專利名稱：蛋白質nmb1125及其在藥物制劑中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，具體地涉及開發預防性或治療性應用的新疫苗制劑，其可以提高抗不同來源的疾病抗原的免疫應答的質量。
唯一已知宿主是人的革蘭氏陰性雙球菌腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是腦膜炎球菌性腦膜炎的致病因子。通常在正常人群的無癥狀攜帶者(是其微生物分離的最常見的來源的生態位)中發現這種細菌。
就全世界而言，2歲以下的兒童是接觸性腦膜炎球菌性腦膜炎的最易感人群，但是年輕的成年人以及正常的成年人群體也可能被感染。
未治療的腦膜炎球菌病對大多數被感染的個體具有致死過程，免疫接種通過早在細菌的定殖階段停止所述事件而可能預防這種情形。
已經發展了幾種策略旨在獲得能夠滿足在普通人群中誘導抗這種疾病的保護性所需的條件的疫苗。為此，已經考慮了莢膜抗原，因為它們的免疫特異性能將這種微生物分類為血清群。這些血清群中的5種被確定為導致了全世界的大多數的腦膜炎球菌病的臨床病例。血清群A是在亞撒哈拉非洲中流行病的主要原因。在大多數情況下血清群B和C與發達國家中的發病有關。血清群Y和W135在大多數的該疾病的復發病例中常見，并且它們在美國的一些地區中比較普遍，在最近幾年中有明顯的增加。從這些數據來看，將莢膜多糖作為疫苗候選物進行使用、研究和評估是顯而易見的。一種基于莢膜多糖的抗血清群A、C、Y和W-135的四價疫苗在美國已經獲得許可。免疫接種后產生的抗體是血清群特異的(Rosenstein N.等人，2001.Meningococcaldisease.N.Engl.J.Med，344，1378-1388)。
血清群B與其他血清群不同，也是地方性和流行性腦膜炎球菌病的主要病因，這主要是因為根本沒有對其的有效疫苗。已經注意到莢膜多糖B是弱免疫原性的，加之因為該化合物在結構上類似于人神經系統胎兒結構存在的寡糖鏈，因而存在基于該化合物的疫苗有誘導免疫耐受和自身免疫的理論危險。(Finne J.等人，1987.An IgGmonoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts withdevelopmentally regulated polysialic acid units ofglycoproteins in neural and extraneural tisues.J.Immunol，1384402-4407)。因此，針對血清群B的疫苗的開發集中于使用亞莢膜(sub-capsular)抗原。
外膜蛋白和泡囊(vesicle)疫苗在70年代，基于外膜蛋白制備疫苗的最初嘗試基于通過去污劑去除LPS的外膜蛋白制劑(Frasch CE和Robbins JD.1978.Protectionagainst group B meningococcal disease.III.Immunogenicity ofserotype 2 vaccines and specificity of protection in a guineapig model.J Exp Med 147(3)629-44)。然后沉淀外膜蛋白OMP以制備懸浮于氯化鈉中的聚集體。盡管在動物研究中獲得了有希望的結果，但是這些疫苗不能在成人和兒童中誘導殺菌性抗體(Zollinger WD等，1978.Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidistype 2 protein vaccine in animals and humans.J.Infect.Dis.137(6)728-39)，這些疫苗較差的表現主要是由于沉淀導致的四級結構的喪失。因此，下一個合理的步驟是制備具有呈現天然構象的外膜蛋白泡囊形式的蛋白的疫苗(Zollinger WD等，1979.complex ofmeningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membraneprotein immunogenic in man.J.Clin.Invest.63(5)836-48，WangLY和Frasch CE.1984.Development of a Neisseria meningitidisgroup B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mousemodel.Infect Immun.46(2)408-14136)。
這些外膜泡囊疫苗的免疫原性明顯比OMP聚集體的免疫原性高，并且該免疫原性通過吸附氫氧化鋁佐劑而進一步加強(Wang LY和Frasch CE.1984.Neisseria meningitidis group B serotype 2bprotein vaccine and evaluation in a mouse model.Infect Immun.46(2)408-14136)。
使用可溶性外膜泡囊疫苗的不同制劑進行了許多功效實驗。分別應對在古巴(Sierra GV等人，1991.Vaccine against group BNeisseria meningitidisprotection trial and mass vaccinationresults in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)195-210)和挪威(Bjune G等人，1991.Effect of outer membrane vesicle vaccine againstgroup B meningococcal disease in Norway.Lancet.338(8775)1093-6)的疾病爆發，在20世紀80年代開發了兩種最廣泛研究的疫苗。由古巴Finlay學院制備的OMV疫苗(商業名為VA-MENGOC-BC)是由具有血清群C多糖的株系B4P1.19，15和高分子量OMP制劑制備的，并吸附氫氧化鋁(Sierra GV等人，1991.Vaccineagainst group B Neisseria meningitidisprotection trial andmass vaccination results in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)195-210)。該疫苗導致古巴流行病的快速下降(Rodriguez AP等人，Theepidemiological impact of antimeningococcal B vaccination inCuba.1999.Mem Inst Oswaldo Cruz.94(4)433-40)。
由Norwegian National Institute for Public Health(NIPH)制備的疫苗同樣最初想在另一種來自ET-5克隆(B15P1.7，16)的生物體引起的高度地方性疾病期間使用。其也是一種單價疫苗，由吸附于氫氧化鋁的純化的外膜泡囊制備(Bjune G等，1991.Effect ofouter membrane vesicle vaccine against group B meningococcaldisease in Norway.Lancet.338(8775)1093-6)。
外膜泡囊疫苗有效地使外膜蛋白呈現充分天然的構象以允許功能性殺菌抗體的產生，至少在十幾歲的青少年和成人中。也已經顯示產生的抗體應答增加了腦膜炎球菌的調理吞噬作用。疫苗的精確配方(即OMP含量、LPS含量和佐劑的存在與否)對免疫原性具有明顯的影響(Lehmann AK等，1991.Immunization against serogroup Bmeningococci.Opsonin response in vaccinees as measured bychemiluminescence.APMIS.99(8)769-72，Gomez JA等，1998.Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activityof antibodies against the transferrin-binding proteins ofNeisseria meningitidis.Vaccine.16(17)1633-9，Steeghs L等，1999.Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in aLipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidisInfluence of Adjuvants on the Immune Response.Infect Immun.67(10)4988-93)。
疾病分離物的抗原性特性譜也變化很快，因此只作用有限數量的選擇株系的疫苗在幾年以后就可能變得無效，除非根據地方流行病學改變疫苗的組成。
目前，OMV疫苗比其他任何血清群B的疫苗的應用都廣泛，并且在單一PorA型導致的疾病的爆發中非常有用。
在株系間產生交叉反應性的免疫原仍需充分地說明。來自Finlay學院和NIPH疫苗實驗的接種后血清研究表明針對PorA(P1，1類血清亞型蛋白)和OpcA(另一種主要OMP，以前稱為Opc)二者的抗體(WedegeE，等人，1998.Immune Responses against Major Outer MembraneAntigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and ControlsWho Contracted Meningococcal Disease during the NorwegianSerogroup B Protection Trial.Infect Immun.66(7)3223-31)對介導血清殺菌活性都非常重要(PorA免疫原性最大)，兩種抗原都顯示顯著的株系與株系的差異性。
PorA蛋白的顯著性和該蛋白的顯著水平的差異性在疾病爆發間期和期間其表位都持續發生變異(Jelfs J等人，2000.SequenceVariation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidisduring Epidemic Spread.Clin Diagn Lab Immunol.7(3)390-5)(其中接種后(疾病后)的大多數殺菌活性都是針對所述表位的)，這增加了基于單一菌株(單價)OMV的疫苗可能是血清亞型限制性的(即依賴PorA型)的擔心。
為了克服這些潛在的問題，在荷蘭的RIVM開發了一種OMV疫苗，其含有來自六種不同流行的病原性分離株的PorA蛋白(van Der Ley P和Poolman JT.1992.Construction of a multivalentmeningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membraneprotein.Infect Immun.60(8)3156-61，Claassen I等，1996.Production，characterization and control of a Neisseriameningitidis hexavalent class 1 outer membrane proteincontaining vesicle vaccine.Vaccine.14(10)1001-8)。在該情形中，從兩種很好表征的H44/76株系的變體中分離了疫苗泡囊，所述的H44/76株系已經遺傳改造以表達三種單獨的PorA蛋白。
通用抗原的研究顯然，外膜蛋白(OMP)能夠誘導抗血清群B疾病的功能性免疫應答，但是至今沒有開發出一種疫苗可以具有通用的保護性，因為外膜蛋白的表面暴露區域具有很大的異質性。外膜泡囊(OMV)疫苗誘導的適度的交叉免疫刺激了對外膜抗原(或抗原組)的研究，所述的外膜抗原誘導功能性抗體并存在于所有的腦膜炎球菌株系上。這些抗原，如果它們存在于無論什么血清群的所有株系上，則可能形成真正通用的腦膜炎球菌疫苗的基礎，這可能會消除多糖接種后病原性株系上莢膜轉變的潛在問題。
一旦該免疫顯性PorA蛋白的變異性限制其作為通用疫苗的應用變得明顯，則可以考慮許多其他主要的外膜蛋白的疫苗潛力，并且其中的幾種正在進一步的開發中。那些已經被考慮的外膜蛋白包括第5類蛋白(OpcA)，NspA和鐵調節的蛋白(TbpA和B，FbpA，FetA)。TbpB與TbpA形成轉鐵蛋白結合復合物的一部分。最近的工作表明TbpA不但在鐵結合中具有重要作用(Pintor M等人，1998.Analysis of TbpAand TbpB functionality in defective mutants of Neisseriameningitidis.J Med Microbiol 47(9)757-60，而且是比TbpB更有效的免疫原。
已經使用來自不同腦膜炎球菌株系的外膜蛋白制劑的組合免疫小鼠通過新技術發現了一種高度保守的小的外膜蛋白(Martin D等人，1997.Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface ProteinConfers Protection against Experimental Infection.J Exp Med185(7)1173-83)。使用來自小鼠的B細胞產生雜交瘤，然后篩選其針對多腦膜炎球菌株系的交叉反應性。發現一種高度交叉反應性的單克隆抗體結合22kDa的外膜蛋白，其被稱為NspA。用重組NspA蛋白的免疫顯示在小鼠中誘導了針對來自血清群A-C的株系的交叉反應性殺菌應答。疫苗接種也保護了小鼠抗致死性腦膜炎球菌感染(Martin D等，1997.Highly Conserved Neisseria meningitidisSurface Protein Confers Protection against ExperimentalInfection.J Exp Med 185(7)1173-83)。在遺傳不同的腦膜炎球菌株系間的NspA序列的比較表明該蛋白是高度保守的(97％的同源性)(Cadieux N等人，1999.Bactericidal and Cross-ProtectiveActivities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseriameningitidis NspA Outer Membrane Protein.Infect Immun 67(9)4955-9)。
使用抗NspA的單克隆抗體通過ELISA在99.2％的來自血清群A-C的測試株系上檢測到NspA的存在(Martin D等人，1997.HighlyConserved Neisseria meningitidis Surface Protein ConfersProtection against Experimental Infection.J Exp Med 185(7)1173-83)。這些單克隆抗體顯示對許多腦膜炎球菌株系具有殺菌活性，并且能夠降低小鼠模型中的腦膜炎球菌菌血癥(Cadieux N等人，1999.Bactericidal and Cross-Protective Activities of a MonoclonalAntibody Directed against Neisseria meningitidis NspA OuterMembrane Protein.Infect Immun 67(9)4955-9)。盡管該數據表明NspA是一種有希望的能夠在跨血清群界限進行保護的疫苗候選物，但是來自小鼠的多克隆抗重組NspA血清不結合大約35％的病原性血清群B腦膜炎球菌株系的表面，盡管在這些生物體中存在nspA基因(Moe GR等，1999.Differences in Surface Expression ofNspA among Neisseria meningitidis Group B Strains.Infect Immun67(11)5664-75)。
抗原呈遞和疫苗制劑早前的工作表明抗原呈遞的形式可能比較關鍵。膜結合蛋白上的表位通常依賴于正確的三級結構的維持，這反過來又經常依賴疏水性膜結合結構域。已經顯示外膜蛋白制劑只有呈現泡囊形式時才在人體中引發免疫性(Zollinger WD等人，1979.complex of meningococcalgroup B polysaccharide and type 2 outer membrane proteinimmunogenic in man.J Clin Invest 63(5)836-48，Zollinger WD等人，1978.Safety and immunogenicity of a Neisseriameningitidis type 2 protein vaccine in animals and humans.JInfect Dis 137(6)728-39)。
單蛋白疫苗已經在本領域中使用了幾十年，并通常表現較好的穩定性。如果需要以泡囊的形式呈現，以使抗原保持膜結合，穩定性和再現性可能難保證。外膜泡囊的免疫原性和反應原性可能隨著蛋白量以及純化過程中LPS的去除的變化而變化。但是在OMV疫苗制備中產生了泡囊制備的實際經驗，對目前制備的疫苗進行質量控制。構建完全合成的脂質體泡囊可允許進一步優化和標準化這些疫苗(Christodoulides M等人，1998.Immunization with recombinantclass 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidisinfluence of liposomes and adjuvants on antibody avidity，recognition of native protein and the induction of abactericidal immune response against meningococci.Microbiology 144(Pt 11)3027-37)。換句話講，外膜蛋白已經以泡囊和純的表達蛋白呈現，并且抗體應答的產生是適度的。至今主要努力集中在腦膜炎球菌疫苗的肌內注射，導致產生全身IgG。但是，在腦膜炎球菌疾病中，如果宿主的侵入是通過鼻上皮，那么分泌性IgA的產生可能也是重要的。
腦膜炎奈瑟氏球菌的基因組序列在2000年描述和公開了MC58(血清群B腦膜炎球菌)的基因組序列(Tettelin H等人，2000.complete Genome Sequence ofNeisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58.Science 287(5459)1809-15172)以及Z2491(血清群A菌株)的基因組序列(Parkhill J等人，2000.complete DNA sequence of a serogroup Astrain of Neisseria meningitidis Z2491.Nature 404(6777)502-6173)。所述基因序列的獲得對腦膜炎球菌疫苗的研究產生了重大的影響。而MC58基因組測序取得了進展，Pizza等人開始簽定了被描述編碼膜結合蛋白、表面暴露蛋白和輸出蛋白的開放閱讀框。他們鑒定了570種這樣的ORF，通過聚合酶鏈反應對他們進行了擴增，并將他們克隆進大腸桿菌中以允許編碼的蛋白以帶His標簽或谷胱苷肽S轉移酶融合蛋白形式表達(Pizza M等人，2000.Identificationof Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus byWhole-Genome Sequencing.Science 287(5459)1816-20)。61％(350)的所選擇的ORF被成功表達，那些不能表達的ORF通常含有一個以上疏水跨膜結構域(可能排除了大量外膜結合蛋白)。純化了重組蛋白并用于接種小鼠。通過酶聯免疫吸附(ELISA)測定和流式細胞術測定了免疫血清對多種腦膜炎球菌株系的表面結合，使用血清殺菌測定評價了免疫血清的對兩種株系的殺菌活性。基于在所有三種測定中的陽性應答最后選擇了7種蛋白用于進一步研究。使用多種這些蛋白的實驗疫苗制劑組合佐劑顯示誘導了明顯的針對小鼠中同源腦膜炎球菌株系(MC58)的殺菌滴度，但是沒有一種蛋白誘導SBA的滴度和MC 58外膜泡囊疫苗一樣高(Giuliani MM等人，2000.Proceedings12th IPNC.p.22)。另一方面，有一些證據表明這些蛋白的組合可能在小鼠顯示高于單一蛋白的免疫原性(Santini L等人，2000.Proceedings 12th IPNC.p.25)。在該研究中排除的大量開放閱讀框(可能通過不能蛋白質表達或他們的免疫學特性的修飾)可能也具有疫苗潛力并需要進一步研究。
一旦了解了各個抗原對腦膜炎奈瑟氏球菌的發病機理的作用，就可能比較有效地選擇疫苗組分。抗原本身可以稱為有效的疫苗候選物，或者減毒的突變體可能作為疫苗成分。
在這一指導下，使用在幾種病原性微生物中序列高度保守的疫苗候選物可能提供對它們引起的多種疾病的解決方案，如果這些候選物通過免疫系統作用誘導方便的應答。
本發明的技術目的是開發能夠增強和/或擴寬針對不同病原體或廣泛的各個病原體變體的免疫應答的疫苗制劑，所述的病原體為癌癥、細菌、病毒或任何其他來源的。
發明描述在本發明的工作目的中，首次報道了使用NMB 1125蛋白作為疫苗制劑的組分，所述的疫苗制劑具有抗腦膜炎球菌疾病或任何由奈瑟氏菌屬的成員引起的任何感染的治療或預防特性。
本發明的新特征在于以前未曾報道的NMB1125蛋白在具有新特性的制劑中的應用，所述的制劑能夠誘導廣譜保護作用的全身或粘膜免疫應答，這是由于該蛋白在腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的不同分離株中的保守特性。
附圖簡述
圖1.在克隆和表達蛋白NMB1125中使用的克隆載體pM100。pTrip，色氨酸啟動子；N-term P64k，P-64k N末端片段；T4終止子，T4噬菌體轉錄終止子。
圖2.在pM100載體中的基因NMB1125的核苷酸序列的最終結構。
圖3.細胞破碎獲得的部分的SDS-PAGE分析。泳道1總細胞；泳道2細胞沉淀；泳道3上清。
圖4.來自破碎的上清的NMB1125純化過程的SDS-PAGE分析。泳道1所得的蛋白；泳道2發現于不同層析級分中的低分子量污染蛋白；泳道3應用前的樣品。
圖5.獲自通過鼻內或腹膜內途徑免疫的小鼠的針對重組蛋白NMB1125的抗體水平(IgG)。顯示了ELISA結果，其被表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數。
圖6.使用用重組蛋白免疫的小鼠的血清對存在于腦膜炎奈瑟氏球菌OMV中的NMB1125的Western印跡。免疫鑒定的NMB1125比較顯著。
圖7.在通過鼻內途徑免疫的小鼠中在粘膜水平的針對重組蛋白NMB1125的IgA抗體應答。結果表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數。(A)唾液中的IgA抗體應答。(B)肺沖洗物中的IgA抗體應答。
圖8.使用BLAST對NMB1125蛋白(查詢)和來自不同血清群腦膜炎奈瑟氏球菌(“Sbjct”)的基因組的該序列之間的同源性探查的結果。
圖9.通過針對重組抗原引發的血清對不同腦膜炎奈瑟氏球菌株系中的NMB1125的識別。圖中只顯示了用半純化的蛋白的腹膜內途徑獲得的結果，但是在其他情況中觀察到類似的特性。結果表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數。
圖10.在幼年大鼠模型的針對腦膜炎球菌感染的被動保護實驗中通過腹膜內途徑給藥用兩種方法獲得的蛋白免疫引發的血清的比較。
圖11通過產生的mAb(mAb H8/92，3H2764和7D2/15)對NMB1125蛋白和一組非相關抗原的識別。P1，腦膜炎奈瑟氏球菌株系B:4:P1.15的1類蛋白；P64k，來自腦膜炎奈瑟氏球菌的丙酮酸脫氫酶的E3亞基；T.T，破傷風類毒素；HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原。
圖12.來自腦膜炎球菌病存活者的人恢復期血清對NMB1125的識別。使用健康供者血清作為陰性對照。結果顯示為在ELISA類型測定中的吸光度(492nm)。
圖13.來自用游離肽(JY1)、重組蛋白(NMB1125)或綴合物JY1-NMB1125免疫的動物的血清的JY1抗肽滴度。
實施例此處通過實施例描述本發明，所述的實施例對本發明本身提供了信息，但決不是對所述發明的限制。
實施例1在血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌外膜泡囊制劑中NMB1125蛋白的檢測為了研究存在于血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌(株系B:4:P1.19，15)外膜泡囊中的蛋白質，根據別處描述的方法進行了二維電泳(Grg A等人，1985.Electrophoresis 6599-604)。然后使用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，U.S.)對凝膠提取的蛋白質進行了酶消化。消化后產生的肽通過微型柱(ZipTips，Millipore，MA，U.S.)提取入溶液。為了質譜法分析，用60％乙腈、1％甲酸從微型柱中洗脫肽，然后立即應用于nanotips(Protana，Denmark)。
在配備有電離源(nanoESI)具有cuadrupole和飛行時間的雜合質譜儀(QTof-2TM，Manchester，United Kingdom)中進行測量。400-2000范圍的w/z在0.98秒內并使用0.02秒的掃描間隔獲得質譜測定數據。使用MassLynx程序(versión 3.5，Micromass)進行數據的獲得和數據處理。
使用ProFound程序(Zhang W和Chait BT.2000.ProFoundanexpert system for protein identification using massspectrometric peptide mapping information.Anal Chem722482-2489.http//prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)進行基于質譜數據的蛋白質鑒定。對包含于SwissProt數據庫(http//www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因和衍生的蛋白質序列進行檢索，考慮甲硫氨酸的氧化、半胱氨酸的脫酰胺基作用和羧基酰胺甲基化作用作為可能遇到的修飾。
利用MASCOT程序(Perkins DN等，1999.Probability-basedprotein identification by searching sequence databases usingmass spectrometry data.Electrophoresis 203551-3567.http//www.matrixscience.com/)進行基于質譜的蛋白質鑒定。檢索參數包括半胱氨酸修飾以及氧化作用和脫酰胺作用。
從存在于外膜泡囊制劑中的蛋白質的鑒定獲得的結果的分析，選擇NM1125蛋白用于作為可能的疫苗候選物進行評價，由此通過質譜鑒定一種肽。
實施例2NMB1125蛋白與可用的數據庫中的報告的基因產物的同源性分析為了分析NM1125蛋白與其他基因產物的同源性，使用BLAST程序(Altschul SF等，1990.Basic local alignment search tool.J MolBiol 215403-410，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在NCBI數據庫中進行了基于同源性的檢索。該方法獲得的結果標記為同源的，除了在公開的奈瑟氏菌屬基因組中報告的蛋白質外，識別了來自不同生物如Ralstonia，耶爾森氏菌屬(Yersinia)和假單孢菌屬(Pseudomonas)種的幾種標記為假定的蛋白質的基因產物。
這些蛋白質在這些基因組中的高度保守性已經產生了具有在NCBI數據庫中報告的保守結構域的直向同源進化組[(gnl|CDD|13507，COG4259，在細菌中保守的未表征的蛋白質[功能未知)]，表明存在可能的系統發生關聯和他們存在共同的祖先。
使用MBGD數據庫(Uchiyama，I.2003.MBGDmicrobial genomedatabase for comparative analysis.Nucleic Acids Res.31，58-62.)進行對編碼NM1125的基因的基因組環境的分析，并揭示了在前面提到的微生物中這些基因的保守的基因組織，結合以前的數據，這促使我們得出這樣的結論，即這些基因在他們各自的基因組中是顯著同源的。
實施例3在大腸桿菌中克隆和表達編碼腦膜炎奈瑟氏球菌的NMB1125蛋白的NMB1125基因。
為了克隆和表達NM 1125基因，使用了pM-100克隆載體。該載體允許使用不同的限制酶進行克隆，并且在大腸桿菌中產生高表達水平的包函體形式的異源蛋白。
該pM-100載體(圖1)具有下列元件色氨酸啟動子、編碼來自腦膜炎奈瑟氏球菌株系B:4:P1.19，15的P64kDa的Nt片段的47個氨基酸穩定序列的基因片段、T4噬菌體轉錄終止子序列和賦予氨芐青霉素抗性的作為選擇標志的基因的序列。
從編碼NMB1125蛋白的核苷酸序列(實施例1)設計了兩個引物(7738和7739)來從B:4:P1.19，15基因組DNA擴增該基因片段，沒有編碼預測的信號肽的序列。
BglII77385＇TTAGATCTCTATCCCGATACCGTCTATGAAGG＇3(Seq.ID.No.1)77395＇AAGCTCGAGTCGTTTGCCTCCTTTACC 3＇Xhol(Seq.ID.No.2)使用SignalP World Wide Web server(http//www.cbs.dtu.dk/services/Signa1P-2.0)進行信號肽的預測。使用引物7738和7739 PCR擴增NMB1125基因之后(Randall K等人，1988.Science 42394487-491)，使用BglII和XhoI限制酶消化該PCR產物，并克隆進預先消化的pM-100克隆載體中。最后的構建體示于圖2中，NMB1125蛋白表達為與P64kDa蛋白的Nt片段的融合蛋白。使用ALFexpress II自動測序儀(Termo SequenaseTMCyTM5DyeTerminador Kit，Amersham Biosciences)和分別結合P64穩定劑以及T4轉錄終止子的序列的寡核苷酸1573(Seq.ID.No.8)和6795(Seq.ID.No.9)對克隆的基因NMB1125進行測序。此處產生的質粒在其以后的應用中稱為pM-238。
為了表達NMB1125基因，使用pM-238質粒(圖2)通過化學方法轉化GC366大腸桿菌。在補充1％甘油、1％酪蛋白水解物、0.1mM CaCl2，1mM MgSO4和50ug/mL氨芐青霉素的基本培養基(M9)(Miller JH.1972.Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，NEW York，USA)中進行表達實驗。細菌培養物在37℃和250rpm下孵育12小時。離心生長培養物，并超聲破碎細胞沉淀(IKA LABORTECHNIK)。通過SDS-PAGE(Laemmli UK.1970.Cleavage of structural proteins during the assembly of the headof bacteriophage T4.Nature 277680)和考馬斯亮藍R-250染色分析沉淀和上清級分。通過凝膠密度測定法(LKB Bromma 2202 Ultrascanlaser densitometer；Amersham Pharmacia Biotech，United Kingdom)測定表達百分比。從上清級分中獲得NMB1125蛋白，大約是該級分總蛋白含量的60％(圖3)。含有蛋白的部分用緩沖液A(25mM的Tris-羥甲基氨基甲烷)進行透析，并通過使用monoQ 5/5柱(AmershamBiosciences)以及在1小時內的0-100％NaCl梯度[緩沖液A作為平衡緩沖液，緩沖液B(緩沖液A+1M NaCl)]的離子交換層析從中純化NMB1125蛋白，獲得80％純的蛋白，如圖4所示。
實施例4用NMB1125蛋白通過腹膜內和鼻內途徑免疫誘導的免疫應答的評價為了評價NMB1125蛋白的免疫原性，在小鼠中設計和進行了免疫實驗，其中給藥了通過兩種不同的方法獲得的相同的蛋白。第一個由從聚丙烯酰胺凝膠的帶中的提取物組成(Castellanos L等，1996.Aprocedure for protein elution from reverse-stainedpolyacrylamide gels applicable at the low picomole levelAnalternative route to the preparation of low a bundance proteinsfor microanalysis.Electroforesis 171564-1572)，而第二個是實施例3中所涉及的，所述的產物稱為半純化的蛋白。
用這些制劑免疫雌性Balb/C小鼠(8-10周齡)，所述的小鼠分成4組，每組8只。通過鼻內或腹膜內途徑進行三次免疫，兩次間隔15天。通過腹膜內途徑給藥的蛋白用弗氏佐劑乳化。表1中描述了該免疫原的組成表1用于免疫的Balb/C小鼠的組別
在取自第三次接種后的血清樣品中針對重組蛋白和存在于細菌中的同源蛋白的抗體滴度(IgG)通過ELISA測定。在圖5中顯示了各個動物的針對重組蛋白的抗體滴度。在第二次接種后確定抗體水平，盡管他們在第三次接種后更高。另外，通過Western印跡進行了免疫鑒定，其中識別了每個蛋白帶。通過腹膜內途徑免疫的組的滴度顯著高于通過鼻內途徑引發的。為了進行結果的統計學分析，根據Bartlett’s檢驗使用了Kruskal-Wallis的無參數方差分析，因為組中的非方差齊性。使用Dunn的多重比較檢驗比較了每個處理的平均值。
用重組蛋白免疫后獲得的血清識別存在于株系CU385的外膜蛋白(OMP)制劑中天然蛋白。這些結果示于圖6中。為了分析粘膜應答評價了唾液樣品和肺洗液。圖7只顯示了通過鼻內途徑免疫的組。在接受半純化的蛋白的組中觀察到IgA滴度的增加。
實施例5在不同腦膜炎奈瑟氏球菌株系中編碼蛋白NMB1125的基因序列的表征為了分析在不同腦膜炎奈瑟氏球菌株系中編碼蛋白NMB1125蛋白的基因序列的保守性，使用程序BLAST(Altschul SF等人，1990.Basiclocal alignment search tool.J Mol Biol 215403-410.http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對在NCBI數據庫(NC_003116.1，NC_003112.1，NC_003221，SANGER_135720|Contigl)中標注的腦膜炎奈瑟氏球菌(血清群A、B和C)基因組進行了類似的研究。圖8顯示了這些序列的序列比較結果，其在每個分析的基因組中產生明顯的比對。組A和組B中的序列與編碼蛋白NMB1125的基因的序列(Seq.ID.No.3)具有100％的序列相同性，血清群C的序列具有99％的相同性。另外，對3個古巴分離株確定了所述基因的序列(Seq.ID.No.5-7)，他們屬于血清群B(B:4:P1.19，15)，并使用ClustalX程序(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)進行了序列比對。比對的結果顯示在被分析的株系中基因NMB1125的核苷酸序列具有很大的保守性。
考慮到存在于前述序列中的高度相似性，使用蛋白NMB1125作為疫苗候選物，將可以產生有效的免疫應答，對腦膜炎球菌疾病具有廣譜的保護作用(由于交叉反應性)。
實施例6用蛋白NMB1125免疫Balb/C小鼠誘導的廣譜作用的免疫應答的表征。
為了評價用蛋白NMB1125的免疫是否誘導了與其他奈瑟氏菌屬株系廣泛的交叉反應性應答，進行了ELISA。用7種奈瑟氏菌屬株系的全細胞包被聚苯乙烯平板，所述的株系屬于不同的血清型和血清亞型。所述的平板與通過兩種途徑免疫(如實施例4所述)獲得的針對蛋白NMB1125的混合血清溫育。
圖9顯示了用針對通過腹膜內途徑給藥的半純化的蛋白引發的血清獲得的結果。如所觀察到的結果，免疫血清識別存在于不同株系中的所述蛋白，其水平類似于在株系CU385中發現的水平。其他的血清在該測定中具有相當的表現。
實施例7在幼年大鼠模型中對蛋白NMB1125特異的鼠血清誘導的抗同源和異源株系的保護作用為了測定獲得的抗血清的功能活性，在幼年大鼠模型中進行了對于腦膜炎球菌感染的保護作用測定。將24只大鼠(5-6天齡)分組，每組6只。
測定通過腹膜內途徑給藥的血清是否保護大鼠免受一小時后通過相同途徑接種的細菌(株系CU385)引起的感染。混合每組的血清并1/10(在滅菌PBS中)稀釋，然后將他們接種幼年大鼠。4小時后，對動物取樣，并計數他們血液中的活菌。
為了解釋該結果，進行了方差(Anova)分析，然后進行了Dunnet’s多重比較測試，其中測試組與陰性對照組比較。如在圖10中所觀察到的，接受抗蛋白NMB1125的抗血清的組顯示與陰性對照統計學上顯著的差異，因此他們被認為在該模型中是保護性的。
用分離于古巴病人的株系H44/48和120/90(其血清學分類與株系CU385同源)感染幼年大鼠進行了類似的測定。另外，用血清群C的株系233(C:2a:P1.5)和血清群B的株系H44/76(B:15:P1.7，16)進行了攻擊實驗。在所有情況中，抗血清保護幼年大鼠抵抗腦膜炎球菌感染。
實施例8能夠介導抗腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌活性的針對蛋白NMB1125的單克隆抗體的產生為了產生特異針對蛋白NMB1125的單克隆抗體(mAb)，并研究介導抗同源和異源抗腦膜炎奈瑟氏球菌株系的殺菌活性的功能性，用純度高于80％的蛋白NMB1125制劑(實施例3)進行了免疫程序。在Balb/C(H-2d，雌性，5-6周齡)中進行免疫，并應用如下的四個劑量在第0、15和30天常規免疫，每只小鼠通過皮下途徑給藥用弗氏佐劑乳化的10μg抗原NMB1125(總體積100μl)；在第50天通過腹膜內途徑給藥每只小鼠在磷酸緩沖鹽水(140mM NaCl，270mM KCl，1.5mM KH2PO4，6.5mM Na2HPO4x 2H2O，pH 7.2)中的10μg抗原。在第0天和第45天進行血液提取。
通過使用蛋白NMB1125作為包被抗原(實施例3)的間接ELISA測量的具有最高滴度的動物的脾細胞與X63 Ag8 653小鼠骨髓瘤細胞融合。根據標準方法(Gavilondo JV.1995.AnticuerposMonoclonalesTeoría y Práctica，Elfos Scientiae，La Habana，Cuba)分離和篩選所得到的雜交瘤。
雜交瘤分泌的抗體針對蛋白NMB1125的反應性以及他們與無關抗原的交叉反應性通過使用5μg/ml的每種抗原的間接ELISA進行測試，測定相同濃度的每種mAb。圖11顯示了該實驗獲得的結果，共獲得3個陽性克隆(mAb H8/92，3H2/64和7D2/15)，其特異識別蛋白NMB1125，并既不與相應于P64K的N末端的氨基酸序列反應，也不與測定的其他無關抗原反應。
為了測定針對蛋白NMB1125產生的mAb介導抗腦膜炎奈瑟氏球菌的同源和異源株系的殺菌應答的能力，進行了殺菌測試。殺菌抗體的滴度表示為測試的抗體能夠殺死50％或更多的細菌的最高稀釋度的倒數，所產生的抗體中兩種(3H2/64和7D2/15)具有高于1∶128的抗同源株系B:4:P1.19，15的殺菌滴度，一種mAb(H8/92)具有高于1∶80的滴度。另外，他們具有高于1∶64的抗異源株系B:15:P1.7，16和C:2a:P1.5的滴度。
實施例9鼠科動物針對蛋白NMB1125的免疫應答的靶區域的表征為了鑒定該蛋白的通常被針對重組抗原產生的鼠科動物抗血清識別的區域，進行了SPOTScan測定。在纖維素膜上合成了一套跨度所述蛋白序列的重疊肽，所述的肽與1∶100稀釋的混合血清溫育。通過與綴合抗鼠免疫球蛋白G-堿性磷酸酶溫育并隨后加入含有底物溴-氯-碘基磷酸的溶液來檢測抗原抗體反應。
無論用于免疫所使用的制劑，在蛋白中觀察到幾個共同的抗原性區域。但是，在用弗氏佐劑佐化的蛋白免疫的組中有比較廣的形式的識別。
實施例10人血清對NMB1125蛋白的識別在本研究中使用來自康復期個體的人血清收集物，通過ELISA進行該研究。用獲自制備性電泳的蛋白NMB1125(5μg/ml)包被平板。用含有Tween-20的3％脫脂奶粉PBS溶液封閉平板后，用相同溶液1∶50稀釋血清，并于平板中溫育。如已經廣泛報道的進行免疫測定。健康供體血清用作陰性對照。另外，來自用重組的針對乙型肝炎的疫苗免疫的個體的混合血清作為無關對照(數據未顯示)。
圖12顯示了該測定中用5個康復期血清獲得的結果。可以看到人血清識別該蛋白，這表明其在腦膜炎球菌感染階段表達并是免疫原性的。
實施例11蛋白NMB1125作為肽載體為了證明重組蛋白NMB1125的載體能力，將其綴合至15聚體(15mer)的合成肽，所述的合成肽來自HIV-1分離株JY1的gp120蛋白的V3區。通過戊二醛方法進行所述的綴合。將游離JY1肽、重組蛋白NMB1125和綴合物JY1-NMB1125以三劑量方案給藥成年小鼠，其中免疫原用弗氏佐劑乳化。第三次劑量后兩周，從免疫的動物獲取血清樣品，并通過ELISA分析該樣品以確定抗肽抗體滴度。為此，用游離肽(20μg/ml)包被平板，如以前所述進行免疫測定。實驗的結果(圖13)顯示了NMB1125的載體能力，即綴合后其能明顯地加強針對肽JY1的抗體應答。
序列表<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology<120>NMB1125蛋白及其在藥物制劑中的用途<140>CU 2003/0285<141>2003-12-02<150>CU 2003/0285<151>2003-12-02<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>1ttagatctct atcccgatac cgtctatgaa gg32<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸7739<400>2aagctcgagt cgtttgcctc ctttacc 27<210>3<211>262<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>3ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60
cgaaaagatg gaaaaatact ttgtggaagc cggcaacaaa aaaatgaatg ccgccccggg 120tgcgcacgcc atctgggact gctgctttcc gttcgggaga caaagagggc cgttccgcca 180gtttgaagaa gagaaaaggc tgtttcccga atcgggcgta tttatggact tcctgatgaa 240aaccggtaaa ggaggcaaac ga 262<210>4<211>97<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>4Gln Lys Ser Leu Tyr Tyr Tyr Gly Gly Tyr Pro Asp Thr Val Tyr Glu1 5 10 15Gly Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ser Leu Gly Lys Gln Thr Glu Lys Met20 25 30Glu Lys Tyr Phe Val Glu Ala Gly Asn Lys Lys Met Asn Ala Ala Pro35 40 45Gly Ala His Ala His Leu Gly Leu Leu Leu Ser Arg Ser Gly Asp Lys50 55 60Glu Gly Ala Phe Arg Gln Phe Glu Glu Glu Lys Arg Leu Phe Pro Glu65 70 75 80Ser Gly Val Phe Met Asp Phe Leu Met Lys Thr Gly Lys Gly Gly Lys85 90 95Arg<210>5<211>260<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>5ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240
aaaaccggta aaggaggcaa 260<210>6<211>260<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>6ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240aaaaccggta aaggaggcaa 260<210>7<211>260<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>7ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240aaaaccggta aaggaggcaa 260<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸1573<400>8ttccatggta gataaaagaa tggctttag 29<210>9<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸6795<400>9aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg 2權利要求
1.腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的蛋白質NMB1125，特征在于其是能夠在受體生物中產生針對由奈瑟氏菌屬的細菌引起的感染的保護性應答的抗原，并具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
2.權利要求1的蛋白質NMB1125，其特征在于由序列表中SEQ IDNO3所示的基因NMB1125編碼。
3.權利要求2的基因NMB1125，其特征在于具有序列表中SEQ IDNO3所示的堿基序列并編碼權利要求1的蛋白質。
4.通過重組技術或化學合成獲得的蛋白質或肽，特征在于蛋白質NMB1125的序列并能在受體生物中產生抗由權利要求1的奈瑟氏菌屬細菌引起的感染的保護性應答。
5.藥物制劑，特征在于含有權利要求1、2和4的蛋白質或肽或根據權利要求1、2和4，通過天然方法制備的權利要求1的蛋白質。
6.權利要求5的藥物制劑，特征在于是能夠在受體生物中產生抗奈瑟氏菌屬細菌引起的感染的保護性應答的疫苗。
7.權利要求5和6的藥物制劑，特征在于是能夠在受體生物中產生抗腦膜炎奈瑟氏球菌引起的感染的保護性應答的疫苗。
8.權利要求5和6的藥物制劑，特征在于是能夠在受體生物中產生抗淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的感染的保護性應答的疫苗。
9.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于是預防性或治療性制劑。
10.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于是含有一種或幾種通過重組方式、合成方式獲得的或通過天然途徑制備的不同抗原性質的抗原的組合制劑。
11.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于含有多糖抗原。
12.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于制劑的組分之一是腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。
13.權利要求9的藥物制劑，特征在于含有一種多糖-蛋白質綴合物，所述的多糖部分對應于細菌多糖。
14.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于含有一種或幾種滅活的微生物。
15.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，特征在于含有肽抗原。
16.權利要求5和6的藥物制劑，特征在于含有激素。
17.權利要求5和6的藥物制劑，特征在于含有生長因子。
18.權利要求5-17的藥物制劑，特征在于是通過腸胃外途徑給藥的制劑。
19.權利要求5-17的藥物制劑，特征在于是通過粘膜途徑給藥的制劑。
20.權利要求5-17的藥物制劑，特征在于是經口途徑給藥的制劑。
21.權利要求5-20的藥物制劑，特征在于是免疫刺激劑或免疫增強劑制劑。
22.權利要求5-21的藥物制劑，特征在于含有NMB1125抗原的肽或片段。
23.權利要求5-21的藥物制劑，特征在于含有NMB1125抗原的模擬表位。
24.基因修飾的生物，特征在于含有權利要求3的基因或其部分，單獨或包括于另一基因序列中。
25.權利要求24的藥物制劑，特征在于含有基因修飾的生物，活的、減毒的或其制備物。
26.藥物制劑，特征在于含有權利要求24中的生物表達的蛋白質，并且能在受體生物中產生針對由奈瑟氏菌屬的細菌引起的感染的保護性應答。
27.藥物制劑，特征在于含有權利要求1、2和4的蛋白質或肽，作為不同性質的抗原的載體。
28.藥物組分，特征在于含有權利要求1和2的蛋白質NMB1125或其片段，并能夠單獨或在其他組分存在下檢測人體中的腦膜炎球菌病。
29.藥物組分，特征在于含有權利要求3的基因或其片段，并能夠單獨或在其他組分存在下檢測人體中的腦膜炎球菌病。
30.根據權利要求1和2的蛋白質NMB1125或其片段在生物傳感器或其他制藥學或生物技術學應用中的用途。
31.根據權利要求3的基因NMB1125或其片段在生物傳感器或其他制藥學或生物技術學應用中的用途。
全文摘要
本發明涉及用于預防或治療細菌、病毒、癌性的或其他來源的疾病的新疫苗抗原的用途。本發明的技術目的是開發能夠增加現有疫苗的保護譜的制劑并擴展該疫苗抵抗不同的病原體。為此分離了蛋白質NMB1125，并鑒定為腦膜炎奈瑟氏球菌外膜制劑的組分，其能誘導殺菌活性。另外，克隆和表達了編碼蛋白質NMB1125的基因，純化所述的蛋白質，并隨后在動物生物模型中測定了其免疫原性。同源基因序列的高度保守水平表明當以不同方式被呈遞時其作為誘導交叉免疫應答的抗原的高度價值。所得的制劑適于用于制藥業作為用于人類的疫苗制劑。
文檔編號A61K48/00GK1890260SQ200480035877
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月2日 優先權日2003年12月3日
發明者R·帕容費伊特, G·E·古伊倫尼爾托, G·薩蒂納斯加西亞, L·H·貝坦科特紐涅茲, L·R·卡斯特拉諾斯薩拉, Y·佩雷拉尼格林, D·加西亞迪亞茲, O·尼布拉佩雷斯, E·卡巴雷羅米南德斯, S·岡薩雷斯布蘭克 申請人:遺傳工程與生物技術中心