專利名稱：一種蛋白質及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于預防和治療膿毒癥的蛋白質，具體地說是一種同活化C蛋白功能相似的用于預防和治療膿毒癥的蛋白。
背景技術：
膿毒癥是嚴重創傷、燒傷、休克、大手術后常見的并發癥，是導致人類死亡的一常見病種，它有極高的發病率和死亡率。(Alerti C，Brun-Buission C，Burchardi H，etal.Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentercohort study[J].Intensive Care Med，2002，28(2)108-121.)膿毒癥是指由感染或者有高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應綜合癥，其病原菌包括細菌、真菌、寄生蟲及病毒等，臨床癥狀包括但不限于(1)體溫＞38℃或＜36℃；(2)心率＞90次/分鐘；呼吸＞20次/分鐘或PaCO2＜32mm Hg；(4)外周血白細胞計數＞12×109/L，＜4×109/L或成熟粒細胞＞10％；(5)器官功能障礙，高灌注或高血壓。(王正國.膿毒癥研究概況[J].中華創傷雜志，2003，19(1)5-7.)自20世紀80年代以來，隨著對膿毒癥發病機制研究的深入，開發各種旨在抑制膿毒癥形成的藥物也隨即興起，并進行了80多項臨床試驗，其中幾個有希望的藥物進行了III期臨床試驗，但是遺憾的是僅有一個藥物(活化C蛋白)被開發成功。(PoldermanKH and Girbes ARJ.Drug intervention trials in sepsisdivergent results[J].Lancet，2004，3631721-1723.)。活化C蛋白(商品名為Xigris)的開發成功為新的治療嚴重膿毒癥藥物的開發提供了借鑒，特別是在天然產物中尋找同其功能相似的物質，在此稱為活化C蛋白樣酶(activated protein C like enzyme)。由于在靜脈血栓病人中約有64％的患者對活化C蛋白是抗性的，所以這部分病人患膿毒癥后再用Xigris治療肯定是無效的，而活化C蛋白樣物質就可以彌補Xigris的不足。另外，Xigris的生產過程復雜，生產成本較高，每個病人一個療程的費用約為6800美元，如此高的價格限制了它在臨床上的廣泛應用。以上這些原因使得活化C蛋白樣酶的尋找和開發有著非常重要的經濟和社會意義。(，馮軍，趙文杰.活化C蛋白[J].國外醫藥——合成藥、生化藥、制劑藥分冊，2002，23(6)348～351.)我國有著豐富的蛇毒資源，在世界各地分布的500多種毒蛇，在我國就有150多種。蛇毒是一種混合物，它含有許多種類具有不同生物活性的蛋白質，其中很多蛋白質作用于人血液系統的成分。(Markland FS.Snake venoms and the hemostatic system[J]Toxicon，1998，36(12)1749～1800.)但是，至今沒有發現利用蛇毒單一組分進行預防和治療膿毒癥的報道。
基于活化C蛋白被成功開發為治療嚴重膿毒癥藥物和蛇毒中存在多種作用于血液系統的組分，有必要提出從蛇毒中尋找活化C蛋白樣酶，進行治療膿毒癥創新藥物的開發。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供一種用于預防和治療膿毒癥的蛋白質，以克服現有技術的不足。
本發明需要解決的另一個技術問題是提供這種蛋白在制備治療膿毒癥的藥物中的應用。
本發明公開了一種蛋白質，是由124個氨基酸殘基組成的活化C蛋白樣酶，在體外它既能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又能水解活化C蛋白特異顯色肽底物，在體內它能顯著降低膿毒癥試驗動物的死亡率。上述活化C蛋白樣酶可以是從天然產物提取的也可以是用基因工程手段制備的重組活化C蛋白樣酶。上述活化C蛋白樣酶的分子量在15.3kD(±5000kD)。上述活化C蛋白樣酶的一級結構如附圖4所示的氨基酸序列組成。其氨基酸序列如SEQ ID NO1Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys5 10 15Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp20 25 30Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe35 40 45Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys50 55 60Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys65 70 75Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg80 85 90Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp95 100 105
Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu110 115 120Ser Glu Pro Cys這種預防和治療膿毒癥的蛋白質來源于蝮蛇毒(Agkistrodon halys venom)，但不限于蛇毒。
本發明還公開了該蛋白的制備方法，該方法包括如下步驟(1)蛇毒溶于起始緩沖液即Tris-HCl緩沖液中，4℃透析過夜，然后取出，離心，離心條件為4℃，10000g，30min，取上清；(2)用SOURCE 30Q作為層析介質進行陰離子交換層析分離蛇毒，陰離子層析的柱體積為30ml，流速為5ml/min；用起始緩沖液平衡5倍柱體積；上樣量為10ml；先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B)，B從0～100％，洗脫20倍CV；取峰5中的收集液；(3)用截留分子量為3000的醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析，層析介質為Superdex 75pre grade，凝膠過濾層析柱體積為150ml；流速為0.5ml/min；PBS緩沖液平衡1倍柱體積；上樣量為2ml；PBS緩沖液洗脫1.5倍柱體積；取峰2中的收集液。
本發明活化C蛋白樣酶的制備方法中最優選地原料使用蝮蛇毒(Agkistrodonhalys)，陰離子交換層析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生產的SOURCE30Q，凝膠過濾層析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生產的Superdex 75pregrade。
陰離子交換層析得到的6個蝮蛇毒組分峰進行水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定，結果表明僅有峰5組分具有明顯的水解L PefachromePCa3297的能力。
分別對陰離子交換層析得到的6個蝮蛇毒組分峰進行水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定，結果表明僅有峰5組分具有明顯的水解L PefachromePCa3297的能力陰離子交換分離層析分離到的峰5經凝膠過濾層析后，結果得到2個組分峰，分別對這2個組分峰進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間和水解顯色肽試驗測定，試驗結果表明峰2中的各管收集液既能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又具有較強的水解顯色肽的能力，這表明峰2中的組分是活化C蛋白樣酶。
進行SDS-PAGE，其中分離膠的濃度為12.5％，濃縮膠的濃度為4％，對得到的活化C蛋白樣酶進行純度檢測和分子量測定。SDS-PAGE結果為單一條帶，見附圖3。以低分子量標準蛋白質的遷移率(Rf)為橫坐標，低分子量標準蛋白質的對數值為縱坐標進行回歸計算，得出APCL的分子量為15.3kD。
序列測定表明活化C蛋白樣酶是由124個氨基酸組成，序列組成見序列表。
活化C蛋白樣酶對正常小鼠的毒性測定，試驗結果表明在72h內，在任何一個劑量組均沒有觀察到小鼠的死亡，同時也沒有觀察到小鼠的外觀體征和行為活動發生異常的變化，因此可以確定APCL對小鼠的LD50低于400mg/kg bwt。
活化C蛋白樣酶對膿毒癥實驗小鼠的作用，小鼠注射脂多糖24h后，開始觀察到有小鼠的死亡，繼續觀察至72h。活化C蛋白樣酶能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率，低劑量組降低20％，中劑量組降低65％，高劑量組降低70％。
本發明中蛇毒來源的蛋白質，即活化C蛋白樣酶的用途是用于制備預防和治療膿毒癥的藥物。
本發明中蛇毒來源的蛋白質的制備方法同活化C蛋白相比，具有來源方便，生產簡單易行，成本低等優點。
圖1為陰離子交換層析圖譜。
圖2為凝膠過濾層析圖譜。
圖3為活化C蛋白樣酶的SDS-PAGE檢測圖譜。
具體實施例方式
實施例1 陰離子交換層析分離蝮蛇毒稱取0.5g蝮蛇毒，溶于10ml 0.05mol/L，pH7.6的Tris-HCl緩沖液(起始緩沖液)中，對該緩沖液透析過夜(4℃)，然后取出，離心(4℃，10000g，30min)，棄沉淀，收集上清，進行陰離子交換層析，層析條件如下層析介質SOURCE 30Q；柱體積30ml；流速5ml/min；柱平衡用起始緩沖液平衡5倍柱體積；上樣量10ml；洗脫先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B)，B從0～100％，洗脫20倍CV；收集8.0ml/管。
采用SOURCE 30Q陰離子交換層析介質對蝮蛇毒進行分離，得到了6個組分，具體結果見附圖1和表1。
表1 陰離子交換層析各組分峰的積分結果
實施例2 延長人血漿活化部分凝血活酶時間的測定取凝血活酶(白陶土-腦磷脂)混懸液0.1ml，加正常人混合新鮮血漿0.1ml，對照組加生理鹽水0.1ml，混勻，37℃水浴孵育5min，加入0.025mol/L氯化鈣溶液0.1ml，立即開動秒表，記錄凝血時間，試驗組除用蝮蛇毒分離液代替生理鹽水外，其它與對照組相同。[參見，王鴻利.血栓與止血檢驗技術，第一版[M]，上海上海科學技術出版社，1992，66-67.]分別對陰離子交換層析得到的6個蝮蛇毒組分峰進行測定，結果表明峰5組分具有明顯的延長活化部分凝血活酶時間，其中一管收集液可比對照的時間延長10倍，而其它5個組分峰僅有較弱的延長活化部分凝血活酶時間的能力。
實施例3 水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定取4μmol/L PefachromePCa3297(活化C蛋白特異顯色肽，購自瑞典Pentapharm公司)0.2ml，加pH8.4的0.05mol/L Tris-咪唑緩沖液1.65ml，再加入不同的蝮蛇毒分離液0.2ml，混勻，在405nm測吸收值的變化(測定3min)。參比溶液為用0.2ml水溶液替換蛇毒溶液的上述溶液組成。[參見，Martinoli JL，Stocker K.Fast functionalprotein C assay using Protac，a novel protein C activator[J].Thromb Res，1986，43(3)253～264.]分別對陰離子交換層析得到的6個蝮蛇毒組分峰進行測定，結果表明僅有峰5組分具有明顯的水解L PefachromePCa3297的能力。
實施例4 凝膠過濾層析純化活化C蛋白樣酶合并經陰離子交換分離層析分離到的峰5中的各管收集液，用截留分子量為3000的醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過濾層析。層析條件如下層析介質Superdex 75pre grade；柱體積150ml；流速0.5ml/min；柱平衡PBS緩沖液(0.15mol/L NaCl，0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0)平衡1倍柱體積；上樣量2ml；洗脫PBS緩沖液洗脫1.5倍柱體積；收集3ml/管。
層析結果陰離子交換分離層析分離到的峰5經凝膠過濾層析后，結果得到2個組分峰，具體結果見附圖2和表2。
表2 凝膠過濾層析各組分峰的積分結果
分別對這2個組分峰進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間和水解顯色肽試驗測定，試驗結果表明峰2中的各管收集液既能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又具有較強的水解顯色肽的能力，這表明峰2中的組分是活化C蛋白樣酶。
實施例5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析活化C蛋白樣酶按照文獻[參見，李建武，余瑞元，袁明秀等.生物化學實驗原理和方法[M].北京北京大學出版社，1997，174～176.]進行SDS-PAGE，其中分離膠的濃度為12.5％，濃縮膠的濃度為4％，對得到的活化C蛋白樣酶進行純度檢測和分子量測定。
SDS-PAGE結果為單一條帶，見附圖3。以低分子量標準蛋白質的遷移率(Rf)為橫坐標，低分子量標準蛋白質的對數值為縱坐標進行回歸計算，得出APCL的分子量為15.3kD。圖中，M為標準蛋白分子；1號為活化C蛋白樣酶。
實施例6 活化C蛋白樣酶的氨基酸組成序列測定序列測定表明活化C蛋白樣酶是由124個氨基酸組成，序列組成見序列表。
實施例7 活化C蛋白樣酶對膿毒癥實驗動物的作用(1)脂多糖對小鼠LD100的測定取18～22g小鼠30只，每10只分為一組，雌雄各半，分別以2mg/kg bwt(體重)、10mg/kg bwt和50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射脂多糖(E.coli 055B5，購自Sigma公司)溶液，注射速度為0.5ml/min，在72h內觀察各組小鼠的死亡情況。
小鼠被注射脂多糖24h后，開始觀察到有小鼠的死亡，繼續觀察至72h。具體各組小鼠的死亡情況見表3。從表中可看出小鼠對脂多糖的敏感性較低，只有當脂多糖的劑量達到50mg/kg bwt時，其致死率才達到100％，因此確定本試驗所測定的脂多糖對小鼠LD100為50mg/kg bwt，該劑量約相當于每只小鼠注射1.0mg的脂多糖。
表3 LPS對小鼠LD100的測定結果
(2)活化C蛋白樣酶對正常小鼠的毒性測定取18～22g小鼠24只，每6只分為一組，雌雄各半，分別以4mg/kg bwt、40mg/kgbwt、100mg/kg bwt和400mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射APCL溶液，注射速度為0.5ml/min，在72h內觀察各組小鼠的死亡情況。
試驗結果表明在72h內，在任何一個劑量組均沒有觀察到小鼠的死亡，同時也沒有觀察到小鼠的外觀體征和行為活動發生異常的變化，因此可以確定APCL對小鼠的LD50低于400mg/kg bwt。
(3)活化C蛋白樣酶對膿毒癥實驗小鼠的作用取18～22g小鼠80只，每20只分為一組，雌雄各半，分成四組。第一組以50mg/kgbwt的劑量尾靜脈注射脂多糖溶液；第二組先以2mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的活化C蛋白樣酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液；第三組先以4mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的活化C蛋白樣酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液；第四組先以8mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的活化C蛋白樣酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液注射速度均為0.5ml/min，在72h內觀察各組小鼠的死亡情況，計算死亡率。
小鼠注射脂多糖24h后，開始觀察到有小鼠的死亡，繼續觀察至72h。各組小鼠的死亡情況見表4。從表中可看出活化C蛋白樣酶能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率，低劑量組降低20％，中劑量組降低65％，高劑量組降低70％。
表4 活化蛋白C樣酶降低膿毒癥小鼠死亡率的試驗結果
實施例8在實施例7下“用活化C蛋白樣酶對膿毒癥實驗小鼠的作用”中以先注射脂多糖，再注射活化C蛋白樣酶做替換，也得到了相類似的試驗結果。
序列表<110>上海醫藥工業研究院<120>一種蛋白質及其用途<130>SPI058153<160>1<170>Patent In Version2.1<210>1<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>1Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys5 10 15Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp20 25 30Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe35 40 45Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys50 55 60Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys65 70 75Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg80 85 90Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp95 100 105Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu110 115 120Ser Glu Pro Cys
權利要求
1.一種蛋白質，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.根據權利要求1所述的蛋白在制備預防和治療膿毒癥的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種來源于蛇毒的同活化C蛋白功能相似的蛋白質，用于膿毒癥的預防和治療。本發明還公開了該蛋白的制備方法，可采用陰離子交換和凝膠過濾相結合的層析技術從蛇毒中分離純化。本發明公開的蛋白可應用于制備預防和治療膿毒癥的藥物，同活化C蛋白相比，具有來源方便，生產簡單易行，成本低等優點，有著非常重要的經濟和社會意義。
文檔編號A61P17/02GK1847262SQ20051002505
公開日2006年10月18日 申請日期2005年4月13日 優先權日2005年4月13日
發明者馮軍, 趙文杰, 朱寶泉 申請人:上海醫藥工業研究院