利用小肽使藥用蛋白制劑穩定化的制作方法

專利名稱：利用小肽使藥用蛋白制劑穩定化的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有生物活性蛋白和肽穩定劑的穩定的藥用制劑。本發明進一步涉及含有紅細胞生成素和穩定劑的藥用制劑，其中的穩定劑是二肽，三肽，四肽，五肽或其混合物。本發明的穩定的藥用制劑可以含有表面活性劑，如吐溫80。
背景技術：
隨著遺傳重組技術的發展，許多蛋白可被用于治療用途。作為例子的是，目前用于治療疾病的蛋白包括了紅細胞生成素，人凝血因子VIII，凝血因子IX，血紅蛋白，胰島素，干擾素α、β和γ，血管內皮細胞生長因子，白介素2及其它的蛋白。但是由于物理不穩定性(例如變性，聚合物的形成等)和化學不穩定性，例如水解作用，氧化作用和脫酰氨基作用，結果是蛋白可能失去生物活性。蛋白的穩定性進一步受到諸如pH，溫度，張力和凍融反復次數等因素的影響。
為了確保穩定性，通常治療用蛋白制劑或是以凍干蛋白的形式提供，僅在使用前將其溶解在獨立包裝的水溶性稀釋劑中，或者以含有提高穩定性的添加物的蛋白溶液形式提供。例如，有利于配制蛋白溶液的添加物，比如像游離氨基酸(例如亮氨酸，色氨酸，絲氨酸，精氨酸和組氨酸)已經在諸如AU 722300；US 5,691,312；US 6,120,761等專利中被建議使用。目前一些商業可獲得的蛋白制劑含有蛋白作為穩定劑。例如，利用人血清白蛋白或純化的明膠來抑制蛋白質溶液中的化學和物理的變化。但是，這些蛋白的添加涉及到除去病毒污染物的復雜過程。冷凍干燥法是另一種用于確保穩定性的方法，但是該方法增加了制備成本，而且因為凍干蛋白必須僅在使用前溶解，所以還增加了錯誤給藥的風險。美國專利US No.5,705,482公開了一種用肽Leu-His-Leu穩定的人生長激素(hGH)藥物溶液。
紅細胞生成素是被廣泛使用的治療試劑之一。紅細胞生成素是刺激血紅細胞形成的34-39kDa的糖蛋白激素。它產生于腎臟，而且一旦產生后，循環至骨髓中并在此刺激原始的前體細胞轉化成原紅細胞，該原紅細胞隨后成熟變成血紅細胞。在正常的健康狀態下，紅細胞生成素在血漿中的濃度很低，也就是大約0.01到0.03U/ml，但是當發生缺氧時，也就是運輸的氧水平降低時，腎臟會產生更多的紅細胞生成素。缺氧可能是例如大量失血，輻射導致的血紅細胞的破壞，或者處于高海拔等導致的結果。另外，由于血紅細胞負責身體中氧的運輸，各種形式的貧血也會引起缺氧。在正常的狀態下，紅細胞生成素水平的升高刺激了新的血紅細胞的產生由此提高氧的水平并且減弱或消除氧不足的情況。
與正常情況下對缺氧的糾正相比，慢性腎衰(“CRF”)患者的紅細胞生成素生成有限或不生成，所以不能產生足夠的血紅細胞。由于血紅細胞的正常壽命期限大約是120天，所以這種患者的貧血會隨著時間遞增。在重組紅細胞生成素發展之前，腎衰患者經常不得不進行定期的輸血以維持最低水平的血紅細胞。
目前用于給患者治療的紅細胞生成素有幾種形式-紅細胞生成素α，β，ω和6。紅細胞生成素ω是一種將人類基因組紅細胞生成素DNA的ApaI片段轉化到幼小倉鼠腎(BHK)細胞中進行表達而得到的重組蛋白，在例如美國專利US No.5,688,679中描述了紅細胞生成素ω及其表達。此外，EPOω的碳水化合物殘基的結構和組合物也已在Nimtz等(Eur.J.Biochem.，21339，1993)和Tsuda等(Eur.J.Biochem.，188405，1990)中有所描述。EPOω的平均分子量大約是35kDa，而且含有多種同種型(例如，通過等電聚焦，寬切級分(broad-cut fraction)中大約有6-8個同種型，峰級分中有6個同種型)，這就表示有不同類型和數量的糖基化，特別是不同數量的唾液酸化。EPOω有一個O連接的寡糖，每mol糖蛋白中含量低于1mol，并且在氨基酸殘基Asn-24，Asn-38，和Asn-83有3個N-糖基化位點，在氨基酸殘基Ser-126有O-糖基化位點。此外，如Sytkowski等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，176(2)698-704，1991)所報道的，跟尿液中的人紅細胞生成素或紅細胞生成素α或β不同的是，EPOω基本上都保持所有的體內生物活性，甚至是經受導致基本上，即使不是完全N-去糖基化的條件以后。
盡管商業可獲得的EPO制劑通常都有很好的耐受性和穩定性，但是在極端的條件下，這種制劑也可能不穩定且喪失活性。活性的喪失可能是由于保藏用的安瓿表面痕量的重金屬，空氣氧之類的催化作用使得EPO遭到破壞，也可能是由于EPO分子沉淀在容器壁上，可能由此發生部分的變性。考慮到每個劑量單位中僅含數微克，所以由于吸附作用導致的活性喪失可能是大量的，即使是短時間保存后。此外，外界因素諸如熱和光，或者在不含人血制品如白蛋白的制劑中，或在含有防腐劑如苯甲醇的多劑量制劑中也都可能加速活性的喪失。
因此，希望有不需要凍干所需蛋白或利用人白蛋白作為穩定劑也能提高穩定性的藥用蛋白制劑。
發明概述在一個具體實施方式
中，本發明涉及到穩定的藥用蛋白制劑，其中該制劑含有生物活性蛋白和選自Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala其衍生物和其混合物的肽穩定劑，且該制劑中不含人血清白蛋白。
在另一個具體實施方式
中，本發明涉及穩定的藥用蛋白制劑，其中該制劑含有紅細胞生成素和選白二肽，三肽，四肽，五肽及其混合物的肽穩定劑，制劑中不含人血清白蛋白。
在另一個具體實施方式
中，提供了穩定的藥用組合物，含有紅細胞生成素，選自Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala,其衍生物和其混合物的肽穩定劑，以及吐溫80，且該組合物中不含人血清白蛋白。
在下文中將部分地呈現和指出其它的目的和特點。
附圖簡述

圖1描述了如實施例1所述EPO單獨在25℃溫育4周和40℃下溫育4周(B002)，或在HAS(B001)或吐溫80(B003)存在下溫育8周后，EPO的回收率(％)。
圖2描述了如實施例1所述EPO在25℃溫育4周和40℃下溫育4周，在肽穩定劑存在時(B004-B0012)溫育8周后EPO的回收率(％)。
圖3描述了如實施例1所述EPO在25℃溫育4周和40℃下溫育4周，在肽穩定劑和吐溫80存在時(B0013-B0021)溫育8周后EPO的回收率(％)。
發明詳述本發明提供穩定的藥用蛋白制劑，其中該制劑的穩定是通過利用小肽而達到的。這里所描述的藥用蛋白制劑是不含外源蛋白的安全制品。所描述的制劑中用作穩定劑的小肽比傳統的穩定劑便宜，而且在制備過程中耗費的成本也要低于凍干產品。此外，通過利用小肽，該藥用蛋白制劑不用添加人血清白蛋白或其它的人或動物蛋白如明膠，這些成分可能含有病毒污染物。
混合到這里所描述的組合物中的蛋白可以是任何以人為治療目標的有治療價值的蛋白。因此，該蛋白包括，不限于紅細胞生成素(EPO)，凝血因子VIII，凝血因子IX，粒細胞集落刺激因子(GCSF)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)，血小板生成素，肝素，干擾素α、β和γ，白介素2，卵泡刺激因子，類胰島素生長因子(IGF)，神經生長因子(NGF)，腫瘤壞死因子(TNF)和骨形態形成家族的蛋白(BMPs)。BMPs是廣泛意義上的轉型生長因子β(TGF-β超家族)中的新的因子。在Wozney J.等Science(1988)2421528-34中，利用基因克隆技術首次鑒定了這些蛋白，根據以前的描述在去礦化的骨提取物中描述了其特征(Urist M.Science(1965)150893-99)。這些因子當正常的成骨細胞分化時表達，且已經顯示它們在體外刺激成骨細胞的分化和骨小結的形成，在體內也刺激骨形成(Harris S.等J.Bone Miner Res(1994)9855-63)。后面的這種性質使人們意識到這些因子具有作為治療導致骨質流失(bone loss)疾病試劑的潛在利用價值。骨形態形成蛋白(BMPs)包括哺乳動物成骨蛋白-1(OP-1，也已知為BMP-7，和果蠅同系物60A)，成骨蛋白-2(OP-2，也已知為BMP-8)，成骨蛋白-3(OP-3，也已知為BMP-8B)，BMP-2(也已知為BMP-2A，和果蠅同系物DPP)，BMP-3，BMP-4(也已知為BMP-2B)，BMP-5，BMP-6和它的鼠同系物Vgr-1，BMP-9，BMP-10，BMP-11，BMP-12，GDF-3(也已知為Vgr2)，GDF-8，GDF-9，GDF-10，GDF-11，GDF-12，BMP-13，BMP-14，BMP-15，GDF-5(也已知為CDMP-1)，GDF-6(也已知為CDMP-2)，和GDF-7(也已知為CDMP-3或BMP-12)。
所有上面特別提到的蛋白都是本領域公知的，而且其重組構建在本領域的普通技術人員的知識范圍內也是公知的。此外，本領域熟練的技術人員根據本發明可以容易地確定出制劑中可添加的蛋白。
在一個
具體實施例方式
中，蛋白選自紅細胞生成素，凝血因子VIII，凝血因子IX，粒細胞集落刺激因子，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，干擾素α，干擾素β，干擾素γ，白介素2，卵泡刺激因子，類胰島素生長因子，神經生長因子，BMP-2，BMP-4，BMP-7和腫瘤壞死因子。在另一個具體實施方式
中，蛋白是BMP-7。編碼BMP-7蛋白的DNA序列在例如美國專利US 5,141,905中有所描述，制備BMP-7蛋白的方法在例如美國專利US 5,366,875中有所描述。
在另一個具體實施方式
中，蛋白是紅細胞生成素。本發明組合物中所用的EPO具有與哺乳動物，特別是人的EPO，包括天然產生的EPO和通過遺傳重組而得到的EPO大體上相同的生物活性。由遺傳重組得到的EPO包括具有與天然產生的EPO相同氨基酸序列的EPO，或具有序列上一個或多個氨基酸被缺失，或一個或多個氨基酸被替換，或添加一個或多個氨基酸但仍保留上述生物活性的這種氨基酸序列的EPO。本發明中的EPO可通過任何方法制備，例如，包含從人的尿液中提取EPO的方法，隨后以不同的方式分離和純化；和包括例如在大腸桿菌，酵母，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或幼倉鼠腎(BHK)細胞中產生EPO的方法，隨后以不同的方式提取、分離和純化。在一個具體實施方式
中，EPO是產生于CHO細胞的重組EPO。在這些細胞中產生EPO可參見例如美國專利US 4,703,008。在另一個具體實施方式
中，EPO是產生于BHK細胞的EPO。在BHK細胞中產生EPO在本領域中是已知的。例如參見美國專利US 5,688,679。也是在另一個具體實施方式
中，紅細胞生成素是紅細胞生成素ω(對于EPOω)的描述參見，例如美國專利US 5,688,679和WO02/14356)。
這里所描述的組合物中生物活性蛋白的量是遞送每單位劑量中蛋白的治療有效量以達到預期效果所需的量。因此，可以根據蛋白和多種其它因素，諸如治療的疾病的類型，患者的年齡，病情的嚴重程度，存在的其它病癥等等來改變該量。熟練的技術人員可以容易地確定出組合物中所含蛋白的合適的量。
在一個
具體實施例方式
中，當生物活性蛋白是紅細胞生成素時，在藥物制劑中EPO的濃度大約在500IU/ml到大約100,000IU/ml之間。在另一個具體實施方式
中，EPO的濃度大約在1,000IU/ml到大約50,000IU/ml之間，在另一個具體實施方式
中，大約在2,000IU/ml到大約20,000IU/ml之間。在優選的具體實施方式
中，此處公開的藥用制劑中EPO的濃度大約是10,000IU/ml。對于兒科適應癥，EPO濃度可定在大約1,000IU/ml。
用于對治療患者時，EPOω可以在最初時施以較高劑量以升高血紅蛋白的水平，隨后施以較低劑量用于維持期，此時調整劑量用于長時間和持續的治療。EPOω可以以大約5IU/kg到大約150IU/kg的劑量每周1到3次給患者施用。在另一個實施例中，EPOω是以大約25IU/kg到大約60IU/kg，或大約25IU/kg到大約35IU/kg的劑量每周2次施用的。在另一實踐中，EPOω是以大約50IU/kg到大約150IU/kg，或者大約75IU/kg到大約100IU/kg的劑量每周1次施用的。
此處描述的組合物中所用的肽穩定劑包括二肽，三肽，四肽，五肽及其混合物。本發明示范性的肽包括Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala，其衍生物和其混合物；但是其它的肽也可以用。
用在蛋白制劑中的肽如果是商業可獲得的，可以從商業供應商處購買，或者可以合成。肽的固相化學合成原理是本領域公知的，且可以在本領域的普通教科書中找到。例如參見H.Dugas和C.Penney，BIOORGANIC CHEMISTRY，(1981)Springer-Verlag，New York，54-92頁。例如，可以通過固相方法利用Applied Biosystems 430A肽合成儀(商業獲自Applied Biosystems，Foster City California)和由AppliedBiosystems提供的合成循環來合成肽。
此外，設計用于這里所描述的制劑中的小肽時，可采用保守氨基酸取代。可以根據氨基酸側鏈取代基的相對的相似性，例如，它們的疏水性，親水性，電荷，大小等，對本發明的肽進行氨基酸取代。為了在本發明的肽中產生出結果為沉默變化的保守氨基酸改變，將上述各種特性考慮在內的、示范性的取代物可從屬于天然產生的氨基酸種類的其它成員中選擇。氨基酸可被分成以下四組(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性極性氨基酸；和(4)中性非極性氨基酸。這些不同組中具有代表性的氨基酸包括但不限于(1)酸性(在生理pH下帶負電荷)氨基酸諸如天冬氨酸和谷氨基酸；(2)堿性(在生理pH下帶正電荷)氨基酸如精氨酸，組氨酸和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸如甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，酪氨酸，天冬酰氨和谷氨酰氨；和(4)中性非極性氨基酸，如丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。應該指出的是，如果改變導致了功能性序列的產生，那么這些未預期帶來益處的變化也可以是有用的。舉例來說，利用保守氨基酸取代的原理，Gly-Ala可以用Ser-Leu，Thr-Leu，Thr-lle等來取代。熟練的技術人員可以很容易地確定出具有保守氨基酸取代的肽的序列。
本發明小肽中所用的氨基酸殘基的例子可以選自任何天然產生的氨基酸，諸如蛋白性(proteogenic)L-氨基酸(也就是通常摻入到蛋白質的20個氨基酸)，也可是D-氨基酸和非-蛋白性氨基酸。非蛋白性氨基酸通常是蛋白性氨基酸的代謝物或者類似物。天然產生的非蛋白性氨基酸的非限定性的例子包括鳥氨酸，牛磺酸，羥脯氨酸，羥賴氨酸，正亮氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，硒代半胱氨酸，磷酸絲氨酸，焦谷氨酸和吡咯賴氨酸。氨基酸也可以選自非天然產生的氨基酸。非天然產生的氨基酸包括但不限于氨基酸的衍生物和類似物。氨基酸衍生物的非限制性的例子包括硒代甲硫氨酸，碲甲硫氨酸，和p-氨基苯丙氨酸，氟化的氨基酸(例如氟化的色氨酸，酪氨酸，和p-苯丙氨酸)，硝基苯丙氨酸，硝基苯噁二唑-L-賴氨酸，脫氧甲基精氨酸和環己基丙氨酸。氨基酸類似物包括化學合成的、本領域已知具有氨基酸特征屬性的化合物，這些類似物的例子包括，例如色氨酸“類似物”b-苯并硒二唑并[3，2，b]吡咯基丙氨酸和脯氨酸“類似物”噻脯氨酸(thiaproline)(1，3-噻唑烷-4-羧酸)。其它的氨基酸衍生物包括氨基酸鹽，酰化氨基酸，和α-酮氨基酸。
在一個
具體實施例方式
中，肽穩定劑可以包含氨基酸鹽。作為例子，這些鹽可以由無機酸例如氨基酸鹽酸鹽或有機酸如氨基乙酸鹽制成。例如，可以采用含有氨基酸鹽酸鹽如L-組氨酸的鹽酸鹽或L-丙氨酸的鹽酸鹽的肽。氨基酸鹽酸鹽是可商業獲得的或可以用本領域的公知的方法來制備。例如Gly-His.HCl.H2O，Gly-Ala.HCl.H2O，Ala.HCl.H2O-Gly，和Ala.HCl.H2O-Ala.HCl.H2O都是一些利用氨基酸鹽的肽穩定劑的例子。在另外的具體實施方式
中，肽穩定劑含有酰化的氨基酸鹽和/或α-酮氨基酸。除了上面描述的例子外，可用上面描述的氨基酸產生一些不同的肽。作為例子但不限于此的是，二肽可以含有L-氨基酸和D-氨基酸，L-氨基酸和氨基酸鹽，D-氨基酸和氨基酸類似物，L-氨基酸和酰化的氨基酸，L-氨基酸和α-酮氨基酸，酰化的氨基酸和α-酮氨基酸，兩個酰化的氨基酸，兩個L-氨基酸，兩個氨基酸鹽，等等。熟練的技術人員可以很容易地認識到添加的的氨基酸組合不僅僅用于二肽，也可用于本發明其它的小肽。
藥用制劑可以包括單一種類肽(如Gly-Gly)，也可含有肽的混合物。作為例子，混合物可以包括二肽和二肽(如Gly-Gly，Gly-His)，二肽和三肽(例如Ala-Ala和Gly-Gly-Gly)，三肽和五肽，兩種二肽和三肽，等等。
此處所描述的穩定的藥物組合物中的肽穩定劑或其混合物的濃度在大約0.01g/L和大約10g/L之間。在另一個具體實施方式
中，肽穩定劑濃度在大約0.5g/L到大約5g/L之間。在另一個具體實施方式
中，肽穩定劑的濃度大約是1g/L。
在本發明的一個具體實施方式
中，穩定的藥用蛋白組合物中含有表面活性劑。當不受特定理論的約束時，相信在溶液中由于表面活性劑的存在減少了生物活性蛋白的粘附，比如EPO在貯存制劑的容器壁上的粘附。此處所描述的制劑中采用的表面活性劑的量其范圍從大約0.0005％w/v到大約0.5％w/v。在一個具體實施方式
中，表面活性劑的量，特別是吐溫80是0.03％w/v。在另一個具體實施方式
中表面活性劑適用于非腸道施用。
任何藥物可以接受的表面活性劑都可包括在本發明的組合物中。這些表面活性劑包括，但不限于，非離子表面活性劑(如聚亞氧烷基脫水山梨糖醇脂肪酸酯，脫水山梨糖醇脂肪酸酯，烷撐二醇脂肪酸酯，聚亞氧烷基脂肪酸酯，脂肪酸酯，聚亞氧烷基脂肪酸醚，C16-24脂肪酸，脂肪酸單-，雙-或聚-甘油酯，聚亞氧烷基烷基苯酚，烷基苯基醚，聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物，脂肪胺氧化物，脂肪酸鏈烷醇酰胺，烷基纖維素，羧烷基纖維素，聚亞氧烷基蓖麻油衍生物)，陰離子表面活性劑(例如，烷基硫酸酯，烯烴硫酸酯，醚硫酸酯，單甘油硫酸酯，烷基磺酸酯，芳香基磺酸酯，烯烴磺酸酯，烷基磺基琥珀酸酯，芳基磺基琥珀酸酯，包括月桂酰硫酸鈉，二辛基磺基琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉)，陽離子表面活性劑(例如，苯甲烷銨，聚亞氧烷基烷基胺，烷基胺，鏈烷醇銨脂肪酸酯，季銨脂肪酸酯，二烷基銨鹽，包括了硬脂酰氨，三乙醇銨油酸酯，苯索氯銨的烷基吡啶鹽)，兼性表面活性劑(例如，烷基β-氨基丙酸酯，2-烷基咪唑啉季銨鹽)和兩性離子表面活性劑。本發明組合物中采用的非離子表面活性劑包括但不限于，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯(吐溫20)，聚氧乙烯(4)脫水山梨醇單月桂酸酯(吐溫21)，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單棕櫚酸酯(吐溫40)，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單硬酯酸酯(吐溫60)，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇三硬脂酸酯(吐溫65)，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單油酸酯(吐溫80或聚山梨酸酯80)，或聚氧乙烯(20)失水山梨醇三油酸酯(吐溫85)，聚桂醇400，硬脂酸40聚羥氧基酯，聚氧乙烯氫化蓖麻油10，50和60，甘油一硬酸酯，甘油一油酸酯，聚山梨酯40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，脫水山梨醇月桂酸酯，脫水山梨醇油酸酯，脫水山梨醇棕櫚酸酯，脫水脫水山梨醇硬脂酸酯，脫水山梨醇三硬脂酸酯，脫水山梨醇倍半油酸酯，脫水山梨醇三油酸酯，失水山梨醇異硬脂酸酯，丙二醇單硬脂酸酯，聚氧乙烯單硬脂酸酯，聚氧乙烯二硬脂酸酯，甘油單硬脂酸酯，聚氧乙烯月桂醚，聚氧乙烯十六烷基醚，聚氧乙烯硬脂酰醚，聚氧乙烯油基醚，棕櫚酸，硬脂酸，油酸，油酸乙酯，肉豆蔻酸異丙酯，棕櫚酸鈉，硬脂酸鈉，油酸鈉，壬基酚聚乙氧基乙醇，三丁基苯氧基-聚乙氧基乙醇，辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇，聚氧乙烯基甘油三聚蓖麻酯或聚羥氧35(polyoxyl 35)蓖麻油(CremophorEL，BASF Corp.)，聚氧乙烯基甘油羥基硬脂酸酯(CremophorRH，40)，聚乙二醇60氫化蓖麻油(CremophorRH60)，Poloxamer124，Poloxamer188，Poloxamer237，Poloxamer388，Poloxamer407(BASF WyandotteCorp.)，甲基纖維素和羧甲基纖維素。優選，選用的表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨醇單-或三-月桂基，棕櫚基，硬脂基或油基酯，例如聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯(吐溫20)，聚氧乙烯(4)脫水山梨醇單月桂酸酯(吐溫21)，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單棕櫚酸酯(吐溫40)，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單硬酯酸酯(吐溫60)，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇三硬脂酸酯(吐溫65)，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單油酸酯(吐溫80或聚山梨酸酯80)，或聚氧乙烯(20)失水山梨醇三油酸酯(吐溫85)。
可以選擇的是，此處所描述的穩定的藥用蛋白制劑可以含有防腐劑，緩沖劑，等滲劑，和其它的用在藥用制劑組合物中的常規成分。
在一個
具體實施例方式
中，本發明組合物中使用的防腐劑是適于紅細胞生成素的那些防腐劑以保證組合物的穩定。經考慮可使用的具體的防腐劑包括苯甲醇，對羥基苯甲酸酯，苯酚，苯酚衍生物，殺藻胺及其混合物。根據利用的具體的防腐劑，該防腐劑的量可以不同。例如，苯甲醇的使用量是0.6-2.0％，優選是大約1％。在此濃度下，苯甲酸提供了防腐效果和局部麻醉效果而不會使紅細胞生成素的穩定性受到過分的影響。
在另一個具體實施方式
中，緩沖劑被用來保持組合物的pH在期望的范圍內。較好的緩沖劑包括各種鹽，下列陰離子的酸性或堿性形式檸檬酸鹽，磷酸鹽，酒石酸鹽，琥珀酸鹽，己二酸鹽，順丁烯二酸，乳酸鹽，乙酸鹽，碳酸氫鹽，丙酮酸鹽和碳酸鹽。這些可以使用的緩沖劑代表性的鹽是鈉和鉀形式的，只要該鹽和其用量在可注射的組合物中是生理學上可接受的。也可以采用這些緩沖劑的混合物。在這些溶劑中，檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖液是合需的。在藥用組合物中使用的緩沖劑的量很大程度上依賴于使用的具體緩沖劑和溶液的pH。例如，檸檬酸鹽在pH 6時的緩沖能力比在pH 7時強，則檸檬酸鹽可用在pH 6的溶液中而不用在pH 7的溶液中。溶液優選的pH范圍是大約5-8，更優選大約6-7.5，最優選大約為7。對于這些pH值，緩沖劑的量通常的范圍是大約1mM到大約30mM。檸檬酸鹽緩沖劑的用量范圍可以從大約1mM到大約20mM。相同的防腐劑，緩沖劑和等滲劑除了用于紅細胞生成素外也可用于其它蛋白，但是需要調整pH或添加物的濃度。可通過常規的試驗進行這些調整。
本發明的組合物中可以進一步包含等滲調節試劑以提供溶液的等滲力而更適于注射用。優選的試劑包括氯化鈉，甘油，甘露醇，蔗糖，山梨糖醇及其混合物。最優選的試劑是氯化鈉。需要用來提供溶液等滲的等滲調節試劑的用量根據具體試劑而改變，但是通常在大約0.1-10％的范圍內。
在一個
具體實施例方式
中，藥用蛋白制劑是通過將肽穩定劑或兩個或更多的穩定劑的混合物添加到無菌的磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液中而制備的。該溶液的pH優選是大約pH 7.2。如果要用表面活性劑，例如吐溫80，可以與肽穩定劑一起添加。隨后，充分混合該溶液，再將生物活性蛋白如EPO加到該溶液中。可選擇的是，如果要采用額外的試劑如緩沖劑或防腐劑，既可以在蛋白添加前也可以在蛋白添加后加入。
穩定的藥用蛋白制劑可以裝到密封的無菌塑料或玻璃容器中。該溶液制品可以以處方劑量提供于安瓿瓶、小瓶或一次性注射器或以多劑量形式如用于注射的袋子或瓶子等形式提供。在另一個具體實施方式
中，穩定的藥用蛋白制劑可以在冷凍條件下保存至少24個月。
本發明的穩定的蛋白制劑通常是通過非腸道途徑施用，例如，通過注射(肌內，腹膜內，皮下或靜脈內)；但是，該制劑也可通過其它的如經皮，穿粘膜或穿鼻等途徑來施用。
此處所描述的穩定的藥用蛋白制劑可被用來治療任何需要制劑中的蛋白的疾病。作為示例，但不限于此的是，當制劑中的蛋白是紅細胞生成素時，該制劑可用來處理任何期望刺激紅細胞(RBC)增生的疾病。因此，EPO可被用來治療貧血，其中貧血是與內源紅細胞生成素不足，惡性疾病貧血，因對惡性疾病的化療/放療導致的貧血，或慢性病的貧血相關的。慢性病的貧血包括但不限于與類風濕性關節炎，肝炎，AIDS(特別是用AZT治療的患者)相關的貧血，早產兒貧血，與腎衰竭有關的貧血，地中海貧血，自身免疫溶血性貧血，再生障礙型貧血和與手術相關的貧血(例如用于接受骨髓移植的患者以增加紅細胞生成素)。
在另一個具體實施方式
中，當蛋白屬于BMP家族如BMP-7時，它可被用于治療多血癥的疾病，這種疾病的特征是需要增加骨形成。這些疾病包括，例如骨折，期望刺激骨生長和加快骨修復。這里所描述的其它的可以用BMP蛋白治療的骨缺乏的疾病包括但不限于骨節缺損(bone segmental defect)，牙周病，轉移性骨疾病，溶骨病，和結締組織修復是有益的疾病，例如愈合或再生軟骨缺損或損傷。其它的以需要骨生長為特征的疾病包括原發和繼發甲狀旁腺機能亢進和骨質疏松(包括年齡相關的骨質疏松，與絕經后激素狀態相關的骨質疏松，廢用性骨質疏松，糖尿病相關的骨質疏松，和糖皮質激素相關的骨質疏松)。除此之外，此處被制成制劑的BMP家族成員也可用來調節正常或異常細胞或組織的代謝，增生和/或分化。
本發明的其它的特性，目的和優點對于本領域的技術人員來說將是很明顯的。這里所提供的說明和圖例是計劃使本領域的其它技術人員認識到發明，它的原理和它的實際應用。本領域的技術人員可以對本發明進行多種形式的修改和應用，例如可以更好地適合于特定應用的需要。因此，上述本發明的特定的具體實施方式
不是用來窮盡或限制本發明的。
說明書中引用的所有的公開出版物和專利申請在此通過引用而被合并，就像每個單獨的公開出版物或專利申請明確地和獨立地被指出通過引用而被合并一樣。
縮寫和定義為有助于理解本發明，一些術語定義如下“BMP”是骨形成蛋白的縮寫。
“CDMP”是來源于軟骨的形成蛋白的縮寫。
“DPP”代表decapentaplegeic蛋白。
“GDF”是生長和分化因子的縮寫。
“OP”是成骨蛋白的縮寫。
“Vgr”是植物相關蛋白的縮寫。
“RH”是相對濕度的縮寫。
“HAS”是人血清白蛋白的縮寫。
“AUC”是曲線下區域的縮寫。
對于這里所使用的術語“氨基酸”是指最廣泛意義上的氨基酸，包括天然產生的氨基酸和包括了氨基酸類似物和衍生物的非天然產生的氨基酸。后者包括含有氨基酸部分的分子。本領域的技術人員將意識到，從廣泛定義上來看，此處對氨基酸的引用包括，例如天然產生的蛋白性L-氨基酸；D-氨基酸；化學改造的氨基酸如氨基酸類似物和衍生物；天然產生的非蛋白性氨基酸，和具有本領域已知的有氨基酸特征屬性的化學合成的化合物。
對于此處所用的“生物活性蛋白”指的是蛋白與目的天然形式的蛋白執行大體上相同功能的能力。
“組合物”和“制劑”可在此交替使用。
對于此處所用的“肽”意思是由至少通過一個肽鍵連接的兩個或更多個氨基酸組成的化合物。“二肽”指的是由通過肽鍵連接的兩個氨基酸組成的肽，“三肽”指的是由通過肽鍵連接的三個氨基酸組成的肽，等等。用于本發明目的的“小肽”包括二肽，三肽，四肽和五肽。
術語“穩定的”和“被穩定的”的意思是本發明的藥物組合物與同樣的不含有任何這里所描述的肽穩定劑的組合物相比具有增強的儲藏穩定性。如果該制劑混合有抑菌劑的話，本發明所提供的這種穩定還可以是液體形式在2-8℃時的儲藏穩定性增強，不用再配制給藥方便，和能夠以預填充的方便使用的注射器提供該制劑，或作為多劑量制劑提供，只要該制劑與抑菌劑相容。優選的是，本發明的穩定的組分可以在冷藏條件下(在大約2-大約8℃之間)儲藏至少6個月，12個月，18個月，24個月，30個月，36個月，或更長。
術語“治療有效的”是指在治療過程中可以達到改善疾病的嚴重程度和治療期間疾病發生的頻率，同時避免一般與其他替代治療相關的副作用的生物活性蛋白量。
“IU”或“國際單位”是藥物或天然產生的物質的特定生物效果的量的標準度量單位。紅細胞生成素的IU具體是指由體內超缺氧polycythaemic鼠的試驗所得到的測量單位，該試驗是用紅細胞生成素的世界衛生組織國際參考制備(World Health Organization′s InternationalReference Preparation)標準化的分析。對于已給出的材料，需要提供一個IU的材料的量會隨著材料的來源，條件，質量，純度，和/或類型而變化。參考Storring等，Brit.J.Haematol.，10079，1998，可以進一步明白Ius與其它的如放射免疫試驗定義的單位之間的關系。
下面的實施例闡明了本發明，但這些實施例不是被用來將本發明的各個方面限制到這些舉例說明中。
實施例1本研究是用來評價在含有作為穩定劑的1)小肽或2)小肽和吐溫80的PBS溶液中紅細胞生成素ω的穩定性。該穩定性的評價是以不采用穩定劑或僅用人血清白蛋白(HAS)或吐溫80作為穩定劑的EPOω的穩定性為對照的。研究中利用了下列小肽Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His.HCl.H2O，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly和Ala-Ala。所有的肽和吐溫80均購自Sigma-Aldrich。
下面列出的方案用于制備用以評估含紅細胞生成素ω的藥用制劑的儲藏穩定性的溶液將制備PBS的溶液裝入玻璃瓶中-加入注射用水(WFI)大約800g；-加入8.18g的NaCL和1.56g的NaH2PO4.2H2O；-攪拌加入WFI至全部配制的溶液的質量1006g；-快速攪拌最少15分鐘(所有的鹽應該在混合結束前全部溶解)；-在溶液中充入氮氣；鼓泡2分鐘；-測定溶液pH并用10M的NaOH調整到7.20(范圍7.10到7.30)；-用無菌的0.22μm的過濾膜將溶液過濾到無菌容器中；和-將使用過濾溶液制備紅細胞生成素的溶液。
將PBS pH 7.2(50ml)與肽(62.5mg)混合，制成PBS pH 7.2-肽(1.25g/L)的母液。
將PBS pH 7.2(1000ml)與吐溫80(0.375g)混合，制成PBS pH 7.2-吐溫80(0.375g/L)的母液。
將肽(62.5mg)加到50ml的PBS pH 7.2-吐溫80(0.375g/L)的母液中，制成PBS pH 7.2-肽(1.25g/L)-吐溫80(0.375g/L)的母液。
將PBS pH 7.2(75.3ml)與14.7ml的EPO濃縮液(306,000IU/ml)混合，制成在PBS pH 7.2中含EPO(50,000IU/ml)的母液。
將16ml的PBS pH 7.2和4ml的EPO(50,000IU/ml)母液混合制成在PBS pH 7.2中EPO 10,000IU/ml的溶液。
將16ml的PBS pH 7.2，4ml的EPO(50,000IU/ml)母液和250μl的HAS(20％w/v)混合，制成在PBS pH 7.2-HAS 2.5mg/L中EPO 10,000IU/ml的溶液。
將16ml的PBS pH 7.2-吐溫80的母液和4ml的EPO(50,000IU/ml)母液混合，制成在PBS pH 7.2-吐溫80中EPO 10,000IU/ml的溶液。
將16ml的PBS pH 7.2-肽的母液和4ml的EPO(50,000IU/ml)母液混合，制成在PBS pH 7.2-肽中EPO 10,000IU/ml的溶液。
將16ml的PBS pH 7.2-吐溫80-肽的母液和4ml的EPO(50,000IU/ml)母液混合，制成在PBS pH 7.2-吐溫80(0.3g/L)-肽(1.0g/L)中EPO 10,000IU/ml的溶液。
將所有的溶液充分混合以確保其均勻，并通過無菌的0.22μm的過濾膜將其過濾到無菌容器中。
表1顯示本研究中所用的EPO樣品。

樣品最初是保存在25℃/60％RH中下，在1，2，4，6，8和10周時進行分析。儲存4周后，將2組樣品轉放到40℃/60％RH下，并在6和8周時進行分析。這樣做是為了使溶液處于更大范圍的逆境中以放大任何潛在的穩定劑的效果。10周后終止在25℃/60％RH下的研究。
利用配備有WATERS烤箱和WATERS雙λ光吸收檢測器的WATERSALLIANCE 2690分離組件對樣品用高壓液相色譜分析。該系統與WATERSC4-300-5μm DELTA-PACK柱相連。用無菌的1.0ml的，配有23G×11/4無菌KENALL Monoject針頭的KENALL Monoject注射器將樣品注射入HPLC。當在280nm下峰值AUC時測定蛋白含量。
記錄下曲線下區域值(AUC)并用來基于在最初階段的對應來計算蛋白的回收率。該回收率是以在目的階段和最初階段的對應之間的比例來計算的。
回收率AUC(％)＝100×CAUC t/CAUC 0其中，回收率AUC是以AUC為基礎的回收率，CAUC t是以AUC峰值表示的目的階段紅細胞生成素的含量，和CAUC 0是以AUC峰值表示最初階段紅細胞生成素的含量。
在研究開始之前，先要考查由肽穩定劑帶來的潛在的降解產物與紅細胞生成素ω之間是否不存在干擾。這是設計用于評價是否肽和/或吐溫80能夠影響AUC和EPO的回收％的正確計算的另外的試驗對照。為了確定這個問題，含有小肽和無紅細胞生成素ω的溶液在注射前先在25℃/60％RH和40℃/60％RH保存4周下。色譜分析顯示在紅細胞生成素ω信號(20.6min)附近沒有可觀測到的信號，表明肽和/或吐溫80不會影響AUC和EPO回收％的計算。
表2(如下所示)顯示了用小肽(B004-B012)或小肽和吐溫80(B013-B021)來穩定時，在25℃/60％RH下1，2，4，6，8和10周以及在40℃/60％RH下6和8周時EPO的％回收率。從表中可以看出，除了僅含EPO(B002)和吐溫(B003)的對照溶液外，保存在25℃/60％RH下10周時的試驗樣品中幾乎沒有降解記錄。在同樣的條件下，含HSA的EPO樣品(B001)也沒有記錄到蛋白降解。對于不含HSA的對照溶液(B002和B003)，隨著時間記錄下有輕微的減少。此外，40℃/60％RH時，在含有肽或肽和吐溫穩定劑的樣品中的EPO的穩定性要好過在同樣條件下保存的不含HSA的對照樣品。另外，正如所預想的，在25℃下EP0溶液比在40℃顯示出更好的儲存穩定性。在圖1，2和3中以圖表的形式顯示了相同的結果。
表2

*在25℃/60％RH下保存8周后，發現B008的回收率是87％。該偏離趨勢的結果在下面的階段或在40℃/60％RH都沒有得到確證，應歸因于設備導致的結果(能量供應故障)。
應該指出的是，對于特定的研究而言，根據利用的蛋白，研究的時間長短等因素，可以對所有上面提到的步驟進行修改。本領域的技術人員可以無需過多的實驗而設計出這種修改。
權利要求
1.一種穩定的藥用組合物，含有治療有效量的生物活性蛋白和選自Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala，其衍生物和其混合物的肽穩定劑，其中該組合物不含血清白蛋白。
2.權利要求1所述的組合物，其中生物活性蛋白選自紅細胞生成素，凝血因子VIII，凝血因子IX，粒細胞集落刺激因子，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，干擾素α，干擾素β，干擾素γ，白介素2，卵泡刺激激素，類胰島素生長因子，神經生長因子，BMP-2，BMP-4，BMP-7和腫瘤壞死因子。
3.權利要求2的組合物，其中的生物活性蛋白是來源于重組的。
4.權利要求3的組合物，其中的生物活性蛋白是紅細胞生成素。
5.權利要求4的組合物，其中的生物活性蛋白是紅細胞生成素ω。
6.權利要求5的組合物，其中在所述組合物中紅細胞生成素ω的濃度在大約500IU/ml和大約100,000IU/ml之間。
7.權利要求6的組合物，其中紅細胞生成素ω的濃度在大約2,000IU/ml和大約20,000IU/ml之間。
8.權利要求1的組合物，其中的衍生物包括Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，和Ala-Ala的鹽。
9.權利要求1的組合物，其中的血清白蛋白是人血清白蛋白。
10.權利要求1的組合物，其中在所述組合物中肽穩定劑的濃度是在大約0.01g/L和大約10g/L之間。
11.權利要求10的組合物，其中肽穩定劑的濃度在大約0.5g/L和大約5g/L之間。
12.權利要求1的組合物，其中在組合物進一步含有表面活性劑。
13.權利要求12的組合物，其中的表面活性劑是非離子表面活性劑，陽離子表面活性劑，陰離子表面活性劑，兼性表面活性劑，兩性離子表面活性劑，或其混合物。
14.權利要求13的組合物，其中的表面活性劑是聚亞氧烷基脫水山梨糖醇脂肪酸酯。
15.權利要求12的組合物，其中在所述組合物中表面活性劑的濃度在大約0.0005％w/v和大約0.5％w/v之間。
16.一種穩定的含有紅細胞生成素和選自二肽，三肽，四肽，五肽及其混合物的肽穩定劑的藥用組合物，且其中該組合物不含血清白蛋白。
17.權利要求16的組合物，其中的肽穩定劑是二肽。
18.權利要求16的組合物，其中的肽穩定劑是三肽。
19.權利要求16的組合物，其中的肽穩定劑選自Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala，其衍生物和其混合物。
20.權利要求19的組合物，其中的衍生物包括Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala的鹽。
21.權利要求16的組合物，其中在所述組合物中肽穩定劑的濃度在大約0.01g/L和大約10g/L之間。
22.權利要求21的組合物，其中肽穩定劑的濃度在大約0.5g/L和大約5g/L之間。
23.權利要求16的組合物，其中的血清白蛋白是人血清白蛋白。
24.權利要求16的組合物，其中的紅細胞生成素是重組紅細胞生成素。
25.權利要求24的組合物，其中的重組紅細胞生成素產生于BHK細胞。
26.權利要求24的組合物，其中的重組紅細胞生成素產生于CHO細胞。
27.權利要求24的組合物，其中的重組紅細胞生成素是紅細胞生成素ω。
28.權利要求27的組合物，其中在所述組合物中紅細胞生成素ω的濃度在大約500IU/ml和大約100,000IU/ml之間。
29.權利要求28的組合物，其中在所述組合物中紅細胞生成素ω的濃度在大約2,000IU/ml和大約20,000IU/ml之間。
30.權利要求16的組合物，其中組合物進一步含有表面活性劑。
31.權利要求30的組合物，其中的表面活性劑是非離子表面活性劑，陽離子表面活性劑，陰離子表面活性劑，兼性表面活性劑，兩性離子表面活性劑，或其混合物。
32.權利要求31的組合物，其中的表面活性劑是聚亞氧烷基脫水山梨糖醇脂肪酸酯。
33.權利要求30的組合物，其中在所述組合物中表面活性劑的濃度在大約0.0005％w/v和大約0.5％w/v之間。
34.一種穩定的含有紅細胞生成素，聚亞氧烷基脫水山梨糖醇脂肪酸酯，和選自Gly-Gly，Gly-Gly-Gly，Gly-Tyr，Gly-Phe，Gly-His，Gly-Asp，Gly-Ala，Ala-Gly，Ala-Ala，其衍生物和其混合物的肽穩定劑的藥用組合物，其中該組合物不含血清白蛋白。
35.權利要求34的組合物，其中的紅細胞生成素是紅細胞生成素ω。
36.權利要求34的組合物，其中的血清白蛋白是人血清白蛋白。
全文摘要
本發明涉及利用選自Gly－Gly，Gly－Gly－Gly，Gly－Tyr，Gly－Phe，Gly－His，Gly－Asp，Gly－Ala，Ala－Gly，Ala－Ala，其衍生物和其混合物的肽穩定劑來穩定的藥用蛋白制劑。此外，本發明還涉及含有紅細胞生成素和選自二肽，三肽，四肽，五肽，和其混合物的肽穩定劑的穩定的藥用制劑。除了肽穩定劑之外，該制劑可含有表面活性劑。
文檔編號A61K38/06GK1863544SQ200480028999
公開日2006年11月15日 申請日期2004年9月22日 優先權日2003年10月10日
發明者費邊·薩默斯, 迪爾克·費 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特醫療保健股份有限公司