專利名稱：Mr-1作為腫瘤標記物和靶分子在腫瘤診斷與治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤基因治療技術，具體而言，就是根據新發現的靶點基因MR-1，通
過相應手段，抑制其對腫瘤細胞生長和運動的影響，進而闡明人類MR-1作為腫瘤診斷的新
標記物和臨床治療的新靶點的可行性。
背景技術：
腫瘤的分子診斷與治療，是分子醫學的重要組成部分，已成為近年來腫瘤研究的熱點領 域。隨著分子生物學的發展，特別是人類基因組計劃的順利實施、人類基因組序列的剖析和 相關基因功能的識別，現在己經發現越來越多的腫瘤分子標記物以及^療靶點。
侵襲和轉移是惡性腫瘤的重要特征，也是患者死亡的主要原因。現已對于這一復雜病理 過程有了深入的認識。發現并證實與腫瘤轉移高度相關的基因，成為當前腫瘤轉移機制研究 的熱點，因為這些基因及其蛋白，可能成為腫瘤診斷的標記物和抗轉移治療的新靶點。
在腫瘤侵襲和轉移過程中，腫瘤細胞自原發瘤體脫落后，降解基質，穿越基底膜并進入 血管內，是完成轉移的關鍵步驟之一。而腫瘤細胞的遷移運動能力，又是能否完成該過程的 重要因素，也是腫瘤侵襲周圍組織，發生遠處轉移的基本條件。現在已知，腫瘤細胞在基質 中的遷移由4個循環往復的步驟組成，即細胞頭部形成偽足，進行延伸，之后與基質之間建 立新的粘附位點，繼而胞體發生收縮，細胞尾部退縮，通過這種不斷重復的4個過程向前遷 移(Raftopoulou M, Dev Biol, 2004， 265: 23-32)。
首先，細胞形態發生改變，細胞膜形成膜狀突起(例如板裝偽足和絲狀偽足)，即所謂 前緣突起。此為腫瘤細胞侵襲轉移的起始步驟。接著，細胞持續的遷移，需依賴細胞偽足與 細胞夕l基質(extracdlularmatrix, ECM)之間發生粘附，形成粘著斑，以作為細胞向前遷移的 支點。最后，細胞骨架發生重組，因為腫瘤細胞發生遷移時的持續運動，需要依靠張力纖維 收縮和肌動蛋白絲的延長提供動力。張力纖維是真核細胞中一種穩定的、平行排列的微絲結 構，由肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白等組成。肌動蛋白與肌球蛋白相對運動產生的收縮 力，是細胞遷移動力的主要來源。
對以上腫瘤遷移過程精確調節的分子機制十分復雜，細胞內許多信號分子均參與其中。 如Rho GTP酶通過活化肌球蛋白參與對細胞形態改變、細胞與基質粘附及細胞骨架重組的
調控(Wheeler AP, Exp Cell Res， 2004, 30:43-9), 由于其在許多惡性腫瘤中的高表達，Rho GTP酶可能成為腫瘤轉移的臨床診斷指標；粘著斑激酶FAK可通過自身磷酸化，在粘著斑 部位與paxillin (黏附有關)以及Src (轉移/侵襲有關)形成復合物(Nimwegen MJ, Bio Pharm. 2007, 73: 597-609),作為非受體蛋白酪氨酸激酶,FAK在多種腫瘤組織中表達都有顯著增加, 不失為一個有效的腫瘤治療新靶點.；而肌球蛋白輕鏈2 (myosin light chain, MLC2)的磷酸化， 對于肌球蛋白的活化十分重要。MLC2磷酸化后，肌球蛋白即可與肌動蛋白結合，促進張力 纖維的聚合，進而增強細胞運動(Connell LE, J Cell Sci. 2006;119: 2269-81)。
上述這些信號分子之間存在復雜的聯系，例如細胞運動需要細胞骨架蛋白的動力學聚合 以及粘著斑的形成。另一方面，粘著斑以及張力纖維形成也有賴于肌球蛋白的激活。此外， 已知FAK925位酪氨酸發生磷酸化，FAK即可通過與Grb2結合，激活MAP激酶信號轉導 通路(Yamamoto D， Cell Signal, 2003; 15:575-83)，促進細胞增殖。
MR-1基因(肌纖基因調節因子)是本研究所發現的一種新的人類功能基因，由GenBank 收錄，收錄號為AF41700K MR-1 DNA位于人類染色體第二號染色體2q35位置上 (GeneBank收錄號為AC021016),跨越2887 bp片段長度。MR-1基因存在三個不同剪切 方式的轉錄版本。本研究中的MR-1轉錄版本由3個外顯子組成，共7乂bp，編碼142個氨 基酸的蛋白。已有研究表明，MR-1在肌肉收縮單元中起著重要的調控作用。酵母雙雜交實 驗以及蛋白體外結合實驗表明，MR-1蛋白和參與肌肉收縮的蛋白如肌球蛋白重鏈組成蛋白 myomesinl、輕鏈蛋白MLC2以及p-烯醇化酶存在相互作用。
Myomesinl是紋狀肌M-band的組成部分，與p-肌球蛋白及其調節輕鏈均有相互作用； 輕鏈蛋白MLC2是肌原纖維粗纖維的組成蛋白，它的磷酸化在肌肉收縮中起著關鍵作用；p-烯醇化酶存在于紋狀肌M-band，與醛縮酶(aldolase)相互作用影響肌原纖維細纖維，從而 調節肌肉的收縮。所有這些結構蛋白及其相互作用，對于肌肉細胞的構成以及收縮功能的調 節都會產生重要影響。
由于腫瘤細胞中肌動蛋白與肌球蛋白間的相互作用產生的收縮力量可促進腫瘤細胞的 運動，并且活化前述一系列包括FAK在內的信號轉導通路。因此，MR-1有可能通過影響 MLC2的活化，在調節腫瘤遷移及增殖功能中發揮重要作用，其高表達可能與腫瘤細胞的某 些生物學行為存在密切關系。基因表達系列分析數據庫(SAGE)檢索結果也顯示，MR-1 基因在187個GSM文庫(含正常組織/細胞及癌組織/細胞)中均有表達，包括胚胎腎、腦、 卵巢、結腸、前列腺、胰腺、乳腺等多個組織及細胞系。其中MR-1在大部分卵巢癌、乳腺 癌、腦腫瘤以及前列腺癌組織/細胞中的表達明顯高于正常組織/細脃，因此，MR-1有望成
為一個新的腫瘤診斷的標記物和治療的靶分子。
本發明所述MR-1作為一個新的腫瘤診斷標記物和治療靶分子的研究，迄今尚未見有相 關報道。
本發明目的在于，通過研究人類功能基因MR-1參與腫瘤細胞的遷移、生長過程并在其
中發揮的重要調控功能，闡明人類MR-1與腫瘤發生發展的相關性，使MR-1成為腫瘤診斷
的新標記物和治療的一個新耙點，進而提供一種新的基因治療藥物用于臨床。
發明內容
本發明首先檢測了不同腫瘤細胞以及正常細胞中MR-1蛋白的表達水平，同時檢測了腫 瘤細胞和正常細胞中MR-1的轉錄水平，以證明和評價MR-1作為腫瘤診斷新標記物和治療 靶點的可行性提供依據。為此，選擇了 MR-1表達水平較高的人肝癌HepG2細胞，根據 GenBank中提供的MR-1序列(基因序列號為AF417001),選用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術，降低HepG2細胞中MR-1的表達，檢測MR-1表達與腫瘤細胞的體內外生長、 黏附作用及運動功能的關系，證明以MR-1為腫瘤治療靶點，在基因水平或蛋白水平對其抑 制后，可有效抑制腫瘤細胞的生長、黏附以及運動，因而有效抑制腫瘤的發生及轉移。
本發明為此提供了以下的生物學實驗
1) 、 siRNA的轉染實驗；
2) 、 Western blotting方法檢測細胞中MR-1的表達水平；
3) 、 RT-PCR方法檢測細胞中MR-1的轉錄水平；
4) 、生長曲線法檢測腫瘤細胞的增殖速率；
5) 、檢測MR-l對細胞與細胞外基質成分纖維粘連蛋白(Fibronectin， FN)的黏附能力 的影響；
6) 、檢測MR-1對細胞運動趨化能力的影響;
7) 、體內成瘤性比較實驗。
本發明的優點與積極效果在于，證明了MR-l在腫瘤細胞中的表達高于正常細胞。降低 MR-1在腫瘤細胞中的表達，可以有效地抑制腫瘤細胞的生長、粘附及運動，并顯著抑制動 物體內的成瘤性，顯示MR-l有望成為腫瘤診斷和治療的新耙點，用于制備腫瘤診斷和治療 的新制劑。
圖l一不同腫瘤細胞中MR-1蛋白的表達水平；
圖2_ MR-1蛋白在人肝癌細胞以及不同人正常細胞中的表達水平；
圖3—人腫瘤細胞以及正常細胞中MR-1的轉錄水平；
圖4一瞬時轉染siRNA 300 nM對H印G2細胞中MR-1轉錄水平的影響 其中Control泳道一未轉染任何siRNA組； Mock泳道一轉染mock-siRNA組； MR-1-siRNA (1)泳道一轉染MR-1-siRNA耙點1組； MR-1-siRNA (2)泳道—轉染MR-1-siRNA耙點2組。
圖5—瞬時轉染siRNA 300 nM對H印G2細胞中MR-1蛋白水平的影響 其中Control泳道一未轉染任何siRNA組； Mock泳it一轉染mock-siRNA組； MR-l-siRNA (1)泳道一轉染MR-1-siRNA耙點1組； MR-1-siRNA (2)泳道一轉染MR-1-siRNA耙點2組。
圖6—低表達MR-1的H印G2/shMR-l穩定細胞系的構建(Western blotting結果) 其中H印G2泳道一未轉染任何質粒；
H印G2/shmock泳道一陰性對照細胞系； H印G2/shMR-1泳道一服-1穩定低表達的細胞系。
圖7— MR-1-siRNA和對人肝癌H印G2細胞生長的影響。 其中未轉染任何siRNA組； ~H~轉染mock-siRNA組；
▲ 轉染MR-1-siRNA組。
圖8— H印G2/shMR-1細胞體外增殖速度的變化 其中H印G2—未轉染任何質粒；
H印G2/shmock—陰性對照細胞系；
▲ H印G2/shMR-1—MR-l穩定低表達的細胞系。
圖9一 MR-l-siRNA對人肝癌H印G2細胞基質粘附能力的影響
其中 未轉染任何siRNA組； —■I~轉染mock-siRNA組；
▲ 轉染MR-1-siRNA組。
圖10—H印G2/shMR-1細胞的基質黏附能力的變化 其中H印G2—未轉染任何質粒；
HelpG2/shmock—陰性對照細胞系；
H印G2/shMR-1—MR-l穩定低表達的細胞系。
圖ll一MR-1-siRNA對人肝癌H印G2細胞體外趨化運動能力的影響
其中Control—未轉染任何siRNA組； Mock-siRNA—轉染mock-siRNA組； MR-l-siRNA—轉染MR-1-siRNA組。
圖12— H印G2/shMR-l細胞體外趨化運動能力的變化
其中H印G2—未轉染任何質粒；
H印G2/shmock—陰性對照細胞系； H印G2/shMR-1—MR-1穩定低表達的細胞系。 圖13—H印G2/shMR-1細胞的腫瘤生長速度的變化 其中H印G2 —未轉染任何質粒；
H印G2/shmock—陰性對照細胞系； ▲ . H印G2/shMR-1—MR-1穩定低表達的細胞系。
具體實施方案
以下實施例僅為幫助所屬領域技術人員更好的理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
<實施例1〉 MR-1在腫瘤細胞及正常細胞中的表達
1)、 Western blotting方法檢測細胞中MR-1的表達水平
在不同細胞系的細胞中，加入120ul新鮮配制的細胞裂解液(50mMTris-HC1， pH7. 5; l%NP-40; 150mMNaCl; 1 mg/ml aprotinin; 1 mg/ml le叩印tin; 1 mM Na3V04; ImMNaF), 立即用細胞刮刀刮下細胞使其與裂解液充分混合，冰浴30分鐘至1小時。于4度13, OOOrpra 離心15分鐘，收集上清于新的EP管中，用標準Bradford法測定蛋白含量。取各樣品等量 總蛋白(20-50u g)，分別加入等體積的3倍上樣緩沖液，沸水煮沸變性5分鐘后，于10 % 的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后轉移印跡蛋白到PVDF膜上。之后，將PVDF膜浸于含 5X(w/v)脫脂奶粉TBS溶液中后室溫振搖封閉過夜，TBS (10mMTris HC1 ， pH7. 5， 150mM NaCl)室溫潤洗5次，每次5分鐘，裝入雜交袋，用含1%BSA的TBS溶液以1:1000稀釋兔 抗MR-l抗體[李天伯等，中國醫學科學院學報，2005, 27(1) :42-47]室溫孵育3小時，TBS 室溫潤洗5次，每次5分鐘。裝入新的雜交袋內，用二抗(服P-辣根過氧化物酶標記的羊抗 兔抗體)(Santa Cruz Biotechnology公司產品)溫育1小時，TBS室溫潤洗5次，每次5 分鐘。膜上滴加化學發光增強劑(Santa Cruz Biotechnqlogy公司產品)，按照試劑說明進行操作，通過化學發光成像系統Chemilmager5500 (Alpha Innotech公司.)捕獲圖像。同 時檢測actin蛋白表達量，以保證各組樣品總蛋白上樣量的一致。&-&"^抗體以1:500 稀釋(Santa Cruz Biotechnology公司產品)。結果顯示，各個腫瘤細胞系中，MR-1均有不 同程度的表達，其中，H印G2細胞中的MR-l表達最高，HT1080細胞以及肺癌細胞系中表達 相對較低(圖1)。此外，正常人胚胎血管內皮細胞(HUVEC)、正常人肝細胞(L02)、人胚 肺成纖維細胞(2BS)以及人骨髓間充質干細胞(MSC)中的MR-1表達量，遠低于三株肝癌 細胞系中MR-1的表達(圖2)。說明MR-1呈腫瘤相關性表達特點。 2)、 RT-PCR方法檢測腫瘤細胞和正常細胞中MR-1的轉錄水平
各個細胞系除去培養液加入Trizol，每平方厘米加lral Trizol試劑，提取總RNA,并 用紫外分光光度計(BECKMAN DU800)測定RNA的濃度。利用RT-PCR試劑盒(Invitrogen， Cat. No. 10928-34)進行操作。每種總RNA在擴增反應時加入1 y g作為模板，GADffl或 P-actin對照引物各加0.5u 1， MR-l引物各加lul,反應體系為25ul，反應條件為 50'C X 30分鐘反轉錄，之后94。C X 2分鐘預變性，再后94'C X 30秒，55°C X 30秒，72°C X 1 分鐘，反應進行30個循環，最后延伸反應72'CX5分鐘。反應后將產物進行瓊脂糖電泳， 凝膠成像儀照相并進行分析。結果顯示，MR-l基因在腫瘤細胞中的轉錄水平，高于三種正 常細胞HUVEC、 L02以及2BS中的轉錄水平(圖3)。
<實施例2〉 MR-l-siRNA的設計與合成
目前最有效的siRNA雙鏈是由21個核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，每條鏈的3'端均懸 掛突出兩個核苷酸，中間19個核苷酸配對。
本發明根據GenBank中提供的MR-1基因序列(序列號為AF417001),選擇設計了兩對 siRNA序列。siRNA對應的靶mRNA序列及siRNA核苷酸序列分別如下 raRNA耙序列1 (19 nt) : 5' -ACC GUG UGA AGC AGA UGA A -3' 寡核苷酸序列5' -UUC AUC UGC UUC ACA CGG UdTdT-3' 3， -dTdTA AGU AGA CGA AGU GUG CCA-5, mRNA耙序列2 (19 nt) : 5' -CCU AGG CUA UUG ACU GUU A-3' 寡核苷酸序列5' -UAA CAG UCA AUA GCC UAG GdTdT-3， 3' -dTdTA UUG UCA GUU AUC GGA UCC -5' 試驗中采用的mock序列為對照
mRNA革巴序列(19 nt): 5' -AAU UCU CCG UUC GUG UCA CGU-3， 寡核苷酸序列5' -ACG UGA CAC GM CGG AGA AdTdT-3'
3' -dTdTU GCA CUG UGC UUG CCU CUU-5'
本發明所使用的MR-1-siRNA由廣州銳博生物技術公司合成，siRNA雙鏈純度>97%。用 水溶解RNA雙鏈后，可直接用于轉染。這種方式可保證雙鏈復合體以適當形式存在并易于轉 染。 .
<實施例3>MR-1 shRNA靶序列及其DNA模板的設計與載體構建
ShRNA靶序列為MR-1-siRNA靶點2。按照現有規則合成shRNA的DNA模板，該模板包 括正義，反義兩條反的互補鏈，其組成的基本單位為Sa^^I酶切位點、靶序列正義鏈、9bp 的環序列、耙序列反義鏈、連續5個T、 ffi/ dl1酶切位點，總長65bp。
MR-1 shRNA寡核苷酸序列如下
正義鏈
5' -GATCCCGCCTAGGCTATTGACTGTTATTCAAGAGATAACAGTCAATAGCCTAGG TTTTTTGGAAA-3'
反義鏈
3, -GGCGGATCCGATAACTGACMTAAGTTCTCTATTGTCAGTTATCGGATCCAAAAAACCTTTTCGA -5, mock shRNA寡核苷酸序列如下
5' -GATCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCMGAGMCGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGGAM-3 ，
3' -GGCMGAGGCTTGCACAGTGCAMGTTCTCTTGCACTGTGCMGCCTCTT磁MACCTTTTCGA -5'
以上引物中劃線部分為相應靶mRNA序列的DNA序列及其互補序列，轉錄成RNA后，會
在此處形成發夾結構RNA的雙鏈部分。所形成的發夾RNA則可被RNA Dicer酶所識別切割成
雙鏈siRNA，從而發揮RNA干擾作用。
將合成引物退火后，形成的雙鏈DNA的5'端存在Bamhl酶切位點的粘末端，3'端存在
Hindll酶切位點的粘末端，可直接連接入經萬a礎和雙酶切的pCD-shRNA質粒載體中，經過測序驗證無誤，將其命名為pCD-shMR-1和
pCD-shmock。
<實施例4〉 MR-1-siRNA的轉染及對MR-1表達的影響
本發明使用LipofectAMINE"2000脂質體(Life Technologies,產品貨號11668-027)， 進行轉染，轉染后24及36小時進行沉默效應測定。所有操作均按產品說明書6孔板操作 規程進行。將合成的MR-l-siRNA或mock-siRNA粉末用無RNA酶的水溶解，配成20幽的儲 備溶液。實驗細胞是在轉染前18-20小時，用2 ml含l(^胎牛血清的無抗生素MEM-EBSS 細胞培養液，以40萬個/孔接種到六孔板中。將20PM的siKNA用無抗生素無血清的0pti-MEM
細胞培養液250ri稀釋至300 nM，取8ri脂質體與250W無抗生素無血清的0pti-MEM培 養液混勻，5分鐘之內，將MR-l-siRNA或mock-siRNA溶液與脂質體稀釋液輕輕混勻。siRNA 與脂質體復合物于室溫靜置20分鐘后，將500W MR-1-siRNA或mocK-siRNA脂質體復合物 加到細胞培養板(細胞生長覆蓋率為80%-90%)中。細胞在轉染前用無抗生素無血清的 Opti-MEM培養液洗一遍后，再加入新的500W無抗生素無血清'Opti-MEM培養液。轉染5小 時后，每孔中補加1 ml含20%胎牛血清的無抗生素MEM-EBSS培養液。轉染24以及36小時 后，分別采用RT-PCR以及Western blotting方法，對干擾效率進行檢測或對細胞生長、黏 附及運動能力進行檢測。
采用實施例1中所述RT-PCR方法，檢測MR-1高表達H印G2細胞中的轉錄水平，結果表 明，所設計的兩個MR-1-siRNA序列可不同程度的降低MR-l的mRNA水平，其中MR-l-siRNA(2) 序列抑制效率高于MR-1-siRNA(l)。而mock-siRNA則無明顯抑制作用(圖4)。
采用實施例l中所述Western blotting方法，對MR-1-siRNA抑制靶蛋白效果的檢測發 現，MR-1-siRNA耙點2序列可明顯降低MR-1的表達，而MR-1-siRNA耙點1和mock-siRNA, 則對細胞內MR-1的蛋白水平未呈明顯影響(圖5)。 <實施例5>: MR-1穩定低表達細胞系H印G2/shMR-i的構建與篩選
根據實施例3所得到的pCD-shMR-1構建H印G2/shMR-1細胞系，采用同樣 LipofectAMINE 2000脂質體(Life Technologies,產品貨號11668-027)進行轉染。所 有操作均按產品說明書操作規程進行。按質粒:脂質體(1 : 2. 5的比例，將2 pCD-shMR-1質粒用無抗生素無血清的0pti-MEM培養液250 Hi進行稀釋，其余轉染步驟同 siRNA的轉染。轉染24小時后，將各組細胞分別改用含400 Pg/ml G418 (GIBCO公司產品) 選擇性培養液培養，待未轉染細胞全部死亡后，將轉染組細胞消化、計數，用選擇性培養液 極度稀釋至5個細胞/ml，以每孔100W加入96孔板中，挑取只含一個細胞的培養孔，進 行單克隆培養。待細胞長滿后，依次轉入24孔板、6孔板以及25cni2培養瓶中進行培養。 Western blotting方法進行鑒定。相應地，建立轉染pCD-shmock質粒的陰性對照細胞系 H印G2/shraock。本發明對所建立的低表達MR-1的H印G2/shMR-1穩定系進行檢測結果表明， H印G2/shMR-1中MR-1的表達與正常H印G2及H印G2/shmock細胞相比明顯下調(圖6)。 <實施例6>生長曲線法檢測MR-1-siRNA對腫瘤細胞增殖速率的影響
H印G2細胞在轉染siRNA36小時后，用1 ml含10%胎牛血清的MEM-EBSS細胞培養液， 以1000個/孔接種到24孔板中。此外，將對數生長期的H印G2、H印G2/shmock、H印G2/shMR-l 細胞同樣用lml含10%胎牛血清的MEM-EBSS細胞培養液，以1000個/孔接種到24孔板中，常規培養換液，每24小時將4個孔中細胞以EDTA-胰酶消化，于顯微鏡下計數，共計6天。 結果表明，MR-l-siRNA可明顯降低細胞的生長速度(圖7)。 H印G2/shMR-1細胞的生長速度 與正常H印G2細胞相比明顯減慢，而H印G2/shmock細胞的生長速度未發生明顯改變。說明 MR-1的表達水平，可以影響細胞生長增殖過程(圖8)。
<實施例7>檢測MR-l-siRNA對腫瘤細胞與細胞外基質成分FN黏附能力的影響。
本發明進行了細胞基質粘附實驗，分別檢測了 MR-1-siRNA對H:pG2細胞基質黏附能力 的影響和MR-1低表達細胞系H印G2/shMR-1細胞對基質粘附能力的變化情況。細胞消化后， 以含1%胎牛血清的MEM-EBSS洗滌2次后，接種于預先以10 u g/ml人纖維粘連蛋白FN 包被的96孔板中。.MTT法檢測細胞接種后不同時間點對FN的粘附率。結果顯示，MR-1-siRNA 處理后，細胞對FN的粘附能力明顯低于control和mock-siRNA組細胞(圖9);H印G2/shMR-l 細胞對FN的粘附能力與H印G2和H印G2/shmock細胞相比亦出現下降(圖10) <實施例8>檢測MR-1-siRNA對腫瘤細胞運動趨化能力的影響。
采用Transwell小室培養系統，掉測MR-1-siRNA對腫瘤細胞趨化運動能力的影響以及 MR-1低表達細胞系H印G2/shMR-1細胞的運動趨化能力變化情況。本發明將不同處理的H印G2 細胞及不同穩定系細胞以含1%胎牛血清的MEM-EBSS培養液重懸，分別加入培養小室上室 腔中，下室腔加入含20%胎牛血清和10 ug/ml FN的MEM-EBSS,誘導細胞的運動。3小時 后檢測穿過膜的細胞數。結果顯示，MR-1-siRNA處理的細胞穿過膜的數量明顯少于正常 H印G2細胞以及轉染mock-siRNA的細胞，MR-1-siRNA及mock-siRNA對細胞趨化運動能力的 抑制率分別為63. 72 %和12. 73 % (圖11); H印G2/shMR-l細胞穿過膜的數量明顯少于正常 H印G2細胞及H印G2/shmock細胞。與正常H印G2細胞相比，H印G2/shMR-l細胞的趨化運動 能力降低率為56. 55%, H印G2/shmock細胞系的降低率為8. 96% (圖12);
<實施例9>體內成瘤性比較實驗
將對數生長期的H印G2、 H印G2/shmock及H印G2/shMR-1細胞消化，計數，以生理鹽水 重懸，皮下注射入5周齡雌性BALB/c 6w/"W裸小鼠右側腋窩皮下，每只注射劑量為200 ul生理鹽水含5Xl(f細胞，每組6只。腫瘤接種時，開始紀錄裸鼠體重，每周兩次。待瘤 塊形成后，通過測量可觸及的腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按照體積二ab2/2的公式計算腫瘤 體積。每4天一次，共測5次。結果顯示，H印G2/shMR-1細胞系的腫瘤生長速度明顯減慢。 在第10天才出現可觸及的瘤塊。而H印G2及H印G2/shmock細胞系則在第4天即出現可觸及 的瘤塊，且生長迅速。至接種后第20天，H印G2/shMR-1細胞組其腫瘤體積為103咖3 ，而 H印G2細胞已達1156咖3，下降率達91.01% (圖13)。
權利要求
1、MR-1作為腫瘤標記物在制備腫瘤診斷試劑中的應用。
2、 MR-1作為腫瘤靶分子在制備腫瘤治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及MR-1基因作為腫瘤標記物和靶分子在制備腫瘤診斷試劑和治療藥物中的應用，具體而言，是對新基因MR-1在人正常細胞和腫瘤細胞中的表達進行檢測，并通過RNA干擾技術，對腫瘤細胞中高表達的MR-1進行抑制后，發現腫瘤細胞的遷移及生長受到了抑制，說明MR-1有望成為一個腫瘤診斷的新標記物和臨床治療的新靶點。
文檔編號C12Q1/68GK101200768SQ20071016634
公開日2008年6月18日 申請日期2007年11月7日 優先權日2007年11月7日
發明者任開環, 何紅偉, 王以光, 邊春景, 邵榮光, 金海霞 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所