密蛋白的未表達作為腫瘤轉移的標記物的制作方法

專利名稱：密蛋白的未表達作為腫瘤轉移的標記物的制作方法
背景技術：
癌癥形成自細胞的不受控制的增殖。所有的癌癥都是威脅生命的。即使當癌癥沒有導致死亡時，不僅對于患者，還對于家庭、朋友和同事它是使人衰弱的。而且，太頻繁地，癌癥證明是致命的。個人和公眾從導致所有過早死亡的顯著部分的該類疾病中受到的損失是難以估計的。
盡管在一些病例中已經開發了有效的治療形式，但許多癌癥對于現有的治療來說仍是難以控制的。特別難治的是轉移性癌癥。這些癌癥給患者造成了最高的風險，并且對于最佳預后，經常必須通過侵入性方法進行治療，所述侵入性方法存在有害副作用的增加風險。因此，存在對于將那些可能轉移的腫瘤與不可能轉移的那些精確區分的方法的極大需求。而且，治療轉移性癌癥的方法經常是不充分的，并且還有對于改進的抗轉移藥劑和治療轉移性癌癥的方法的明顯需要。
轉移性癌癥起源自原發腫瘤。原發腫瘤的轉移產生了繼發瘤和播散性癌。眾所周知的是原發和繼發腫瘤流出大量細胞。這些流出的細胞可擴散到全身。例如，原發腫瘤可損傷周圍淋巴或循環導管，使流出的細胞進入淋巴或循環系統，并加速它們在體內的傳播。而且，通過癌性腫瘤的細胞的流出在外科手術和放療過程中增加。
大多數流出的細胞不形成新的腫瘤。為此，這些細胞必須克服一系列身體和生理障礙。事實上，對于轉移的發生必須發生一系列的獨特事件。原發腫瘤在身體上必須侵犯初生組織的胞間隙。特別地，其必須滲透組織的基膜。對于大多數轉移來說，腫瘤必須損傷淋巴管或脈管壁血管的內皮細胞壁以提供針對流出細胞的通道。進入淋巴或血液的細胞必須經受得住血液動力學壓力和在循環中的宿主的防御，而且，細胞必須沉積在循環系統中的新位點，一種明顯包括聚集的血小板的過程。然后，細胞必須滲出導管到胞間隙。最終，其必須侵犯次級器官的胞間隙并在新的位點增殖。盡管轉移的過程在生理上是復雜的，轉移的總的模式對于許多類型的癌癥來說是通用的。
轉移的過程還清楚地包括復雜的細胞內機制，其改變癌細胞以及它們與周圍細胞和組織的相互作用。例如，癌細胞的特征在于粘著蛋白的異常表達，降解基質成分的酶，自分泌因子，配體反應性受體，血管發生因子和前列腺素，僅舉幾個例子(to name a few)。具體而言，起始腫瘤細胞移動的信號途徑在侵入和轉移的了解最少的方面中。目前，認為許多癌細胞的增殖取決于特異配體-受體相互作用。然而，迄今，使用這種范例，或轉移的潛在機制的其它概念來開發預防或有效抑制轉移性癌的轉移的治療是不可能的。
該過程的復雜性涉及轉移，并且對潛在分子機制的了解的缺乏，在一些病例中，使區分可能轉移的腫瘤和不可能轉移的那些特別困難。不能辨別腫瘤的轉移潛能妨礙精確的預后并不可避免地導致太具攻擊性或攻擊性不足的治療干預。臨床上，在決定是否施用化學療法還是將治療限制在腫瘤的外科手術摘除中，確定腫瘤是否是轉移性的也是重要的。而且，迄今對于所有類型的癌癥來說，開發抑制或預防轉移性腫瘤的傳播的治療仍是困難的或不可能的。顯而易見地，對于精確確定腫瘤的轉移潛能的方法和有效的抗轉移組合物和方法仍存在著巨大需求。

發明內容
本發明通過提供抑制腫瘤細胞轉移的方法來滿足該需要，所述方法包括促進如下稱為密蛋白-3(SEQ ID NOs1和2)，密蛋白-4(SEQ ID NOs3和4)和密蛋白-9(SEQ ID NOs5和6)的密蛋白蛋白質一個或多個的表達。通過檢查密蛋白在正常和轉化的細胞系中的表達的研究得到的令人驚訝的發現導致了本發明。所述結果顯示了在來自正常和轉化的細胞系的組織的密蛋白-3、密蛋白-4、密蛋白-9的表達中的清晰明確的差異。密蛋白3，4和9在正常組織中表達，但在轉化的、癌細胞中不表達。
因此，在一方面本發明提供診斷瘤形成的方法，其方法包括分析密蛋白-3、密蛋白-4、密蛋白-9的表達。如果這些基因是未表達的(under-expressed)，這說明轉化的/癌細胞是轉移細胞。方法包括檢測密蛋白存在的核酸雜交技術，其包括RT-PCR方法和試劑盒。還要求診斷試劑盒，所述試劑盒是第一個容器和第二個容器的體外PCR分析試劑盒，所述第一個容器包括擴增所述密蛋白轉錄物或從那里產生的cDNA的PCR引物，所述第二個容器包括核酸標記物。
還要求的是檢測轉移性癌癥的抗體方法和試劑盒。所述試劑盒包括與哺乳動物的密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9多肽特異性結合的多肽、蛋白質、抗體或抗體片段。包括酶聯的免疫吸附測定法，放射免疫測定和熒光免疫測定。
瘤形成的診斷可以指瘤形成組織的起始檢測或其可是區別轉移性和非轉移性瘤的步驟。用于本文時，涉及的術語“診斷”據此理解。
所述方法是可特別適用于固體瘤，特別是惡性腫瘤，例如癌的診斷。進行測定的樣品優選地是體組織或體液，并且不是體外培養的細胞。所述樣品可是來自固體腫瘤的小片的組織或細胞的精細針狀吸出物(FNA)。或者，其可以是血液或尿或另外的體液的樣品，刮擦子宮頸或非侵入性獲得的樣品諸如唾液、尿液或大便。
可通過應用一個或多個標記的特異性寡核苷酸探針來檢測cDNA，對所述探針進行選擇從而使其能夠與擴增的cDNA序列的部分復性。或者可使用標記的寡核苷酸引物和/或標記的單核苷酸。存在許多可被應用的合適的可檢測的標記，包括放射性標記。
密蛋白-3、密蛋白-4和密蛋白-9的基因表達的水平可通過RT-PCR，或通過使用與密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9結合的標記的抗體來進行確定。例如，可用與密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9結合的標記的抗體對表達蛋白質的組織進行染色。如果組織正常地表達密蛋白，但是如通過缺乏產生所需染色劑或其它標記的所指示的，針對密蛋白的抗體沒有與組織的表面結合，這說明組織沒有表達密蛋白并且所述組織是癌性的并且是轉移的。
本發明還涉及治療轉移性癌癥的方法，所述方法誘導密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9的表達。優選的實施方案包括用編碼密蛋白-3(SEQ IDNOs5和6)，密蛋白-4(SEQ ID NOs7和8)或密蛋白-9(SEQ ID NOs17和18)的核酸轉染癌細胞。優選地，核酸是包含在合適的載體諸如腺病毒載體(見美國專利號5,547,932)，腺病毒關聯的病毒載體(見美國專利號6,541,258；美國專利號5,658,776和美國專利號6,346,415)或合適的反轉錄病毒載體(見美國專利號5,736,387)中的DNA。
癌癥是用于指各種類型的惡性腫瘤的任一個的通用術語，所述惡性腫瘤大多數侵犯周圍組織，它們可轉移到一些位點，可能在被嘗試去除后復發并導致患者死亡，除非被充分治療。癌癥包括肉瘤和癌。
轉移性癌是可傳播到身體其它部分的癌癥。
人密蛋白-3是多肽并具有如下的220個氨基酸殘基MSMGLEITGTALAVLGWLGTIVCCALPMWRVSAFIGSNHTSQNIWEGLWMNCVVQSTGQMQCKVYDSLLALPQDLQAARALIVVAILLAAFGLLVALVGAQCTNCVQDDTAKAKITIVAGVLFLLAALLTLVPVSWSANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGAGLYVGWAAAALQLLGGALLCCSCPPREKKYTATKVVYSAPRSTGPGASLGTGYDRKDYV(SEQ ID NO2)，其下劃線部分是胞外結構域。
人密蛋白-4是209個氨基酸的多肽。
MASMGLQVMGIALAVLGWLAVMLCCALPMWRVTAFIGSNIVTSQTIWFGLWMNCVVOSTGQMQCKVYDSLLALPQDLOAARALVIISIIVAALGVLLSVVGGKCTNCLEDESAKAKTMIVAGVVFLLAGLMVIVPVSWTAHNIIQDFYNPLVASGQKREMGASLYVGWAASGLLLLGGGLLCCNCPPRTDKPYSAKYSAARSAAASNYV(SEQ ID NO4)。氨基酸序列的胞外結構域用下劃線表示。
人密蛋白-9是217個氨基酸的多肽。
MASTGLELLGMTLAVLGWLGTLVSCALPLWKVTAFIGNSIVVAQVVWEGLWMSCVVQSTGOMQCKVYDSLLALPQDLQAARALCVIALLLALLGLLVAITGAQCTTCVEDEGAKARIVLTAGVILLLAGILVLIPVCWTAHAIIQDFYNPLVAEALKRELGASLYLGWAAAALLMLGGGLLCCTCPPPQVERPRGPRLGYSIPSRSGASGLDKRDYV(SEQ ID NO6)。氨基酸序列的胞外結構域用下劃線表示。
上皮和內皮細胞的緊密連接(TJ)是特別重要的細胞-細胞連接，其調節細胞旁(paracellular)途徑的滲透性，并還將細胞表面分成頂端和基底外側(basolateral)部分。緊密連接形成介于上皮細胞之間的連續的纖維胞間接觸并產生針對水、溶質和免疫細胞的細胞旁運動的被調節的屏障。它們還提供第二種類型的屏障，其通過限制膜脂質在頂端和基底外側的膜結構域之間的交換有利于細胞的極性。
認為緊密連接通過產生胞間密封從而產生針對溶質通過細胞旁途徑的擴散的主要屏障，和通過充當介于頂端和基底外側血漿膜結構域之間的界面從而分別產生和維持細胞的極性而涉及上皮細胞的屏障和防御功能。緊密連接還涉及白細胞到達炎性位點的變移。響應于化學引誘物，白細胞通過穿越內皮從血液中滲出并在粘膜感染的病例中，越過發炎的上皮細胞。變移主要沿細胞旁路徑發生并似乎以高度協調和可逆方式開放和關閉緊密連接被調節。在超薄切片電子顯微照片上，TJ作為包括鄰近細胞的血漿膜的外小葉的一組明顯融合的分離位點出現。在大多數上皮細胞的冷凍-斷口電子顯微照片上，TJ作為在一組在原生質面(P-面)中的連續的網結的膜內顆粒鏈(TJ鏈)出現，所述原生質面(P-面)具有在胞外(E)-面中的互補的溝。
已經鑒定了許多與TJ關聯的蛋白質，包括完整的和外周血漿膜蛋白。目前對這些蛋白質的復合結構和相互功能的了解仍是有限的。在許多與上皮連接有關的蛋白質中，已經鑒定了一些種類的跨上皮膜的蛋白質，其可能在上皮連接的生理調節中發揮功能。這些包括許多“連接黏附分子”(JAMs)和其它被稱為閉合蛋白、密蛋白和連蛋白的TJ-關聯的分子。JAMs、閉合蛋白和密蛋白延伸到細胞旁空間，并且已特別意欲將這些蛋白質作為產生在鄰近的上皮細胞之間的上皮屏障和通過上皮細胞層的可調節的通道的候選物。在一個模型中，已經建議將閉合蛋白、密蛋白和JAM作為嗜同性結合的模式相互作用以產生針對水、溶質和免疫細胞在上皮細胞之間的細胞旁運動的調節的屏障。本發明的機制基于發現轉移性癌細胞已經失去了它們與其它細胞之間形成緊密連接的能力，并因此細胞對于在遍及身體的轉移是自由的。
編碼用在本發明過程中的密蛋白的DNA應該編碼至少人密蛋白-3，密蛋白-4，或密蛋白-9的胞外結構域，和能與細胞膜或跨膜結構域結合的結構域，特別是密蛋白3，密蛋白-4和密蛋白-9的那些。認為由這些密蛋白表達的蛋白質抑制癌細胞的轉移。如果密蛋白-3，密蛋白-4和密蛋白-9然后被誘導進行表達，癌細胞可被誘導以分化成正常細胞或至少可再次形成緊密連接，因此丟失它們轉移的能力的細胞。
本發明提供一種逆轉癌細胞的癌表型的方法，其包括在允許基因表達的條件下將包含密蛋白基因的核酸引入細胞中從而逆轉細胞的癌表型。
本發明還提供一種在受試者中逆轉癌細胞的癌表型的方法，其包括將包括密蛋白基因的核酸分子在允許基因在受試者的細胞中表達的條件下引入受試者的癌細胞從而由此逆轉細胞的癌表型。
將核酸分子引入細胞的方法已經成為本領域眾所周知的。可通過直接轉化將裸核酸分子引入細胞。或者，可將核酸分子包埋在脂質體中。因此，本發明提供上述方法，其中通過裸DNA技術、腺病毒載體、腺病毒關聯病毒載體、EB病毒載體、皰疹病毒載體、減弱的HIV載體、逆轉錄病毒載體、痘苗病毒載體、脂質體、抗體包被的脂質體、機械或電子方法來將核酸引入細胞。上述列舉的方法僅充當將核酸引入細胞的可行方式的實例。還可將其它已知方法用在本發明中。
在上述方法的一個實施方案中，將密蛋白基因與調節元件連接從而使其在調控元件的控制下進行表達。在另一個實施方案中，調節元件是可誘導的或組成型的。可誘導的調節元件如可誘導的啟動子是本領域已知的。調節元件如可指導組成型表達的啟動子，也是本領域已知的。在一個單獨的實施方案中，調節元件是組織特異性調節元件。然后，密蛋白基因的表達將是組織-特異性的。本發明還提供藥物組合物，其包括有效逆轉癌細胞的癌表型的量的包含密蛋白基因的核酸和藥用載體。
因此，在本發明的另一個實施方案中，可將編碼本發明的密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸插入載體中并將其用作基因治療載體。在一個實施方案中，基因治療載體是病毒載體，例如復制缺陷逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒，其中編碼光敏感性蛋白質的核酸分子與病毒基因組連接。包括慢病毒載體、逆轉錄病毒載體和腺伴隨病毒載體的病毒載體，是通常了解的對于外源基因轉移到體內，特別是到人體內的選擇的基因療法載體。慢病毒載體的實例包括，但不限于，HIV、FIV、BIV、EIAV和SIV。病毒載體提供有效的到細胞內的基因傳遞，并將轉移的核酸穩定的整合到宿主的染色體DNA中。通過在病毒顆粒表面上表達將與獨特于目標細胞的受體相互作用的細胞特異性蛋白質可使病毒載體的感染性是細胞特異性的。以該方法，可將病毒載體靶向到視網膜神經節細胞。通過應用組織或細胞特異性的控制基因表達的轉錄調節序列來進一步增加表達。見，Anderson et al.，美國專利號5,399,346；Mann et al.，Cell，33153(1983)；Temin et al.，美國專利號4,650,764；Temin et al.，美國專利號4,980,289；Markowitz et al.，J.Virol.，621120(1988)；Temin et al.，美國專利號5,124,263；由Dougherty等1995年3月16日公開的國際專利公開號WO95/07358；和Blood，82845(1993)。
或者，可將載體通過使用脂質體的體內脂質轉染法引入。可將合成的陽離子脂質用于制備脂質體以進行編碼標記的基因的體內轉染[Felgner etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417(1987)；見Mackey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858027-8031(1988)]。應用脂質轉染法將外源基因引入體內特定器官具有確定的實際優勢。脂質體到特異細胞的分子靶向代表益處的一個范圍。清楚的是到具體細胞的定向轉染代表益處的一個范圍。清楚的是到具體細胞類型的定向轉染將在具有細胞異質性的組織，諸如胰腺、肝、腎和腦中特別有利。出于靶向的目的，脂質可以與其它分子進行化學偶聯。靶向的肽，例如激素或神經遞質，和蛋白質諸如抗體，或非肽分子可與脂質體化學偶聯。
使用常規技術，諸如標準細胞培養生長技術可進行促進傳染性的病毒顆粒在細胞中的產生的步驟。收集傳染性病毒顆粒的步驟還可通過使用常規技術進行。例如，傳染性的顆粒可通過如本領域已知的細胞裂解，或收集細胞培養物的上清液來進行收集。任選地，如果需要，可純化收集的病毒顆粒。合適的純化技術是本領域那些技術人員所眾所周知的。或者，使用本領域眾所周知的標準轉染技術可將本發明的病毒載體在活體外(exvivo)或體外施用給細胞或組織。
其它涉及在基因治療中的病毒載體的應用的方法可見于例如，Kay，M.A.，Chest 111(6Supp.)138S-142S(1997)；Ferry，N.and Heard，J.M.，Hum.Gene Ther.91975-81(1998)；Shiratory，Y.et al.，Liver 19265-74(1999)；Oka，K.et al.，Curr.Opin.Lipidol 11179-86(2000)；Thule，P.M.and Liu，J.M.，Gene Ther.71744-52(2000)；Yang，N.S.，Crit.Rev.Biotechnol.12335-56(1992)；Alt，M.，J.Hepatol.23746-58(1995)；Brody，S.L.andCrystal，R.G.，Ann.N.Y.Acad.Sci.71690-101(1994)；Strayer，D.S.，ExpertOpin.Investig.Drugs 82159-2l72(1999)，Smith-Arica，J.R.and Bartlett，J.S.Curr.Cardiol.Rep.343-49(2001)；Lee，H.C.et al，Nature 408483-8(2000).，美國專利號6,365,150，美國專利號6,596,270，美國專利號6,573,092，美國專利號6,475,757，美國專利號6,465,253，美國專利號5,965,541美國專利號.6,635,476，美國專利號6,348,352，美國專利號6,312,681，美國專利號5,994,134，美國專利號5,932,210，美國專利號5,837,520，美國專利號6,689,600，美國專利號6,531,456，美國專利號6,416,992，美國專利號6,211,163，和美國專利號6,207,457。
通過例如，靜脈內注射、局部施用(見美國專利號5,328,470)或通過立體定位技術注射(見，例如，Chen et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA913054-3057(1994))可將基因治療載體傳遞到受試者，哺乳動物，優選地人中。基因治療載體的藥用制劑可包括在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或可包括其中埋入基因傳遞賦形劑的緩慢釋放基質。或者，其中完整的基因傳遞載體可完整地產自重組細胞，例如逆轉錄病毒載體，所述藥物制劑可包括一個或多個產生基因傳遞系統的細胞。
本發明還提供包括有效逆轉癌細胞的癌表型的量的密蛋白基因的關聯基因的基因產物和藥用載體。在上述方法的另一個實施方案中，癌細胞包括，但不限于，乳腺、子宮頸、結腸、前列腺、鼻咽、肺結締組織和神經系統細胞。所述癌細胞還包括來自多形性成膠質細胞瘤，淋巴瘤和白血病的細胞。
通常將包含編碼密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9的核酸的核酸或載體在可生理接受的緩沖溶液中進行施用，所述緩沖溶液可包含一個或多個促進無菌、穩定性和/或活性的成分。可以使用任何便于將核酸/載體制備物引入身體需要的位點的方式，包括，例如通過靜脈內或局部注射，通過從導管進行輸注，鼻內傳遞或氣溶膠傳遞來進行。
包含編碼密蛋白3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸的核酸或載體以足以促進密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9在腫瘤細胞中表達的治療有效量進行施用，所述表達導致細胞形成緊密連接從而抑制腫瘤的轉移。治療有效量指以在劑量上并對于必需的時間周期有效獲得所需治療效果的量。治療有效量可對于癌癥，個體的年齡、性別、或體重的不同形式而有所不同。
診斷轉移性癌癥的存在按照本發明，可通過確定密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9是否在正常表達這些蛋白質的組織類型中表達來診斷轉移性腫瘤。存在許多確定此的途徑，包括應用抗體以檢測蛋白質的胞外部分的存在或通過確定在細胞的細胞質中的編碼密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的mRNA的存在和量。
本發明的診斷癌癥組織的方法優選地使用人癌癥患者腫瘤樣品進行，最優選地，使用保存在，例如石蠟中并被制備以進行組織學和免疫組織化學分析的樣品進行。
出于本發明的目的，術語“腫瘤樣品”傾向于包括被切除的固體腫瘤、活組織檢查材料、病理樣品，骨髓吸出物和血液樣品，它們包含造血起源，以及良性腫瘤，特別是確定組織諸如腦和中樞神經系統的腫瘤的腫瘤細胞。普通技術人員將理解的是來自固體腫瘤的樣品將需要物理和化學/酶促解聚作用的結合從而從基質細胞和滲透的造血細胞中分離腫瘤細胞，同時將獲得作為在血液、血清或血漿中的混和細胞群的包括白血病和淋巴瘤的造血腫瘤樣品，并將需要從其非腫瘤成分，特別是從紅細胞中和從其它有核細胞中分離，其中分離通過差速分離和本領域已知的其它方法來完成，所述紅細胞可通過用低滲溶液進行處理而溶解。
應用免疫學試劑來檢測密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的表達出于本發明的目的，術語“免疫學試劑”意欲包括抗血清和抗體，特別是單克隆抗體，及其與密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9結合的片段(包括F(ab)，F(ab)2.，F(ab)′和Fv片段)。還包括在免疫學試劑的定義中的是嵌合抗體，人源化抗體，和重組產生的抗體及其片段，以及適體(即，能夠與靶分子諸如肽相互作用的寡核苷酸)。在與本發明的試劑結合應用的免疫學方法包括直接和間接(例如，夾層方法-類型)標記技術，免疫親和柱，免疫磁性珠，熒光激活細胞分選儀(FACS)，酶聯免疫吸附測定(ELISA)，和放射免疫測定法(RIA)，最優選FACS。對于在這些測定中的應用，可特別使用熒光、抗原、放射性同位素或生物素標記物來對腫瘤的免疫學試劑進行標記，或可使用標記的二級或三級免疫學檢測試劑以檢測用于檢測密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的存在的腫瘤免疫學試劑的結合(即，在二級抗體(夾層方法)測定)。有效用在本發明實踐中的免疫學試劑的實例包括識別密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的抗體，最優選單克隆抗體。
本發明的免疫學試劑優選地是被可檢測地標記的，最優選使用適合于使用商購的設備諸如和最優選地熒光激活細胞分選儀進行檢測的具有激發和發射波長的熒光標記物。有效用在本發明的實踐中的熒光標記物的實例包括藻紅素(PE)、異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(RH)、德克薩斯紅(TX)、Cy3、Hoechst 33258和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。使用標準技術[Maino et al.，Cytometry 20127-133(1995)]，可將這些標記與免疫學試劑諸如抗體，最優選單克隆抗體結合。
使用核酸雜交技術檢測密蛋白-3，密蛋白-4和密蛋白-9可使用核酸和相關雜交方法來確定密蛋白-3，密蛋白-4和密蛋白-9的表達從而檢測mRNA在目標細胞中的存在。例如，可對在嚴格條件下與密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的部分的mRNA互補并雜交的核酸進行可檢測地標記。這些可檢測地標記的核酸分子可與細胞或細胞的提取物接觸從而檢測編碼密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的mRNA的存在和量。編碼密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸的量與密蛋白在細胞中的表達較好地相關。可通過研究SEQ ID NOs1，3和5的核酸序列并確定合適的長度來選擇用作探針的合適的核酸分子。應確定在嚴格條件下與密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的mRNA選擇性雜交的獨特的序列。
用于本文時，術語“嚴格條件”指本領域熟悉的參數。核酸雜交參數可見于匯編這些方法的參考文獻，例如Molecular CloningA LaboratoryManual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，或Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York中。更具體地，用于本文時，嚴格條件指，例如在雜交緩沖液(3.5倍SSC，0.02％菲可(Ficoll)，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中于65℃進行雜交。SSC是0.15M氯化鈉/0.015M檸檬酸鈉，pH7；SDS是十二烷基硫酸鈉；并且EDTA是乙二胺四乙酸。雜交后，例如以2倍SSC于室溫，然后以0.1-0.5倍SSC/0.1倍SDS于高達68℃的溫度，洗滌DNA轉移在上面的膜。
有許多導致相似嚴格程度的可應用的其它條件，試劑等。技術人員將熟悉這些條件，因此在此沒有給出它們。然而，將理解的是，本領域技術人員將能夠以容許清楚鑒定本發明的癌癥相關抗原核酸的同源物和等位基因的方式(例如，通過使用低級嚴格條件)來操作這些條件。技術人員也熟悉篩選表達這些分子的細胞和庫的方法，然后常規分離所述細胞和庫，隨后分離相關核酸分子并進行測序。
在來自細胞的遺傳材料中檢測密蛋白轉錄物的優選的方法應用聚合酶鏈式反應(PCR)技術。PCR技術由本領域技術人員常規操作并且其在診斷中的應用是眾所周知的并被接受的。進行PCR技術的方法公開于“PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications”，Innis，M.A.，et al.Eds.Academic Pres，Inc.San Diego，CA(1990)中。PCR技術的應用公開于描述進行PCT的方法的“Polymerase Chain Reaction”Erlich，H.A.，etal.，Eds.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989).美國專利號4,683,202，美國專利號4,683,195，美國專利號4,965,188和美國專利號5,075,216中。使用Perkin Elmer Cetus GENE AMP RNA PCR試劑盒，Part No.N808-0017來常規進行PCR。
PCR技術通過提供與RNA或DNA分子中出現的序列雜交的5′和3′引物和另外提供游離核苷酸，和用游離核苷酸將互補堿基填充到引物之間的核苷酸序列的酶，來產生DNA的互補鏈而快速產生多拷貝的DNA序列。酶將填充鄰近引物的互補序列。如果5′引物和3′引物與在核酸的相同小片段的核苷酸序列雜交，特異雙鏈大小的產物的指數擴增產生。如果僅有單一引物與核酸片段雜交，線性擴增產生不同長度的單鏈產物。
使用序列信息，具有本領域普通技術的那些人員可常規設計PCR引物。密蛋白-3，密蛋白-4和密蛋白-9轉錄物的核苷酸序列分別以SEQ IDNOs1，3和5表示。為了進行該方法，將RNA從樣品的細胞中提取出來并進行測試或使用眾所周知的方法和容易獲得的起始材料來制備cDNA。那些本領域技術人員可容易地制備PCR引物。一組引物通常包含兩個引物。當在產生于此的被提取的mRNA或cDNA上進行PCR時，如果產生于此的密蛋白轉錄物或cDNA存在，多拷貝的mRNA或cDNA將被制備。如果其不存在，PCR將不產生分離的可檢測產物。引物通常是8-50個核苷酸，優選約15-35個核苷酸，更優選18-28個核苷酸，其與產生于此的密蛋白轉錄物或cDNA相同或互補從而與它們雜交。在優選的實施方案中，引物每個是15-35個核苷酸，更優選地是SEQ ID NOs1，3或9的18-28個核苷酸片段。所述引物必須與待擴增的序列雜交。典型引物具有18-28個核苷酸的長度并且通常具有500-60％的G+C組成。整個引物優選地與其必須雜交的序列互補。優選地，引物產生100bp-2000bp的PCR產物。然而，產生50-高達10kb和更長的產物是可能的。如果將mRNA用作模板，所述引物必須與mRNA序列雜交。如果將cDNA用作模板，引物必須與cDNA序列雜交。
mRNA或cDNA按照標準PCR方法與引物、游離核苷酸和酶結合。所述混合物經過一系列溫度變化。如果產生于此的密蛋白轉錄物或cDNA存在，即，如果引物都與相同分子上的序列雜交，包含所述引物的和插入互補序列的分子將被指數擴增。擴增的DNA可通過多種眾所周知的方法容易地進行檢測。如果產生于此的密蛋白轉錄物或cDNA不存在，沒有PCR產物被指數擴增。PCR技術因此提供非常容易、直接和可靠的檢測樣品中密蛋白轉錄物的方法。
可通過一些眾所周知的方式來檢測PCR產物。檢測擴增的DNA的存在的優選的方法是通過凝膠電泳分離PCR反應材料并用溴化乙錠來對凝膠進行染色從而在擴增的DNA存在時觀察它。將預期大小的被擴增的DNA的大小標準物優選地作為對照在凝膠上移動。
在一些情況中，諸如當回收顯著小量RNA時，和僅有小量cDNA產生于此時，理想的或必須的是在第一個PCR產物上進行PCR反應。即，如果檢測通過第一個反應產生的擴增DNA的量是困難的，可以進行第二個PCR從而制備第一個擴增DNA的DNA序列的多個拷貝。將嵌套組的引物用在第二個PCR反應中。將與5′引物下游和3′引物上游的序列雜交的嵌套組的引物用在第一個反應中。
本發明包括有效用作進行PCR方法的引物以擴增產生于此的密蛋白轉錄物或cDNA的寡核苷酸。
按照本發明，可以裝配有效用作進行檢測產生于非結腸直腸樣品中的密蛋白轉錄物或cDNA的存在的方法的診斷試劑盒。這些診斷試劑盒包括有效用作進行PCR方法的引物的寡核苷酸。優選的是，按照本發明的診斷試劑盒包含一種容器，所述容器包含用于檢測被擴增DNA的存在的作為標準物在凝膠上移動的大小標記物。在產生于此的密蛋白轉錄物或cDNA存在時，大小標記物與由所述引物產生的DNA大小相同。在一些試劑盒中的另外的組分是進行所述測定的說明書。另外，試劑盒可任選地包含代表出現陽性和陰性結果的描述或照片。
PCR測定在檢測均化的組織樣品和體液樣品的細胞中的密蛋白轉錄物是有用的。意欲可將在液體樣品的血漿部分上的PCR用于檢測密蛋白轉錄物。
確定樣品是否包含表達密蛋白的細胞的另一個方法是提取自樣品的mRNA的支鏈寡核苷酸雜交分析。支鏈寡核苷酸的雜交可如在美國專利號5,597,909，美國專利號5,437,977和美國專利號5,430,138中描述的進行，將其每個都并入作為參考。可按照那些專利教導和密蛋白轉錄物的序列設計試劑。
確定樣品是否包含表達密蛋白的細胞的另一個方法通過提取自非結腸直腸樣品的mRNA的RNA印跡分析進行。進行RNA印跡分析的技術是本領域那些技術人員眾所周知的并描述于Sambrook，J.et al.，(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.中。mRNA的提取，mRNA的電泳分離、印跡、探針制備和雜交是眾所周知的技術，其可使用容易獲得的起始材料常規進行。
使用聚dT柱提取mRNA并通過凝膠電泳分離材料，并將其，例如轉移到硝酸纖維紙上。可將制備自分離的特異一個或多個片段的標記的探針用于顯現固定在紙上的互補片段的存在。在RNA印跡中有效用于鑒定mRNA的探針具有與密蛋白轉錄物互補的核苷酸序列。那些本領域技術人員可使用SEQ ID NOs1，3或5中的序列信息以設計這些探針或分離和克隆產生于此的密蛋白轉錄物或cDNA從而將其用作探針。這些探針至少是15個核苷酸，優選30-200個，更優選40-100個核苷酸片段并可是整個的密蛋白轉錄物。
按照本發明，可以組裝診斷試劑盒，所述試劑盒在進行通過RNA印跡在非結腸直腸樣品中分析檢測密蛋白轉錄物的存在的方法中是有效的。這些診斷試劑盒包含有效用作與所述mRNA雜交的探針的寡核苷酸。所述探針可是放射性標記的。優選的是按照本發明的診斷試劑盒包含一種容器，所述容器包含作為標準在凝膠上移動的大小標記物。優選的是按照本發明的診斷試劑盒包含一種容器，所述容器包含將與探針雜交的陽性對照。在一些試劑盒中的另外的組分包括進行測定的說明書。另外，所述試劑盒可任選地包含代表陽性和陰性結果出現的描述或照片。
RNA印跡分析對于檢測在均化的組織樣品和體液樣品的細胞中的密蛋白轉錄物是有用的。意欲可將在液體樣品的血漿部分上的PCR用于檢測密蛋白轉錄物。
檢測密蛋白轉錄物存在的另一個方法是通過寡核苷酸雜交技術。寡核苷酸雜交技術是本領域技術人員眾所周知的。簡言之，包含將與密蛋白轉錄物的核苷酸序列雜交的具體核苷酸序列的可檢測的探針。通常將制備自樣品RNA的RNA或cDNA固定到濾紙或類似物上。在僅當探針充分互補被固定的遺傳材料時容許雜交的條件下加入和維持探針。所述條件足夠嚴格從而洗脫其中僅有部分探針與被固定的材料雜交的探針。在洗脫濾器上檢測探針顯示互補序列。
有效用在寡核苷酸測定中的探針是互補DNA的至少18個核苷酸，并可與密蛋白轉錄物的完整互補序列一些大。在一些優選的實施方案中，本發明的探針是30-200個核苷酸，優選40-100個核苷酸。
本領域技術人員，使用公開在SEQ ID NOs1，3或5中的序列信息可設計與密蛋白轉錄物充分互補的探針。可常規優化雜交條件以通過非充分地互補雜交使背景信號最小化。在一些優選的實施方案中，探針是全長克隆。探針至少是15個核苷酸，優選30-200個核苷酸，更優選40-100個核苷酸片段并可是完整的密蛋白轉錄物。
本發明包括有效作為進行寡核苷酸雜交的探針的標記的寡核苷酸。即，它們與密蛋白轉錄物充分互補。例如，所述mRNA序列包括由不同外顯子編碼的部分。本發明的標記的探針是用放射性標記的核苷酸標記的或可通過容易獲得的非放射性的檢測系統進行檢測。
按照本發明，可以組裝用于本發明的寡核苷酸雜交方法的診斷試劑盒。這些診斷試劑盒包括編碼密蛋白轉錄物的部分的標記的寡核苷酸。優選的是用放射性核苷酸標記的按照本發明的寡核苷酸診斷試劑盒的標記的探針。所述按照本發明的基于寡核苷酸雜交的診斷試劑盒優選地包含代表陽性和陰性對照的DNA樣品。陽性對照DNA樣品是包含具有與試劑盒的探針充分互補的核苷酸序列的核酸分子從而使探針將在測定條件下與所述分子雜交的樣品。陰性對照DNA樣品是包含至少一個核酸分子的樣品，其核苷酸序列與試劑盒的探針的序列部分互補。在測定條件下，所述探針將不與陰性對照DNA樣品雜交。在一些試劑盒中的另外組分包括進行所述測定的說明書。另外，所述試劑盒可任選地包含代表陽性和陰性結果出現的說明或照片。
寡核苷酸雜交技術有效用于檢測在均化的組織樣品和體液樣品的細胞中的密蛋白轉錄物。意欲可將在液體樣品的血漿部分上的PCR用于檢測密蛋白轉錄物。
本發明涉及評價組織樣品以確定轉移的水平的體外試劑盒以及有效用于進行相同確定的試劑和組合物。
這些確定多肽的mRNA的存在的技術已導致多種微陣列、生物陣列、生物芯片和生物芯片陣列的產生。用于本文時，術語“微陣列”、“生物陣列”、“生物芯片”和“生物芯片陣列”指排列在固體支持基底上的被固定的生物分子探針的規則的空間排列。優選地，生物分子探針被固定于與聚合珠接觸的第二個接頭部分上，其中將聚合珠固定于與固體支持基底接觸的第一個接頭部分上。用于本領域時，生物芯片涵蓋包含生物分子的陣列或微陣列，優選地有規則的陣列和最優選地規則的，可尋址的陣列，所述生物分子包含生物結合對的一個成員。典型地，這些陣列是包含與編碼密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸的至少一個序列互補的核苷酸序列的寡核苷酸陣列。
或者，并優選地，可將蛋白質，肽或其它小分子排列在這些生物芯片中，以特別進行免疫學分析(其中被排列的分子是抗原)或分析生物受體(其中被排列的分子是所述受體的配體、激動劑或拮抗劑)。有效用于檢測差異基因表達的微陣列特別描述于授權給Lockhart et al的美國專利號6,040,138(從Affymetrix，Inc.，Santa Clara，Calif.商購)和授權給Wang的美國專利號6,004,755(商購自Incyte Inc.，Palo Alto，Calif.)并還特別商購自Research Genetics(Huntsville，Ala.)。
進行基因表達分析以檢測在腫瘤、轉移性細胞和正常細胞的群體之間的基因表達的不同以確定密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9是否被表達。基因表達微陣列的雜交產生密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的基因表達的圖譜。通過比較基因表達圖譜可建立基因和在這些細胞中基因差異表達圖譜的鑒定，所述基因表達圖譜是通過與正常組織的相比較，對來自腫瘤細胞的cDNA進行微陣列雜交分析而獲得。
本發明將從隨后的實驗細節中更好的得以了解。然而，本領域技術人員將容易地理解所討論的具體方法和結果僅是對于本發明的描述，本發明如在其后的權利要求中更充分地進行描述。
實施例1在呼吸性上皮中的緊密連接基因表達密蛋白、閉合蛋白、連蛋白和JAM的差異mRNA表達密蛋白、連接黏附分子(JAM)和連蛋白是多基因超家族蛋白質和緊密連接(TJ)的組分。它們在所有的上皮細胞中表達和在極化細胞中協助TJ并起障礙作用。對這些蛋白質在組成中的作用和來自呼吸上皮組織的TJ的功能的發現對于研究TJ的治療劑的組織滲透性是關鍵的。在此，我們報道得自我們通過RT-PCR在正常和被固定的呼吸上皮中的TJ基因表達分析的結果。使用引物3程序，對數個密蛋白(CLDN 1-12和14-20)的每個的特異性引物進行設計。從分化的和未分化的原初上皮細胞(primaryepithelial cell)(EpiAirway，MatTek Inc.)中提取mRNA并進行半定量RT-PCR。SEQ ID NOs7和8是用于擴增編碼密蛋白-3的cDNA的引物。SEQ ID NOs9和10是用于擴增編碼密蛋白-4的cDNA的引物。SEQ IDNOs11和12是用于擴增編碼密蛋白-9的cDNA的引物。通過EtBr-染色的瓊脂糖凝膠電泳和光密度分析法來分析這些反應的產物。在正常的上皮中，CLDN 1，3，4，9，12和20顯示高水平的RNA表達，而CLDN5，7，10，11，14和16是在更低的水平上。其它密蛋白的mRNA水平是不可檢測的。在高水平密蛋白表達組中，CLDN 1，12和20見于分化和未分化的組織中。然而，僅CLDN 3，4和9在分化的組織中表達。其它TJ轉錄物(JAM-1，閉合蛋白，ZO-1，ZO-2和ZO-3)的水平沒有顯示差異表達。我們還報道在原初呼吸細胞(16HBE14o-)和RPMI 2650，一種沒有顯示TJs的細胞系中的表達圖譜。這些結果顯示在呼吸道上皮細胞中TJs蛋白的差異表達圖譜并協助集中力量以產生作為藥物靶向的TJ調節子以促進細胞旁的藥物傳遞。
序列表<110>納斯泰克制藥公司S·C·夸伊崔坤元<120>診斷和治療癌癥的方法<130>03-07PCT<150>60/466,905<151>2003-04-30<160>12<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1294<212>DNA<213>人<220>
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1.一種試劑在制備用于治療哺乳動物中癌癥的藥物中的應用，其中所述試劑誘導密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9在癌細胞中的表達。
2.權利要求1的應用，其中所述試劑是編碼密蛋白的核酸，其中可將所述核酸在其中所述核酸被轉染到癌細胞和在所述細胞中產生密蛋白的條件下施用給哺乳動物。
3.權利要求2的應用，其中將所述核酸包含在病毒載體中。
4.權利要求3的應用，其中所述病毒載體選自由腺病毒載體、逆轉錄病毒載體和腺病毒相關病毒載體組成的組中。
5.權利要求1的應用，其中所述哺乳動物是人。
6.一種抑制癌組織轉移的應用，其包含施用治療有效量的誘導癌組織中的密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的表達的試劑的步驟。
7.權利要求6的應用，其中將一種或多種編碼密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸在其中所述核酸被轉染到癌細胞并且在所述細胞中產生密蛋白的條件下施用給哺乳動物。
8.權利要求7的應用，其中將所述核酸包含在病毒載體中。
9.權利要求6的應用，其中所述病毒載體選自由腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒和腺病毒相關病毒載體組成的組中。
10.權利要求6的方法，其中所述哺乳動物是人。
11.一種診斷哺乳動物中腫瘤的方法，所述方法包含分析密蛋白3、4和9在組織中的表達，其中所述組織是轉移性癌，是否一種或多種的密蛋白未表達。
12.權利要求11的方法，其中密蛋白-3、密蛋白4和密蛋白-9的表達通過核酸雜交技術進行。
13.一種確定個體是否具有轉移的癌細胞的體外方法，所述方法包含檢測來自個體的組織和/或體液樣品的步驟從而確定是否密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9轉錄物被在所述樣品中的細胞所表達，其中所述密蛋白轉錄物的未表達指示所述樣品中存在轉移性結腸直腸癌細胞。
14.權利要求13的方法，其中所述細胞的所述密蛋白轉錄物的表達由聚合物酶鏈式反應確定，其中所述樣品與選擇性擴增密蛋白mRNA轉錄物或產生于此的cDNA的引物接觸。
15.一種確定個體是否具有轉移性癌的體外方法，所述方法包含檢測來自個體的組織樣品的步驟從而確定密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9mRNA轉錄物是否在所述樣品中被表達，其中所述密蛋白mRNA轉錄物在所述樣品中未表達指示所述個體具有轉移性癌癥。
16.權利要求15的方法，其中使用擴增密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9轉錄物序列的引物通過聚合物酶鏈式反應分析來檢測所述密蛋白mRNA轉錄物。
17.一種用于確定個體是否具有轉移性癌的體外PCR分析試劑盒，其通過檢測來自個體的組織和/或體液樣品中的密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9mRNA的轉錄物的表達來進行，其中在所述樣品中所述密蛋白轉錄物的未表達指示所述個體具有轉移性癌，所述試劑盒包含第一個容器，其包含擴增所述密蛋白轉錄物或產生于此的cDNA的PCR引物；和包含核酸標記物的第二個容器，所述標記物被標記并可與所述cDNA的轉錄物雜交。
18.一種對哺乳動物檢驗存在或轉移的試劑盒，所述試劑盒包含一種與哺乳動物的密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9多肽特異性結合的抗體或抗體片段。
19.權利要求18的試劑盒，所述試劑盒還包含檢測所述抗體或抗體片段與所述密蛋白多肽的所述結合的手段。
20.權利要求18的試劑盒，其中所述哺乳動物是人。
21.權利要求18的試劑盒，其中所述抗體是嚙齒類動物抗體。
22.權利要求18的試劑盒，其中所述抗體是多克隆抗體。
24.權利要求18的試劑盒，其中所述抗體是單克隆抗體。
25.權利要求18的試劑盒，其中所述是用于確定密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的存在的酶聯免疫吸附測定法。
27.權利要求18的試劑盒，其中所述試劑盒是放射性免疫測定。
28.權利要求18的試劑盒，其中所述試劑盒是應用與密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9結合的熒光抗體或抗體片段的熒光免疫測定法。
29.一種用于確定細胞是否是轉移性癌細胞的方法，所述方法包含使所述細胞與結合于密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的抗體或抗體片段或其它蛋白質或多肽接觸；和測定所述抗體或抗體片段是否與細胞結合，其中如果所述抗體或抗體片段沒有與細胞結合，那么所述細胞是轉移性癌細胞。
30.權利要求29的方法，其中所述方法是用于確定密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9存在的酶聯免疫吸附測定法。
31.權利要求29的方法，其中所述方法是放射性免疫測定法。
32.權利要求29的方法，其中所述方法是應用結合于密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的熒光抗體或抗體片段的熒光免疫測定法。
全文摘要
一種治療哺乳動物中癌癥的方法，所述方法包括施用治療有效量的試劑，所述試劑誘導癌細胞中一個或多個密蛋白的表達。優選地，所述密蛋白是密蛋白－3，密蛋白－4，或密蛋白－9。在一個優選的方法中，將編碼密蛋白的核酸在其中核酸被轉染到癌細胞中并且所述密蛋白在細胞中產生的條件下施用給哺乳動物。還公開了一種診斷癌癥的方法，所述方法包含確定密蛋白3，4或9在正常表達蛋白質的細胞中的存在。如果所述細胞沒有表達密蛋白，那么其是癌性的。
文檔編號A61K48/00GK1816745SQ200480018784
公開日2006年8月9日 申請日期2004年4月30日 優先權日2003年4月30日
發明者S·C·夸伊, 崔坤元 申請人:納斯泰克制藥公司