促進人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及未分化細胞的培養，具體是一種促進人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞 分化的方法。
【背景技術】
[0002] 由于軟骨細胞是終末分化細胞，自我修復的能力有限，因此，外傷或骨關節炎等疾 病所致的軟骨缺損的治療一直是骨科的難題。近年來，隨著細胞移植或軟骨組織工程技術 的發展，軟骨缺損的治療已取得了一定的進步。自體軟骨細胞移植是目前公認的治療關節 軟骨缺損的較有效的方法。但自體軟骨細胞移植也有很多缺點:①自體軟骨細胞來源困難。 由于自體軟骨細胞移植時先要從關節的非負重區取一定大小的軟骨塊，因此它必然導致供 區新的缺損。②操作過程較繁瑣，病人一定要承受兩次手術的創傷。③軟骨細胞在體外擴增 緩慢，容易發生去分化，即向成纖維細胞分化，從而使新生軟骨的性能不良。
[0003]間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是目前備受關注的一類具有高度自 我更新和多向分化潛能的干細胞，可以分化為中胚層起源的多種組織細胞，比如：成骨細 胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。MSC的多潛能性和旁分泌特性使其成為再生醫學理想的候選細 胞。近年來研究發現，MSC具有較低的免疫原性，還具有抑制免疫細胞的作用，在誘導移植耐 受方面發揮重要作用。MSCs具有細胞來源豐富，損傷輕，可避免體內免疫排斥反應及根據不 同需要進行調控等優點，因此，MSCs是組織工程的重要種子細胞。
[0004] 人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells， hUCMSCs)具有來源豐富、對供者無影響、易于采集和運輸、無異體排斥反應、避免倫理爭議 等諸多優點，因此hUCMSCs有望成為間充質干細胞的理想來源。
[0005] 牛磺酸（taurine，Tau)是一種含硫的氨基酸，化學名稱為β氨基乙磺酸，與其他氨 基酸一樣具有酸、堿兩性電解質作用，易溶于水，化學性質比較穩定。早在1827年，牛磺酸就 已被人們發現，并成功從牛膽汁中分離獲得，自此國內外對牛磺酸進行了深入的研究，發現 它具有廣泛的生物學效應。在哺乳動物組織中，蛋氨酸和半胱氨酸代謝的中間產物半胱亞 磺酸經半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)脫羧成亞牛磺酸，再氧化成牛磺酸。
[0006] 牛磺酸廣泛存在于動物體各組織器官內，是機體含量最豐富的游離氨基酸之一。 許多高等動物已失去了合成足夠的牛磺酸以維持體內牛磺酸整體水平的能力，需要從膳食 中攝取。機體缺乏牛磺酸會引起許多疾病，如心肌病、腎臟機能障礙等牛磺酸對機體的發育 起著重要作用，并且牛磺酸對應激引起的神經元損傷及其他病理疾病具有防護作用，牛磺 酸具有細胞保護作用，并能抑制細胞凋亡。以往的研究發現，敲除牛磺酸轉運體(TauT)基因 的小鼠出現細胞變性，并且存在先天性線粒體缺陷、先天性心肌發育缺陷和先天性骨骼肌 發育缺陷，說明牛磺酸對正常發育起著十分重要的作用。
[0007] MSCs體外轉化很大程度上依賴于培養條件，尋找合適的培養條件是誘導MSCs向軟 骨細胞分化的關鍵。目前的MSCs分化成軟骨細胞的方法所需的周期都較長，并且誘導后Π 型膠原的表達效率較低。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的技術問題是，提供一種促使用安全，能夠提高人臍帶間充質干 細胞向軟骨細胞分化的能力的促進人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法。
[0009] 為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種促進人臍帶間充質干細 胞向軟骨細胞分化的方法，包括以下步驟：
[0010] (1)人臍帶間充質干細胞的培養:將廢棄的人臍帶組織剪碎，用質量體積比濃度 0.1 %的二型膠原酶消化成單個的細胞，離心；用間充質干細胞完全培養液重懸細胞，過篩， 收集細胞懸液，于37°c、體積分數為5%0) 2和95%空氣、絕對濕度條件下進行培養，每隔1天 換培養液，得高純度的臍帶間充質干細胞；
[0011] (2)向軟骨細胞誘導分化:將培養至第3代的臍帶間充質干細胞收集并離心，用間 充質干細胞完全培養液重懸細胞接種到底面積為25cm 2培養瓶中，細胞完全鋪滿瓶底后，培 養液更換為軟骨細胞誘導液進行向軟骨細胞的分化，細胞分化第1天開始加入O.l-lOmM牛 磺酸，共培養16天即得分化的軟骨細胞。
[0012]所述步驟⑵中細胞分化第1天開始加入O.HOmM牛磺酸，每星期換液2次，共培養 16天即得分化的軟骨細胞。
[0013] 優選，細胞分化第1天開始加入5mM牛磺酸。
[0014] 本發明的有益效果是:添加的牛磺酸是人體所需的，使用安全;能夠提高人臍帶間 充質干細胞向軟骨細胞分化的能力。
【附圖說明】
[0015]圖1是培養p〇代和p3代人臍帶間充質干細胞光鏡圖（放大40倍，其中，A為原代培養 P〇代第4天的細胞生長狀況，B為原代培養P〇代第8天的細胞生長狀況，C為培養P3代時的細胞 生長狀況）；
[0016] 圖2A為傳代培養MSCs的CD34、CD45、CD73和CD105表達率柱狀圖；
[0017] 圖2B為MSCs的CD34表達率圖；
[0018] 圖2C為MSCs的CD45表達率圖；
[0019] 圖2D為MSCs的CD73表達率圖；
[0020] 圖2E為MSCs的CD105表達率圖；
[0021]圖3A是本發明實施人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的光鏡圖（向軟骨分化7 天h
[0022]圖3B是本發明實施例人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的光鏡圖（向軟骨細胞 分化14天）；
[0023]圖4A是本發明實施例P3代的MSCs和向軟骨誘導分化16天的細胞的Real-Time PCR 檢測Π 型膠原表達水平圖；
[0024]圖4B是本發明實施例加入不同濃度牛磺酸向軟骨誘導分化16天的細胞的Real-Time PCR檢測Π 型膠原表達水平圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明：
[0026] 本發明的促進人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，包括以下步驟：
[0027] (1)人臍帶間充質干細胞的培養:將廢棄的人臍帶組織剪碎，用質量體積比濃度 0.1 %的二型膠原酶消化成單個的細胞，離心；用間充質干細胞完全培養液重懸細胞，過篩， 收集細胞懸液，于37°C、體積分數為5%0) 2和95%空氣、絕對濕度條件下進行培養，每隔1天 換培養液，得高純度的臍帶間充質干細胞；
[0028] (2)向軟骨細胞誘導分化:將培養至第3代的臍帶間充質干細胞收集并離心，用間 充質干細胞完全培養液重懸細胞接種到底面積為25cm 2培養瓶中，細胞完全鋪滿瓶底后，培 養液更換為軟骨細胞誘導液進行向軟骨細胞的分化，細胞分化第1天開始加入O.l-lOmM牛 磺酸，共培養16天即得分化的軟骨細胞。
[0029] 所述步驟(2)中細胞分化第1天開始加入O.l-lOmM牛磺酸，每星期換液2次，共培養 16天即得分化的軟骨細胞。
[0030] 優選，細胞分化第1天開始加入5mM牛磺酸。
[0031] 實施例
[0032] 一、人臍帶間充質干細胞的培養，具體步驟如下：
[0033]將新獲得的廢棄的人臍帶組織剪碎，用無菌的PBS平衡液充分洗滌殘留的血液，縱 向剪開臍帶，暴露出2條動脈和1條靜脈，鈍性分離，仔細剔除出這3條血管和臍帶外膜，剝離 Wharton膠，并將其剪碎成小組織塊；用質量體積比濃度0.1 %的Π 型膠原酶，37 °C消化3小 時，消化成單細胞，2000r/min離心20分鐘，棄上清，用DMEM培養液重懸細胞，1500r/min離心 10分鐘；用間充質干細胞完全培養液重懸細胞，過100目篩，收集細胞濾液，置75cm 2培養瓶 中，于37°C、體積分數為5^^02和95%空氣、絕對濕度條件下進行培養。每隔1天換1次培養 液，得高純度的人臍帶間充質干細胞(HUC-MSCs)。
[0034]選用傳代培養的細胞只需要一次原代培養，而在傳代的過程中產生大量的所需要 的MSCs，從而能有效的避免對原代培養細胞來源的限制。
[0035]傳代培養MSCs的獲取:將上述長到80 %-90 %融合的原代培養MSCs消化并進行傳 代培養，消化液組成為0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二鈉。如在37°C、體積分數為 5 % C0