由HLA?B7限制性腫瘤抗原衍生的優化的隱蔽性肽組成的免疫原性多肽及其用途的制作方法

目前開發中的抗腫瘤疫苗采取許多形式，包括游離肽、重組蛋白、裝載有肽或腫瘤裂解物的樹突狀細胞和DNA。盡管基于肽的疫苗在可行性方面相對于其它形式非常有吸引力，但是發現靶向優勢腫瘤肽的疫苗的許多研究僅引發弱的免疫學和臨床應答，具有強的患者間變異性。在若干臨床研究中所測試的來源于gp100的幾種肽疫苗、在II期隨機試驗中測試的MUC1衍生的BLP25肽和在非常大量的I期和II期臨床研究中測試的HER-2/neu衍生的E75肽，也是如此((Butts et al,2005；Peoples et al,2008；Rosenberg et al,2004)。

優化的隱性肽比轉基因小鼠模型中的優勢肽更有效地誘導抗腫瘤免疫(Gross et al,2004)，并且基于該技術的兩種疫苗目前處于臨床開發中：

-Vx-001，標明為NSCLC癌癥HLA-A2患者的TERT衍生的單表位肽，處于IIb期，以及

-Vx-006，也被標明為HLA-A2患者的靶向TERT、MAGE-A和HER-2/neu通用腫瘤抗原的三表位多肽，處于I期。

使用基于多肽的疫苗引發針對多種抗原的CTL應答的方法具有幾個優點。特別地，至少一種靶抗原的表達應當足以觸發疫苗誘導的CTL從而殺死腫瘤細胞，并且腫瘤細胞不可能同時丟失所有靶抗原，特別是當這些抗原對于細胞存活和腫瘤生長是必需的時候。這種方法可以引起強烈的免疫應答(Oukka et al,1996)，并增加可能從疫苗中獲益的患者比例。此外，廣譜癌癥疫苗應靶向被多種腫瘤過表達的通用腫瘤抗原，諸如TERT、HER-2/neu、MUC-1、CEA、EphA2和MAGE-A(Minev et al,2000；Ofuji et al,1998；Ogata et al,1992；Reese&Slamon,1997；Slamon et al,1987；Van den Eynde&van der Bruggen,1997；Vonderheide et al,1999)。這些抗原中的大多數參與腫瘤細胞存活和致瘤性，因此它們下調以逃避免疫應答可能對腫瘤生長具有有害作用。

為了增加可以從這樣的產品中受益的患者的數量，本發明人已經開發了命名為Vbx-016的指定給表達HLA-B7的患者的基于多肽的疫苗，其靶向四種廣泛表達的腫瘤抗原：TERT、HER-2/neu、MAGE和CEA。已經描述了構成Vbx-016的四種優化的隱蔽肽(表1)(WO2008/010098、WO2010/143010)。四種肽中的每一種均顯示在體內和體外(WO2008/010098、WO2010/143010)引發針對優化的肽和針對腫瘤細胞天然表達的天然同源肽兩者的抗腫瘤應答(表1)。有趣的是，由MAGE-A_273V6L9引發的CTL靶向六種MAGE-A抗原(-A1、-A2、-A3、-A4、-A6和-A12)。事實上，使用MAGE-A_273V6L9誘導的特異性CTL能夠識別負載有MAGE-A₂₇₃A6(包括在MAGE-A1和MAGE-A4中)、MAGE-A₂₇₃I6(包括在MAGE-A2和MAGE-A6中)和MAGE-A₂₇₃V6(包括在MAGE-A3和MAGE-A12中)的細胞。

表1：天然的和優化的表位序列

通常，在皮下注射之前，將基于多肽的疫苗用佐劑諸如Montanide ISA51VG(Seppic，Castres，France)乳化。注射后，多肽被內化到專業抗原呈遞細胞(APC)中，特別是局部存在于皮膚中的朗格漢斯細胞。然后，多肽由高爾基體中的蛋白酶體加工，并且表位與HLA分子相關聯被呈遞在細胞表面。為了確保多肽的每個表位的有效呈遞，必須測試每個連接(junction)是否被蛋白酶體正確加工。此外，本發明人先前已經描述了對于Vx006三表位多肽，多表位疫苗序列中各表位的順序對于表位加工和最終獲得針對所有相應表位的免疫應答是至關重要的(WO2007/073768)。

然后，為了避免測試24個推斷的排列，在兩個步驟中確定多肽中四個優化的肽的最佳構造：(i)測試每個連接序列；和(ii)測試相應的完整多肽。

因此測試每個潛在的連接。然后就表2中所呈現的十二種可能的二肽在HLA-B*0702轉基因小鼠中體內測試并在健康供體PBMC培養物中體外測試以下能力：

-二肽被有效加工并誘導能夠識別負載有每種優化的表位的細胞的特異性CTL的能力，

-誘導CTL以識別對應于天然存在于腫瘤細胞表面的序列的同源天然肽的能力。

表2.在轉基因小鼠中測試的二肽序列

首先，將每個二肽序列提交到兩個主要的計算機模擬(in silico)的蛋白酶體切割預測軟件MAPPP(由和Hans-Joachim Mollenkopf在Max-Planck-Institute for Infection Biology開發，可在萬維網上獲得)和PAProC(Prediction Algorithm for Proteasomal Cleavages用于蛋白酶體切割的預測算法，也可在萬維網上獲得)，其預測每個表位的加工概率。

根據PAProC，除了可以產生兩個表位(切割位點具有雙短劃線)的7T5HN3M之外，蛋白酶體不能正確地加工任何二肽(預測的切割位點用短劃線表示，表3)。

表3：二肽的蛋白酶體切割預測(PaProc)

根據MAPPP預測模型，許多組合應允許加工四個表位(數據未顯示)。應當確保蛋白酶體對每個表位有效加工的預測的最佳序列是CEA_188L9/MAGE_273L9/TERT_444A1/HER-2/neu_246A1。

然后在HLA-B*0702轉基因小鼠中體內測試二肽。如實施例1所述，就應答小鼠的數目而言，組合7C1HN3M、7C1T5M、7T5HN3M、7M1HN3M和7T5M1M產生比相應的反向序列更好的結果。7C1M1M和7M1C1M得到相同的結果。

基于這些體內實驗數據，然后設計以下理論最佳多肽：CEA_188L9/TERT_444A1/MAGE_273L9/HER-2/neu_246A1。

為了評估表位是否在四肽中被有效加工，在HLA-B*0702轉基因小鼠中測試相應的多肽SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(SEQ ID No：23)誘導特異性CTL和天然存在于腫瘤細胞表面的四個同源天然肽的能力，所述特異性CTL識別四個優化的表位。如實施例2所述，在用多肽接種兩次后，所有小鼠響應至少一種天然肽，并且大多數接種的小鼠響應兩種或更多種同源天然肽，這證實了多肽被蛋白酶體有效加工。重要的是，在一只接種的小鼠中所有天然肽均被識別至少一次。

有趣的是，該序列不同于通過蛋白酶體MAPPP切割預測模型選擇的序列，原因是與在體內發生的情況相反，7M1T5M被預測為不被正確處理。

為了在人中體外證實由HLA-B*0702轉基因小鼠獲得的結果，在來自健康的人類供體的PBMC培養物中獨立地體外測試所定義的多肽的每種連接(CEA_188L9/TERT_444A1、TERT_444A1/MAGE_273L9和MAGE_273L9/HER-2/neu_246A1)。實施例3中所述結果顯示，在人中每個二肽被有效地體外加工，并且所誘導的特異性CTL能夠識別負載有優化的或同源天然肽的細胞。

最后，在來自一個HLA-B*0702健康供體的PBMC培養物中測試多肽SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(SEQ ID No：23)(實施例4)，這證實所述多肽產生多特異性CTL免疫應答的能力。重要的是，識別了幾種天然肽。這些結果證實多肽被蛋白酶體有效加工，并且所誘導的免疫應答是多特異性的。

因此，本發明的第一方面是包含序列SPRLQLSNLXXXAPRRLVQLLXXXGPRALVETLXXXAPKHSDCLA(Seq IDNo：24)的多肽。在該序列中，CEA_188L9、TERT_444A1、MAGE_273L9和HER-2/neu_246A1表位由間隔區XXX分開，其中每個X(彼此獨立地)是任何氨基酸或不存在。因此，所述多肽至少長36個氨基酸；可以通過在表位之間添加間隔區和/或通過在其N-末端和/或C-末端添加有利于其加工的信號來增加其長度。特別地，根據本發明的多肽還可以在其N末端包含內質網轉運信號序列。幾種內質網轉運信號序列已經在科學文獻中有描述并且可以用于本發明的情況中。例如，可以根據發明在肽的N-末端添加Igκ-鏈信號序列(Ishioka et al,1999)和E3/19-kD蛋白信號序列(Anderson et al,1991)。或者或另外，本發明的多肽可以在其C末端進一步包含泛素，因為蛋白質的泛素化導致蛋白水解增加。

在本發明的多肽的優選實施方案中，四個表位彼此直接結合而不使用任何間隔區(對于每個位置X＝不存在)。因此，所述多肽包含序列SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(Seq ID No：23)。因此，在缺乏泛素和ER-轉運信號的情況下，所述多肽由下面實施例中所示的多肽(SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA，Seq ID No：23)組成。

在本發明的多肽中，氨基酸可以是L-或D-氨基酸。

本發明的多肽在大多數用所述多肽接種的HLA-B*0702轉基因小鼠中誘導針對選自CEA₁₈₈、TERT₄₄₄、MAGE₂₇₃和HER-2/neu₂₄₆同源天然肽中的至少一種并且優選至少兩種肽的特異性CD8⁺T細胞應答。

在利用來自健康HLA-B*0702供體的人PBMC的體外測定中，根據本發明的多肽還誘導針對選自CEA₁₈₈、TERT₄₄₄、MAGE₂₇₃和HER-2/neu₂₄₆天然肽中的至少一種并且優選至少兩種肽的特異性CD8⁺T細胞應答。

為了控制SEQ ID No：23的多肽被正確加工并具有良好的免疫原性，本發明人還已經證實：

-每個天然肽在HLA-B*0702轉基因小鼠中至少被識別一次；

-在利用來自健康HLA-B*0702供體的人PBMC的體外測定中，SEQ ID No：23的多肽誘導針對選自CEA₁₈₈、TERT₄₄₄、MAGE₂₇₃和HER-2/neu₂₄₆同源天然肽中的至少一種并且通常兩種或多種肽的特異性CD8⁺T細胞應答；和

-用來自兩個或更多個健康HLA-B*0702供體的PBMC獲得了這些特異性應答，并且每個優化的肽在利用來自HLA-B*0702健康供體的人PBMC的體外測定中被識別至少一次。

在更優選的實施方案中，本發明的多肽顯示所有上述性質，其可以容易地由技術人員使用下文實驗部分中描述的操作方案和測定進行測試。

本發明的另一方面是裝載有如上所述的多肽的分離的樹突狀細胞。在本文中，“分離的”是指所述樹突狀細胞在患者體外。所述細胞優選離體裝載。例如，可以通過Vonderheide等人描述的技術(Vonderheide et al,2004)用多肽裝載所述樹突狀細胞。

本發明還涉及包含肽遞送載體和如上所述的多肽的復合物。可根據本發明使用的肽遞送載體的實例是細胞穿透肽，諸如在公開為WO2013/150338、EP1795539和WO2014/053629的專利申請中描述的那些，細菌毒素諸如百日咳桿菌(B.pertussis)的腺苷酸環化酶(Fayolle et al,1999)、白喉毒素(Fayolle et al,1999)、炭疽毒素(Doling et al,1999)、志賀毒素的B亞基(Haicheur et al,2000)和其他載體諸如蜂毒PLA2(Babon et al,2005)、脂質體、病毒體(Bungener et al,2002)等。

本發明還涉及包含如上所述的多肽和/或工程化樹突狀細胞和/或復合物以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。特別地，本發明的多肽、樹突狀細胞和復合物可以用于制備用于抗癌免疫治療的免疫原性組合物。這些組合物特別可用于表達選自MAGE-A家族、HER家族、CEA和TERT中的至少一種抗原的腫瘤的免疫治療，特別是用于治療HLA-B*0702個體。

本發明可用于治療(或預防其復發)幾乎任何類型的癌癥，諸如腎上腺皮質癌，結腸直腸癌，膽管癌，膀胱癌，骨癌，腦和中樞神經系統癌癥，乳腺癌，子宮頸癌，子宮內膜癌，食管癌，胃癌，胃腸道類癌瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，卡波西肉瘤，腎癌，頭頸癌，肝癌，肺癌間皮瘤，卵巢癌，胰腺癌，陰莖癌，垂體癌，前列腺癌，視網膜母細胞瘤，橫紋肌肉瘤，皮膚癌(例如黑素瘤，非黑素瘤皮膚癌)，睪丸癌，胸腺癌，甲狀腺癌，陰道癌，外陰癌和子宮癌。

癌癥疫苗接種或治療方法，所述癌癥疫苗接種或治療方法包括用佐劑乳化多肽的步驟和將本發明的多肽在體內施用于有需要的患者，以及包括將如上所述的工程化樹突狀細胞或復合物施用于個體的步驟的疫苗接種或治療方法，也是本發明的一部分。

本發明的另一方面是包含至少一個劑量的如上所述的多肽(或復合物)和至少一個劑量的佐劑的多個部件的試劑盒(a kit of parts)。免疫佐劑是加入到疫苗制劑中以增加其功效的物質。佐劑可以增加由疫苗接種誘導的免疫應答的量級和持續時間。可用于本發明的試劑盒中的佐劑的優選實例是衍生自不完全弗氏佐劑(IFA)的那些佐劑。具有這些佐劑的疫苗制劑是油包水(W/O)乳劑。可用于根據本發明的肽的乳劑的IFA型脫毒佐劑的非限制性實例包括基于礦物油的 ISA 51和基于角鯊烯的ISA720(SEPPIC，France)。

根據本發明的另一試劑盒包含至少兩個劑量的如上所述的多肽或復合物。所述肽可以已經與佐劑一起配制或沒有與佐劑一起配制。

由于癌癥接種需要幾種刺激完全有效，本發明的試劑盒可以包含3至50、優選6至20個劑量的如上所述的多肽。

根據上述試劑盒的優選實施方案，每個劑量的多肽包含0.5至10mg的多肽。

本發明通過以下實施例進一步說明。

實施例

實施例使用以下材料和方法進行：

轉基因小鼠。先前描述了HLA-B7H-2I型敲除小鼠(Rohrlich et al,2003)，并由F.Lemonnier(Institut Pasteur，Paris，France)友情提供。

細胞。轉染HLA-B*0702的人T2-B7細胞先前已有描述(Rohrlich et al,2003)。細胞在補充有青霉素鏈霉素FCS 20％的RPMI1640培養基中生長。

肽和質粒。肽由Millegen(Labège,France)或Eurogentec(Seraing，Belgique)合成。

HLA-B*0702轉基因小鼠中體內CTL誘導。HLA-B*0702轉基因小鼠在尾基部兩次皮下接種與HV核心T13L輔助子(150μg)輔助肽締合并乳化于不完全弗氏佐劑(IFA)或Montanide ISA51VG(Seppic，Castres，France)的200μg優化的二肽或400μg的Vbx-016，間隔兩周。

最后一次疫苗接種后7天，取出脾臟，通過Ficoll離心分離T細胞，并離體檢測10μM天然或優化的肽的識別。陽性對照是伴刀豆球蛋白A，陰性對照是僅培養基。所有條件一式四份進行測試。通過ELISpot使用Diaclone Kit Murine IFNγELISpot定量產生的T細胞。

當1)在陰性對照和測試肽之間存在超過10個點差異/10⁶個細胞并且2)這兩個組之間具有統計學顯著差異的T檢驗(p<0.05)時，免疫應答被認為是陽性的。

從人PBMC產生CTL。通過白細胞單采術(leukapheresis)從健康HLA-B*0702志愿者收集PBMC。從在完全合成培養基(AIMV)中用500IU/ml GM-CSF和500IU/ml IL-4培養7天的貼壁細胞產生樹突狀細胞(DC)。在第6天，DC用10μM多肽脈沖刺激過夜。在第7天，通過用CD8Dynabeads Untouched Human CD8的陰性選擇來純化CD8+細胞。在在圓底96孔板的補充有1000IU/ml IL-6和5IU/ml IL-12、1μg/ml抗CD40和500IU/ml IFNγ的AIMV培養基中，用3×10⁴個經肽脈沖刺激的DC刺激CD8+細胞(2×10⁵)+CD8-細胞(6×10⁴)。

從第7天開始，在20IU/ml IL-2和10ng/ml IL-7、1μg/ml抗-CD40和500IU/ml IFNγ存在下，用負載肽的DC每周再刺激培養物。

在第三次再刺激后，CD8細胞在補充有20IU/ml IL-2的AIMV中保持7天。培養物在一夜間用AIMV饑餓，然后在IFNγELISpot測定中測試。

IFNγELISpot測定。對于一個96孔的培養物，收集24個孔的4個匯集物，將CD8細胞計數，并且在ELISpot板上每個孔分配50 000個CD8，每個孔含有負載10μM每種天然單肽或10μM由所述多肽組成的修飾的單肽的25000個T2B7。每個條件進行8個重復。陽性對照是植物血凝素A，陰性對照是裝載有不能結合HLA-B7分子的不相關肽的T2B7。

實施例1：在用所有不同的二肽組合進行兩次接種后的HLA-B*0702轉基因小鼠中產生的T細胞免疫應答的評估

使用每種二肽以2周的間隔接種HLA-B*0702轉基因小鼠兩次，并測試其誘導針對優化的肽及其同源天然對應物兩者的免疫應答的能力。二肽描述于表2中。在每個實驗中，最佳組合以灰色突出顯示。就應答小鼠的數目而言，7C1HN3M、7C1T5M、7T5HN3M、7M1HN3M和7T5M1M給出比反向序列更好的結果。7C1M1M和7M1C1M得到相同的結果。

表4：HLA-B*0702轉基因小鼠中每種二肽的測試

實施例2：用Vbx-016兩次接種后在HLA-B*0702小鼠中產生的T細胞免疫應答的評價

為了評估在二肽實驗中測定的Vbx-016(SEQ ID No：23)是否是最佳的，將HLA-B*0702轉基因小鼠在尾基部用乳化于不完全弗氏佐劑(IFA)或Montanide ISA51VG(Seppic，Castres，France)中的400μg的Vbx-016和150μg的HBV核心T13L輔助肽接種兩次，間隔兩周。

在兩次接種后，所有小鼠響應至少一種天然肽，并且13/14接種的小鼠響應兩種或更多種同源天然肽。重要的是，在一只接種的小鼠中每個天然肽被識別至少一次。

表5：HLA-B*0702轉基因小鼠中SEQ ID No：23的四肽的測試

實施例3：通過利用在HLA-B*0702轉基因小鼠中選擇的二肽體外誘導來自人體外周血單核細胞的特異性細胞毒性T淋巴細胞而評價T細胞免疫應答。

為了評估在轉基因小鼠中驗證的多肽CEA_188L9/TERT_444A1/MAGE_273L9/HER-2/neu_246A1中存在的連接是否在人中被有效地加工，用每種二肽(CEA_188L9/TERT_444A1、TERT_444A1/MAGE_273L9和MAGE_273L9/HER-2/neu_246A1)根據方法中描述的操作方案刺激人PBMC。通過測量來自由二肽刺激的CD8+的特異性IFNγ產生細胞，分成4個用于測試的匯集物，來評估同源天然肽的識別。當對于感興趣的肽獲得的平均點數優于使用不相關肽獲得的平均點數時，進行T檢驗；當t檢驗值小于0.05時，結果被認為是顯著陽性的并在下表中以灰色突出顯示。

在每個供體中，CTL能夠識別優化的和同源的天然肽(以及MAGE-A_273L9共有肽的四種天然肽)，證實每個連接均被蛋白酶體良好加工。

表6：用包含在多肽SEQ ID No：23中的每個二肽刺激的HLA-B7健康供體PBMC的培養物，irr：無關肽，t檢驗陽性以灰色突出顯示

實施例4：用Vbx-016從人外周血單核細胞體外誘導特異性細胞毒性T淋巴細胞。

最終將Vbx-016用于刺激來自健康供體的人PBMC。

當對于感興趣的肽獲得的平均點數優于使用不相關肽獲得的平均點數時，進行t檢驗；當t檢驗值小于0.05時，結果被認為是顯著陽性的并在下表中以灰色突出顯示。多特異性應答被誘導，并且由所誘導的CTL識別幾種天然肽，這證實了多肽被蛋白酶體良好加工并且所誘導的應答是多特異性的。

表7：用多肽SEQ ID No：23刺激的HLA-B7健康供體PBMC的培養物，irr：無關肽，t檢驗陽性結果以灰色突出顯示

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<220>

<223> 7HN3

<400> 2

Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7T5

<400> 3

Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7M1A6

<400> 4

Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7M1V6

<400> 5

Gly Pro Arg Ala Leu Ile Glu Thr Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7M1I6

<400> 6

Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7C1M

<400> 7

Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7HN3M

<400> 8

Ala Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7T5M

<400> 9

Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7M1M

<400> 10

Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu

1 5

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7C1HN3M

<400> 11

Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Ala Pro Lys His Ser Asp Cys

1 5 10 15

Leu Ala

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7HN3C1M

<400> 12

Ala Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser

1 5 10 15

Asn Leu

<210> 13

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7C1T5M

<400> 13

Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln

1 5 10 15

Leu Leu

<210> 14

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7T5C1M

<400> 14

Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser

1 5 10 15

Asn Leu

<210> 15

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7C1M1M

<400> 15

Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu

1 5 10 15

Thr Leu

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7M1C1M

<400> 16

Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser

1 5 10 15

Asn Leu

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7HN3T5M

<400> 17

Ala Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln

1 5 10 15

Leu Leu

<210> 18

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7T5HN3M

<400> 18

Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Ala Pro Lys His Ser Asp Cys

1 5 10 15

Leu Ala

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7HN3M1M

<400> 19

Ala Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu

1 5 10 15

Thr Leu

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7M1HN3M

<400> 20

Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu Ala Pro Lys His Ser Asp Cys

1 5 10 15

Leu Ala

<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7T5M1M

<400> 21

Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu

1 5 10 15

Thr Leu

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7M1T5M

<400> 22

Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln

1 5 10 15

Leu Leu

<210> 23

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽

<400> 23

Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln

1 5 10 15

Leu Leu Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu Ala Pro Lys His Ser

20 25 30

Asp Cys Leu Ala

35

<210> 24

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽

<220>

<221> 變體

<222> (10)..(12)

<223> X = 任何氨基酸或不存在

<220>

<221> 變體

<222> (22)..(24)

<223> X = 任何氨基酸或不存在

<220>

<221> 變體

<222> (31)..(36)

<223> X = 任何氨基酸或不存在

<400> 24

Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Xaa Xaa Xaa Ala Pro Arg Arg

1 5 10 15

Leu Val Gln Leu Leu Xaa Xaa Xaa Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr

20 25 30

Leu Xaa Xaa Xaa Ala Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala

35 40 45