比的EC50-范圍內。
本發明和非本發明的MCP-1-制劑的比較兩種按照本發明方法制得的pyroGlu-MCP-1-制劑(“Batch071100kh”和“Batch 0141921”)和一種由重組體法制得的MCP-1-制劑，該制劑N-末端的谷氨酰胺-基沒有按上述本發明方法步驟中轉化為焦谷氨酸-基(由Peprotech得到的MCP-1-制劑)，使用上述實驗體系進行測試并對比。從如上所述記錄的測量曲線確定EC50-值(見圖6)。
對于兩種pyroGlu-MCP-1-制劑而言，得到實際上相同的EC50值，而沒有根據本發明并未進行N-末端修飾的MCP-1-制劑的值明顯不同(圖6)。后一制劑的EC50-值低了約2～3的因子(pyroGlu-MCP-1EC50＝7.82nM；由Peprotech得到的MCP-1-制劑EC50＝20.76nM)。
如下計算兩種制劑的生物活性首先對濃度為10-8M的pyroGluMCP-1進行正校正，即，將濃度10nM的pyroGlu-MCP-1下所得到的值設定為100％。這是在曲線升高的近似線性范圍內。然后借助這百分比信號計算其他制劑的活性，例如Peprotech得到的MCP-1，按照下式計算％活性(樣品)＝RFU(在le-8M時的樣品)×100％/RFU(在le-8M時的標準)。
在上述實施例中(如表4所示)得到，以pyroGlu-MCP-1-制劑計，未N-末端-修飾的MCP-1-制劑的活性值為48％。
表4測量值(負校正Hanks/BSA；偏差減值6)
％活性(MCP-1(Peprotech))＝6151×100％/12898.3＝48％活性實施例5pyroGlu-MCP1的溫度敏感性在56℃或95℃下培育PyroGlu-MCP-1 1或2小時。之后使用實施例4中的測試體系測量尚存在的生物活性。
實驗表明，在56℃下，對pyroGlu-MCP-1-制劑培育一小時或二小時都未變性。但，如圖7所示，在95℃下的培育導致很明顯地變性作用。
實施例6治療患有動脈梗阻癥的患者為了治療PAOD-患者，將一種如上制得的pyroGlu-MCP-1制劑調節到1.2和120μg/ml之間的濃度。使用前，使該溶液直接調到0.1～10μg/ml的最終濃度，對患者以2～12ml/分鐘的流率向靠近血管梗阻區域附近以動脈內輸入1～6小時的時間。在1～7天后再次輸入。
權利要求
1.一種由重組制得的Gln-MCP-1制備pyroGlu-MCP-1的方法，其中，Gln-MCP-1-在30℃～80℃的溫度下，-在緩沖溶液中，用--10mM～160mM的鹽濃度，和--2～7.5的pH-值進行培育，直到至少90％的MCP-1以pyroGlu-MCP-1的形式存在。
2.根據權利要求1的方法，其中，該緩沖溶液是濃度為20mM～50mM并且pH-值為3.5～6.5的磷酸鹽緩沖液。
3.根據權利要求1或2之一的方法，其中，緩沖溶液還含有清潔劑、抗氧化劑、防腐劑、穩定劑、抗微生物試劑和/或絡合劑。
4.一種制備pyroGlu-MCP-1-制劑的方法，該方法至少包括以下步驟-制備Gln-MCP-1-制劑，通過在宿主細胞中表達編碼MCP-1的基因結構而進行，-任選濃縮和/或純化含于Gln-MCP-1制劑的Gln-MCP-1-，-根據方法1～3，將Gln-MCP-1-制劑的Gln-MCP-1轉化為含有pyroGlu-MCP-1的pyroGlu-MCP-1-制劑，和-任選重新緩沖和/或進一步純化pyroGlu-MCP-1-制劑，其中，以MCP-1的總量計，pyroGlu-MCP-1在所得pyroGlu-MCP-1-制劑中的量至少為90％。
5.含有權利要求4制得的pyroGlu-MCP-1-制劑的組合物，其中，pyroGlu-MCP-1-制劑所含MCP-1的至少90％是以pyroGlu-MCP-1形式存在。
6.制備含有pyroGlu-MCP-1的藥物的方法，其中使用權利要求4制得的pyroGlu-MCP-1-制劑。
7.含有權利要求4制得的pyroGlu-MCP-1-制劑的藥物或藥物組合物，其中所含的MCP-1至少90％以pyroGlu-MCP-1形式存在。
8.根據權利要求7的藥物或藥物組合物，其在具有氯化鈉和任選的清潔劑作為添加劑的緩沖溶液中含有pyroGlu-MCP-1。
9.權利要求4制得的pyroGlu-MCP-1或者pyroGlu-MCP-1-制劑的用途，它用于制備藥物組合物，以用于治療血管梗阻病，特別是冠狀動脈病(coronary artery disease，CAD)、末梢閉塞性血管病(peripheral arterial occlusivedisease，PAOD)、腦動脈和腸膜動脈梗阻癥。
10.根據權利要求4的方法制得的重組MCP-1-制劑，其生物活性與一種重組體制得的、沒有使用權利要求1方法的MCP-1-制劑(N-末端未修飾的MCP-1-制劑)的活性之比為100∶48或更高。
11.重組體制得的MCP-1-制劑，其中至少90％的MCP-1-蛋白質是以pyroGlu-MCP-1存在。
12.根據權利要求11的MCP-1-制劑，其中pyroGlu-MCP-1以未糖基化的形式存在。
13.用于誘導生物或生理反應的方法，其取代或強化內生天然的MCP-1-蛋白質的生物或生理作用，其特征在于，權利要求5的組合物或者權利要求7的藥物或者權利要求10到12至少一項的制劑以適合于引起生物或生理作用的量添加到細胞或組織或器官中。
14.根據權利要求13的方法，其中，所述細胞或組織或器官具有CCR-2和/或CCR-4受體。
15.根據權利要求14的方法，其中，所述細胞是哺乳動物細胞，其天然或重組體地表達MCP-1-受體-亞型CCR2，特別是CCR2b。
全文摘要
本發明涉及一種由重組體制得的Gln－MCP－1制備pyroGlu－MCP－1的方法，該方法中，Gln－MCP－1在30℃～80℃的溫度下，在具有10mm～160mm的鹽濃度和2～7.5的pH－值的緩沖溶液中進行培育，直到至少90％的MCP－1以pyroGlu－MCP－1的形式存在。
文檔編號A61K38/19GK1784420SQ200480011883
公開日2006年6月7日 申請日期2004年4月13日 優先權日2003年5月2日
發明者羅伯特·萬德爾, 羅曼·尼西納, 倫道夫·塞德勒, 馬丁·倫特, 亨利·杜茲 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司