專利名稱：預防和治療膿毒癥的蛇毒提取物的制作方法
技術領域：
本發明涉及采用一種用于預防和治療膿毒癥的蛇毒提取物，具體地說是一種同活化C蛋白功能相似的用于預防和治療膿毒癥的提取物。
背景技術：
膿毒癥是嚴重創傷、燒傷、休克、大手術后常見的并發癥，是導致人類死亡的一常見病種，它有極高的發病率和死亡率。(Alerti C，Brun-Buission C，Burchardi H，etal.Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentercohort study[J].Intensive Care Med，2002，28(2)108-121.)膿毒癥是指由感染或者有高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應綜合癥，其病原菌包括細菌、真菌、寄生蟲及病毒等，臨床癥狀包括但不限于(1)體溫＞38℃或＜36℃；(2)心率＞90次/分鐘；呼吸＞20次/分鐘或PaCO2＜32mm Hg；(4)外周血白細胞計數＞12×109/L，＜4×109/L或成熟粒細胞＞10％；(5)器官功能障礙，高灌注或高血壓。(王正國.膿毒癥研究概況[J].中華創傷雜志，2003，19(1)5-7.)自20世紀80年代以來，隨著對膿毒癥發病機制研究的深入，開發各種旨在抑制膿毒癥形成的藥物也隨即興起，并進行了80多項臨床試驗，其中幾個有希望的藥物進行了III期臨床試驗，但是遺憾的是僅有一個藥物(活化C蛋白)被開發成功。(Polderman KH and Girbes ARJ.Drug intervention trials in sepsisdivergent results[J].Lancet，2004，3631721-1723.)。活化C蛋白(商品名為Xigris)的開發成功為新的治療嚴重膿毒癥藥物的開發提供了借鑒，特別是在天然產物中尋找同其功能相似的物質，在此稱為活化C蛋白樣酶(activated protein C like enzyme)。由于在靜脈血栓病人中約有64％的患者對活化C蛋白是抗性的，所以這部分病人患膿毒癥后再用Xigris治療肯定是無效的，而活化C蛋白樣物質就可以彌補Xigris的不足。另外，Xigris的生產過程復雜，生產成本較高，每個病人一個療程的費用約為6800美元，如此高的價格限制了它在臨床上的廣泛應用。以上這些原因使得活化C蛋白樣酶的尋找和開發有著非常重要的經濟和社會意義。(馮軍，趙文杰.活化C蛋白[J].國外醫藥——合成藥、生化藥、制劑藥分冊，2002，23(6)348～351.)我國有著豐富的蛇毒資源，在世界各地分布的500多種毒蛇，在我國就有150多種。蛇毒是一種混合物，它含有許多種類具有不同生物活性的蛋白質，其中很多蛋白質作用于人血液系統的成分。(Markland FS.Snake venoms and the hemostatic system[J].Toxicon，1998，36(12)1749～1800.)但是，至今沒有發現利用蛇毒單一組分進行預防和治療膿毒癥的報道。
基于活化C蛋白被成功開發為治療嚴重膿毒癥藥物和蛇毒中存在多種作用于血液系統的組分，有必要提出從蛇毒中尋找活化C蛋白樣酶，進行治療膿毒癥創新藥物的開發。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供一種用于預防和治療膿毒癥的蛇毒提取物，以克服現有技術的不足。
本發明需要解決的另一個技術問題是提供這種用于預防和治療膿毒癥的提取物的制備方法。
本發明需要解決的再一個技術問題是提供這種提取物在制備治療膿毒癥的藥物中的應用。
本發明公開了一種蛇毒提取物，其特征在于，該提取物在體外能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又能水解活化C蛋白特異顯色肽底物，在體內它能顯著降低膿毒癥試驗動物的死亡率。
該蛇毒提取物，由如下方法制備(1)蛇毒的分離純化，選自離子交換層析技術、凝膠過濾層析技術、親和層析技術、疏水層析技術或離心、超濾、鹽析、有機溶劑沉淀技術中的一種；(2)將收集液進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間的測定和水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定，取同時具有二者活性的組分。
其中離子交換層析技術的具體步驟如下蛇毒溶于pH為5～10的起始緩沖液，如乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、磷酸二氫鈉-氫氧化鈉緩沖液、Tris-HCl緩沖液、巴比妥-鹽酸緩沖液、硼砂緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液等，其中最優地使用pH為7.6的Tris-HCl緩沖液中，對起始緩沖液透析，然后取出，離心，離心條件為10000g，30min，取上清；采用陰離子交換層析分離蛇毒，所使用陰離子交換層析介質為本領域所公知的各種層析介質，根據其骨架的不同可分為聚苯乙烯型、纖維素型、葡聚糖型、瓊脂糖型、球狀纖維素型等，如Q Sepharose系列、DEAE Sepharose系列、DEAE Sephacel系列、QAE Sephadex系列、DEAE Sephadex系列、SOURCE Q系列等，其中最優的使用SOURCE 30Q作為層析介質進行分離，層析條件根據每種層析介質的使用說明和要分離的蛇毒量做相應的調整，方法為本領域所公知。
上述蛇毒提取物的來源包括但不限于蝮蛇毒(Agkistrodon halys venom)、烙鐵頭蛇毒(Trimeresurus mucroquamatus venom)、蝰蛇毒(Vipera russelli venom)、尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)、眼鏡蛇毒(Naja naja atra venom)、眼鏡王蛇毒(Ophiophagus hannah venom)、金環蛇毒(Bungarus multicinctus venom)、竹葉青蛇毒(Trimeresurus stejnegeri venom)、白眉蝮蛇毒(Baimei pallas pit viper)。
本發明還公開了該蛇毒提取物的制備方法，可以是從不同種屬的蛇毒中提取，也可以是用基因工程手段制備的這些重組的蛇毒有效組分。
本發明制備預防和治療膿毒癥蛇毒有效組分的方法是采用本領域公知的蛋白質分離純化技術，如離子交換層析技術、凝膠過濾層析技術、親和層析技術、疏水層析技術、離心、超濾、鹽析、有機溶劑沉淀等技術對蛇毒進行分離純化，然后對蛇毒分離組分進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間和水解活化C蛋白特異顯色肽底物能力的測定，同時具有二者活性的組分即為預防和治療膿毒癥蛇毒有效組分。
這些蛇毒提取物的提取方法如下(1)蛇毒的分離純化，選自離子交換層析技術、凝膠過濾層析技術、親和層析技術、疏水層析技術或離心、超濾、鹽析、有機溶劑沉淀技術中的一種。
(2)將收集液進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間的測定和水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定，取同時具有二者活性的組分。
其中離子交換層析技術的具體步驟如下蛇毒溶于起始緩沖液即Tris-HCl緩沖液中，2-25℃透析3-24小時，然后取出，2～25℃離心，離心條件為3000～10000g，時間為5～60min，取上清；最優的使用SOURCE 30Q作為層析介質進行分離0.1～10克蛇毒，陰離子層析的柱體積為6～600ml，流速為0.5～50ml/min；用起始緩沖液平衡3～8倍柱體積；上樣量為2～200ml；先用1～5倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B)，B從0～100％，洗脫20倍CV；取既能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又能水解活化C蛋白特異顯色肽底物中的收集液。
采用SOURCE 30Q陰離子交換層析介質對蝮蛇毒進行分離，得到了6個組分，分別對陰離子交換層析得到的6個蝮蛇毒組分峰進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間的測定，結果表明峰5組分具有明顯的延長活化部分凝血活酶時間，其中一管收集液可比對照的時間延長10倍，而其它5個組分峰僅有較弱的延長活化部分凝血活酶時間的能力。
分別對陰離子交換層析得到的6個蝮蛇毒組分峰進行水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定，結果表明僅有峰5組分具有明顯的水解L PefachromePCa3297的能力。
蝮蛇毒有效組分對膿毒癥實驗小鼠的作用，小鼠注射脂多糖24h后，開始觀察到有小鼠的死亡，繼續觀察至72h。各組小鼠的死亡情況見表4。從表中可看出蝮蛇毒有效組分能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率，低劑量組降低15％，中劑量組降低55％，高劑量組降低65％。
用烙鐵頭蛇毒、白眉蝮蛇毒、眼鏡王蛇毒、尖吻蝮蛇毒、眼鏡蛇毒、眼鏡王蛇毒、金環蛇毒、蝰蛇毒、竹葉青蛇毒替換蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的竹葉青蛇毒有效組分。
本發明公開的蛇毒提取物，同活化C蛋白功能有相似用途，可用于制備預防和治療膿毒癥的藥物。
本發明中蛇毒提取物的制備方法同活化C蛋白相比，具有來源方便，生產簡單易行，成本低等優點。
圖1為蝮蛇毒的陰離子交換層析圖譜。
具體實施例方式
實施例1陰離子交換層析分離蝮蛇毒稱取0.5g蝮蛇毒，溶于10ml 0.05mol/L，pH 7.6的Tris-HCl緩沖液(起始緩沖液)中，對該緩沖液透析過夜(4℃)，然后取出，離心(4℃，10000g，30min)，棄沉淀，收集上清，進行陰離子交換層析，層析條件如下層析介質SOURCE 30Q；柱體積30ml；流速5ml/min；柱平衡用起始緩沖液平衡5倍柱體積；上樣量10ml；洗脫先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B)，B從0～100％，洗脫20倍CV；收集8.0ml/管。
采用SOURCE 30Q陰離子交換層析介質對蝮蛇毒進行分離，得到了6個組分，具體結果見附圖1和表1。
表1陰離子交換層析各組分峰的積分結果
實施例2延長人血漿活化部分凝血活酶時間的測定取凝血活酶(白陶土-腦磷脂)混懸液0.1ml，加正常人混合新鮮血漿0.1ml，對照組加生理鹽水0.1ml，混勻，37℃水浴孵育5min，加入0.025mol/L氯化鈣溶液0.1ml，立即開動秒表，記錄凝血時間，試驗組除用蝮蛇毒分離液代替生理鹽水外，其它與對照組相同。[參見，王鴻利.血栓與止血檢驗技術，第一版[M]，上海上海科學技術出版社，1992，66-67.]分別對陰離子交換層析得到的6個蝮蛇毒組分峰進行測定，結果表明峰5組分具有明顯的延長活化部分凝血活酶時間，其中一管收集液可比對照的時間延長10倍，而其它5個組分峰僅有較弱的延長活化部分凝血活酶時間的能力。
實施例3水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定取4μmol/L PefachromePCa3297(活化C蛋白特異顯色肽，購自瑞典Pentapharm公司)0.2ml，加pH 8.4的0.05mol/L Tris-咪唑緩沖液1.65ml，再加入不同的蝮蛇毒分離液0.2ml，混勻，在405nm測吸收值的變化(測定3min)。參比溶液為用0.2ml水溶液替換蛇毒溶液的上述溶液組成。[參見，Martinoli JL，Stocker K.Fast functionalprotein C assay using Protac，a novel protein C activator[J].Thromb Res，1986，43(3)253～264.]
分別對陰離子交換層析得到的6個蝮蛇毒組分峰進行測定，結果表明僅有峰5組分具有明顯的水解L PefachromePCa3297的能力。
實施例2、3的試驗結果表明峰5組分(以下稱為蝮蛇毒有效組分)具有同活化C蛋白功能相似的作用。
實施例4蝮蛇毒有效組分對膿毒癥實驗動物的作用(1)脂多糖對小鼠LD100的測定取18～22g小鼠30只，每10只分為一組，雌雄各半，分別以2mg/kg bwt(體重)、10mg/kg bwt和50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射脂多糖(E.coli 055B5，購自Sigma公司)溶液，注射速度為0.5ml/min，在72h內觀察各組小鼠的死亡情況。
小鼠被注射脂多糖24h后，開始觀察到有小鼠的死亡，繼續觀察至72h。具體各組小鼠的死亡情況見表3。從表中可看出小鼠對脂多糖的敏感性較低，只有當脂多糖的劑量達到50mg/kg bwt時，其致死率才達到100％，因此確定本試驗所測定的脂多糖對小鼠LD100為50mg/kg bwt，該劑量約相當于每只小鼠注射1.0mg的脂多糖。
表3LPS對小鼠LD100的測定結果
(3)蝮蛇毒有效組分對膿毒癥實驗小鼠的作用取18～22g小鼠80只，每20只分為一組，雌雄各半，分成四組。第一組以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射脂多糖溶液；第二組先以2mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的蝮蛇毒有效組分溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液；第三組先以4mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的蝮蛇毒有效組分溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液；第四組先以8mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的蝮蛇毒有效組分溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液注射速度均為0.5ml/min，在72h內觀察各組小鼠的死亡情況，計算死亡率。
小鼠注射脂多糖24h后，開始觀察到有小鼠的死亡，繼續觀察至72h。各組小鼠的死亡情況見表4。從表中可看出蝮蛇毒有效組分能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率，低劑量組降低15％，中劑量組降低55％，高劑量組降低65％。
表4蝮蛇毒有效組分降低膿毒癥小鼠死亡率的試驗結果
實施例5在實施例4下“用蝮蛇毒有效組分對膿毒癥實驗小鼠的作用”中以先注射脂多糖，再注射蝮蛇毒有效組分做替換，也得到了相類似的試驗結果。
實施例6用烙鐵頭蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的烙鐵頭蛇毒有效組分。
實施例7用白眉蝮蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的白眉蝮蛇毒有效組分。
實施例8用眼鏡王蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的眼鏡王蛇毒有效組分。
實施例9用尖吻蝮蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的尖吻蝮蛇毒有效組分。
實施例10用眼鏡蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的眼鏡蛇毒有效組分。
實施例11
用眼鏡王蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的眼鏡王蛇毒有效組分。
實施例12用金環蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的金環蛇毒有效組分。
實施例13用蝰蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的蝰蛇毒有效組分。
實施例14用竹葉青蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預防和治療膿毒癥作用的竹葉青蛇毒有效組分。
權利要求
1.一種蛇毒提取物，其特征在于，該提取物在體外能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又能水解活化C蛋白特異顯色肽底物，在體內它能顯著降低膿毒癥試驗動物的死亡率。
2.根據權利要求1所述的蛇毒提取物，其特征在于，所述及的提取物由如下方法制備(1)蛇毒的分離純化，選自離子交換層析技術、凝膠過濾層析技術、親和層析技術、疏水層析技術或離心、超濾、鹽析、有機溶劑沉淀技術中的一種；(2)將收集液進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間的測定和水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定，取同時具有二者活性的組分。
3.根據權利要求2所述的蛇毒提取物，其特征在于，所述及的離子交換層析技術的具體步驟如下蛇毒溶于溶于起始pH為5～10的起始緩沖液緩沖液，2～25℃透析過夜，然后取出，離心，離心條件為，2～25℃，3000～10000g，時間為5～60min，取上清；陰離子層析介質最優的使用SOURCE 30Q，陰離子層析的柱體積為6～600ml，流速為0.5～50ml/min；用起始緩沖液平衡3～8倍柱體積；上樣量為2～200ml；先用1～5倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B)，B從0～100％，洗脫20倍CV；取既能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又能水解活化C蛋白特異顯色肽底物中的收集液。
4.根據權利要求1至3任一所述的蛇毒提取物，其特征在于，所述及的蛇毒選自蝮蛇毒、烙鐵頭蛇毒、蝰蛇毒、尖吻蝮蛇毒、眼鏡蛇毒、眼鏡王蛇毒、金環蛇毒、竹葉青蛇毒或白眉蝮蛇毒。
5.一種蛇毒提取物的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)蛇毒的分離純化，選自離子交換層析技術、凝膠過濾層析技術、親和層析技術、疏水層析技術或離心、超濾、鹽析、有機溶劑沉淀技術中的一種。(2)將收集液進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間的測定和水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定，取同時具有二者活性的組分。
6.根據權利要求5所述的蛇毒提取物，其特征在于，所述及的離子交換層析技術的具體步驟如下蛇毒溶于溶于起始pH為5～10的起始緩沖液緩沖液，2～25℃透析過夜，然后取出，離心，離心條件為，2～25℃，3000～10000g，時間為5～60min，取上清；陰離子層析介質最優的使用SOURCE 30Q，陰離子層析的柱體積為6～600ml，流速為0.5～50ml/min；用起始緩沖液平衡3～8倍柱體積；上樣量為2～200ml；先用1～5倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B)，B從0～100％，洗脫20倍CV；取既能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又能水解活化C蛋白特異顯色肽底物中的收集液。
7.根據權利要求1至4任一所述的蛇毒提取物在制備預防和治療膿毒癥的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種同活化C蛋白功能相似的蛇毒提取物，該提取物在體外既能顯著延長人血漿活化部分凝血活酶時間又能水解活化C蛋白特異顯色肽底物，在體內它能顯著降低膿毒癥試驗動物的死亡率。本發明還公開了該提取物的制備方法，蛇毒的分離純化，選自離子交換層析技術、凝膠過濾層析技術、親和層析技術、疏水層析技術或離心、超濾、鹽析、有機溶劑沉淀技術中的一種，將收集液進行延長人血漿活化部分凝血活酶時間的測定和水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測定，取同時具有二者活性的組分。該蛇毒提取物可用于制備預防和治療膿毒癥的藥物，同活化C蛋白相比，具有來源方便，生產簡單易行，成本低等優點，有非常重要的經濟和社會意義。
文檔編號A61P17/00GK1846713SQ20051002505
公開日2006年10月18日 申請日期2005年4月13日 優先權日2005年4月13日
發明者馮軍, 趙文杰, 朱寶泉 申請人:上海醫藥工業研究院