專利名稱：促血管化的組織工程骨及其體外構建方法
技術領域：
本發明涉及一種骨組織的生物替代物即組織工程骨，具體來說是促血管化處理的組織工程骨以及體外構建方法。
背景技術：
由于因創傷或骨病所致的骨缺損在骨科臨床十分常見，而現有治療手段均存在明顯缺陷，使得近年來應用組織工程學技術修復骨缺損的研究進展迅速。自1993年Vacanti等利用牛成骨細胞與聚羥基乙酸構建組織工程化骨以來，對骨組織工程中的種子細胞、支架材料、生長因子、培養條件、體內修復等實驗項目的研究已經取得階段性成果，Quarto、楊志明等將此技術試用于臨床，獲得初步成功。組織工程骨的構建基本方法為將體外培養的種子細胞-成骨細胞復合接種到作為細胞外基質的支架材料上，經過體內或體外培養構建成組織工程骨，植入體內進行骨缺損的修復。
骨缺損的良好修復必須依賴充分的血供，新生血管不僅是氧氣、營養物質及代謝廢物運輸的通道，而且是參與骨修復調控的細胞、信號分子通過的重要路徑，即血管化和骨再生是骨愈合過程中的兩個最基本環節。體外構建的組織工程化骨，植入體內后同樣必須迅速建立充分的血供，為種子細胞功能活動提供充足的營養，只有這樣才能保證組織工程化骨的活性和促進骨缺損修復，這在完成較大骨缺損修復時顯得尤為重要。
目前促人工骨血管化的技術措施主要有6種。①用血管束包裹復合成骨細胞的可降解支架材料，新血管以枝芽方式長入材料內；②將人工骨植入帶有軸心血管的肌肉組織內，預構帶血管蒂的組織工程化骨肌骨瓣；③植入組織工程化骨時，就近選擇帶血管蒂的筋膜瓣包裹移植物；這些是借用體內已經存在的血管條件來促進人工骨的血管化，存在增加創傷、受局部血管條件限制等缺點，從而限制了其臨床推廣應用。④血管內皮細胞聯合成骨細胞與支架材料復合；存在自體血管內皮細胞不易獲取、體外擴增能力有限的不足。⑤應用促血管生成的生長因子，如血管內皮細胞生長因子(VEGF)，采用均勻吸附于支架材料內的生長因子緩釋技術，或者通過基因轉染技術促進細胞分泌；這類方法也存在缺點，如由于生長因子對血管生成的作用是網絡式的序貫作用，單一因子低濃度作用效果是有限的，而高濃度VEGF作用有誘發血管瘤的危險。⑥嘗試上述方法的聯合應用。所以，上述六種仍然不能獲得令人滿意的人工骨的血管化效果。
發明內容
針對現有的組織工程化骨促血管化技術的不足，本發明的目的在于提供一種新的促血管化的組織工程骨，這種組織工程骨移植后具有持續、局限和緩慢釋放促血管生長因子，實現血管生成與骨再生的同時快速啟動，從而明顯加速骨愈合的優點。
為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案在體外構建的組織化工程骨上有多個孔隙，在孔隙內有嵌有膠原凝膠，在膠原凝膠中含有促血管生成的生長因子。
所述的促血管生成的生長因子可以采用血管內皮細胞生長因子，在膠原凝膠中的重量含量為50～200μg/ml。
所述的膠原凝膠中的還可以含有10～100μg/ml的堿性成纖維細胞生長因子，與所述的血管內皮細胞生長因子形成雙生長因子共同作用，比采用單一的血管內皮細胞生長因子能夠更好的促進血管組織的生成。
在膠原凝膠中還可以含有400～2000U/ml的肝素(U醫學上常用的標準單位，125U相當于1mg的劑量)，作為緩釋劑控制生長因子釋放速率，根據需要通過采用不同的肝素用量以方便地設計血管組織的生成速率。
所述的血管內皮細胞生長因子在膠原凝膠中的最佳含量為100μg/ml。
所述的堿性成纖維細胞生長因子在膠原凝膠中的最佳含量為50μg/ml。
所述的肝素在膠原凝膠中的最佳含量為500U/ml。
本發明還提供了這種促血管化的組織工程骨的體外構建方法，包括(1)體外制備用于組織構建的支架材料制備用于組織工程骨構建的支架材料，在將復合生長因子的部位預留多個孔隙；(2)組織工程骨的體外構建將體外大量擴增的相應種子細胞與支架材料復合，然后在體外靜態或動態培養一定時間，得到組織工程化骨組織；
(3)生長因子的緩釋處理將促血管生成的生長因子復合入膠原凝膠中；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構建的組織工程化骨組織的預留孔隙中。
上述方法中，所述的促血管生成的生長因子可以為血管內皮細胞生長因子，其在膠原凝膠中的含量為50～200μg/ml；或血管內皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子混合成的雙生長因子，其中血管內皮細胞生長因子在膠原凝膠中含量為50～200μg/ml，堿性成纖維細胞生長因子在膠原凝膠中的含量為10～100μg/ml。
在所述的膠原凝膠中還可以含有400～2000U/ml的肝素。
上述方法中，所述的血管內皮細胞生長因子在膠原凝膠中的最佳含量為100μg/ml。
上述方法中，所述的堿性成纖維細胞生長因子在膠原凝膠中的最佳含量為50μg/ml。
上述方法中，所述的肝素在膠原凝膠中的最佳含量為500U/ml。
本發明的促血管化的組織工程骨由于在組織化工程骨的一些局部區域孔隙內復合有促血管生成的生長因子，具有如下有益效果(1)生長因子在組織工程骨中復合的區域為多點的局部方式，避免了均勻復合時對組織工程骨中成骨反應的不利影響。
(2)當將堿性成纖維細胞生長因子引入時，使其與血管內皮細胞生長因子聯合應用，協調促進血管生成，避免了單一因子劑量過低時療效不足，而劑量過高時并發癥較多的缺陷。
(3)膠原凝膠即作為生長因子的載體，同時作為緩釋材料，延長了生長因子局部釋放和作用時間，當膠原凝膠中還復合有作為緩釋劑的肝素時，通過肝素用量的變化可以更加方便地設計生長因子局部釋放和作用的時間，使血管組織更好的生長。
(4)應用本發明的血管化的組織工程骨的構建方法，使組織工程骨在體外構建，與生長因子的局部復合方式結合，通過控制生產因子的局部濃度和復合位置，可以有效控制血管化的形成。
(5)同現有技術相比，通過該技術構建的血管化組織工程骨在移植時對患者創傷反應小，不損傷局部的其它重要血管。
(6)組織工程骨在移植后，隨著組織修復改建的完成，局部血管在初期大量增加后，可以在后期逐漸減少，從而與局部組織功能相協調。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明的促血管化的組織工程骨及其體外構建方法作進一步說明，以助于理解本發明的內容。
實施例1(1)體外處理用于骨組織構建的支架材料制備或購買成骨性支架材料(脫蛋白骨衍生材料、羥基磷灰石、磷酸三鈣等)，在將復合生長因子的部位鉆孔而預留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構建利用現有的組織工程技術將體外大量擴增的相應種子細胞與支架材料復合，然后利用已有技術在體外靜態或動態培養一定時間，得到組織工程化骨組織；
(3)生長因子的緩釋處理將血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子與肝素按調和，然后復合入膠原凝膠中，使復合后的膠原凝膠中生長因子及肝素的含量為VEGF100μg/ml、bFGF50μg/ml、肝素500U/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構建的組織工程化骨組織的預留孔隙中。
實施例2(1)體外制備用于組織構建的支架材料制備用于組織工程骨構建的支架材料，在將復合生長因子的部位鉆孔而預留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構建將體外大量擴增的相應種子細胞與支架材料復合，然后在體外靜態或動態培養一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子與肝素按調和，然后復合入膠原凝膠中，使膠原凝膠中生長因子及肝素的含量為VEGF200μg/ml、bFGF10μg/ml、肝素400U/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構建的組織工程化骨組織的預留孔隙中。
實施例3(1)體外制備用于組織構建的支架材料制備用于組織工程骨構建的支架材料，在將復合生長因子的部位鉆孔而預留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構建將體外大量擴增的相應種子細胞與支架材料復合，然后在體外靜態或動態培養一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子與肝素按調和，然后復合入膠原凝膠中，使膠原凝膠中生長因子及肝素的含量為VEGF200μg/ml、bFGF100μg/ml、肝素2000U/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構建的組織工程化骨組織的預留孔隙中。
實施例4(1)體外制備用于組織構建的支架材料制備用于組織工程骨構建的支架材料，在將復合生長因子的部位鉆孔而預留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構建將體外大量擴增的相應種子細胞與支架材料復合，然后在體外靜態或動態培養一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子與肝素按調和，然后復合入膠原凝膠中，使膠原凝膠中生長因子及肝素的含量為VEGF50μg/ml、bFGF30μg/ml、肝素600U/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構建的組織工程化骨組織的預留孔隙中。
將實施例1～4中的組織工程骨移植入兔尺骨中段或羊脛骨中段骨缺損區域，經過術后3天、2周、4周、12周、18周的X線攝片、和移植區域的病理組織分析、血管灌注實驗等，發現術后2周內大量的具有血管內皮細胞表型的細胞聚集在膠原凝膠區域，并產生大量的網狀血管，術后4～12周血管直徑增大，但數量逐漸減少，術后12～18周該區域的血管分布與鄰近的組織無明顯差異；復合促血管生成物質的組織工程骨與單一的組織工程骨比較骨修復效果，可見前者在術后2周時成骨活動就比后者強，術后4周開始其骨痂和骨修復效果均優于移植單一的組織工程骨。
實施例5(1)體外處理用于骨組織構建的支架材料制備或購買成骨性支架材料(脫蛋白骨衍生材料、羥基磷灰石、磷酸三鈣等)，在將復合生長因子的部位鉆孔而預留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構建利用現有的組織工程技術將體外大量擴增的相應種子細胞與支架材料復合，然后利用已有技術在體外靜態或動態培養一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內皮細胞生長因子復合入膠原凝膠中，使復合后的膠原凝膠中生長因子的含量為200μg/m；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構建的組織工程化骨組織的預留孔隙中。
實施例6
(1)體外處理用于骨組織構建的支架材料制備或購買成骨性支架材料(脫蛋白骨衍生材料、羥基磷灰石、磷酸三鈣等)，在將復合生長因子的部位鉆孔而預留多個孔隙，孔隙直徑為2～8mm；(2)組織工程骨的體外構建利用現有的組織工程技術將體外大量擴增的相應種子細胞與支架材料復合，然后利用已有技術在體外靜態或動態培養一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子調和，然后復合入膠原凝膠中，使復合后的膠原凝膠中生長因子的含量為VEGF100μg/ml、bFGF50μg/ml；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構建的組織工程化骨組織的預留孔隙中。
將實施例5，6中的組織工程骨移植入兔尺骨中段骨缺損區域，經過術后3天、2周、4周、12周、18周的X線攝片、和移植區域的病理組織分析、血管灌注實驗等，發現其促經血管生成的速度和微血管密度均低于實施1～4的效果，但是比未復合促血管生成生長因子的單一組織工程骨顯示出更強的促血管生成作用，當大量提高血管內皮細胞生長因子的濃度后，則局部血管生成的質量下降，有時可產生血管瘤、組織水腫等副作用。
權利要求
1.一種促血管化的組織工程骨，其特征在于在體外構建的組織化工程骨上有多個孔隙，在孔隙內嵌有膠原凝膠，在膠原凝膠中含有促血管生成的生長因子。
2.如權利要求1所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的膠原凝膠中含有的促血管生成的生長因子為血管內皮細胞生長因子，其在膠原凝膠中的含量為50～200μg/ml。
3.如權利要求2所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于在所述的促血管生成的生長因子還包括堿性成纖維細胞生長因子，其在膠原凝膠中的含量為10～100μg/ml。
4.如權利要求3所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的膠原凝膠中還含有400～2000U/ml的肝素。
5.如權利要求2或3或4所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的血管內皮細胞生長因子在膠原凝膠中的含量為100μg/ml。
6.如權利要求3或4所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的堿性成纖維細胞生長因子在膠原凝膠中的含量為50μg/ml。
7.如權利要求4所述的促血管化的組織工程骨，其特征在于所述的肝素在膠原凝膠中的含量為500U/ml。
8.一種權利要求1中所述的促血管化的組織工程骨的體外構建方法，包括(1)體外制備用于組織構建的支架材料制備用于組織工程骨構建的支架材料，在將復合生長因子的部位預留多個孔隙；(2)組織工程骨的體外構建將體外大量擴增的相應種子細胞與支架材料復合，然后在體外靜態或動態培養一定時間，得到組織工程化骨組織；(3)生長因子的緩釋處理將促血管生成的生長因子復合入膠原凝膠中；(4)生長因子的嵌入將含有生長因子的多塊凝膠嵌入體外構建的組織工程化骨組織的預留孔隙中。
9.如權利要求8所述的促血管化的組織工程骨的體外構建方法，其特征在于所述的促血管生成的生長因子為血管內皮細胞生長因子，其在膠原凝膠中的含量為50～200μg/ml；或血管內皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子混合成的雙生長因子，其中血管內皮細胞生長因子在膠原凝膠中含量為50～200μg/ml，堿性成纖維細胞生長因子在膠原凝膠中的含量為10～100μg/ml。
10.如權利要求9所述的促血管化的組織工程骨的體外構建方法，其特征在于在所述的膠原凝膠中還含有400～2000U/ml的肝素。
全文摘要
本發明公開了一種新型的促血管化的組織工程骨，在體外構建的組織化工程骨上有多個孔隙，在孔隙內有嵌有膠原凝膠，在膠原凝膠中含有50～200μg/ml的血管內皮細胞生長因子、10～100μg/ml的堿性成纖維細胞生長因子、400～2000U/ml的肝素。這種體外構建的組織工程骨移植后在早期能夠促進移植物內和移植物周圍的血管生成，從而為骨再生創造有利條件，使骨愈合效果良好。
文檔編號A61L27/00GK1631455SQ200510002378
公開日2005年6月29日 申請日期2005年1月19日 優先權日2005年1月19日
發明者段小軍, 楊柳 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院