Esc42蛋白及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：Esc42蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、生物信息學、生殖生物學、分子免疫學和醫學領域。具體地說，本發明涉及一種新的人附睪特異表達基因ESC42編碼產生的與男性生育有關的蛋白質的生物學功能及應用。所涉及到的生物技術有人附睪cDNA文庫的構建、人附睪特異表達基因ESC42的篩選、克隆、表達及單抗的制備，還涉及到該表達蛋白在男性生殖、避孕、抗感染和抗腫瘤等方面的用途。
背景技術：
生物技術是20世紀末生命科學領域最令人矚目的高新技術。為人類疾病的防治，解決人口膨脹、能源匱乏、環境污染等問題帶來了希望。生物技術和信息技術是21世紀關系到國家命運的關鍵技術，是創新產業的源泉。
從我國人口與健康，特別是男性生殖健康的重大需求出發，以重要的雄性生殖器官——附睪為研究系統，引進先進的生物技術，集中研究附睪中與精子成熟相關的基因及表達蛋白的功能，為雄性生殖調控理論的發展和突破作出原創性貢獻，并為男性避孕藥的研制、男性不育癥的診斷治療和日趨嚴重的性傳播疾病的防治等提供理論指導，為人類健康作出我們的貢獻。
當今人類的發展面臨著兩個嚴峻的問題一方面，全球人口在急速膨脹，預計在2050年將達到90億；另一方面，約15％的夫妻卻不能正常生育。長期以來，避孕和不育治療是生殖生物學所要解決的兩個關系到國計民生的重大問題。雖然現有的人工生育技術能在一定程度上解決某些不育問題，但其花費昂貴，而且其安全性也受到質疑。世界衛生組織預測，隨著環境污染和性傳播疾病等一系列致病因素的存在和增加，在21世紀，不孕癥將成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大疾病。
全世界人口的急劇增長造成了資源耗竭和環境惡化，成為人類健康與生存的嚴重威脅。目前可供人類選擇的避孕措施還很有限，離“高效、安全、可逆”的標準還相差較遠。因此，研發新型避孕藥物和措施已是當今生殖生物學家所必須面對的問題。上個世紀70年代在我國發展起來的通過服用棉酚來達到避孕目的的技術，由于長期服用帶來的低血鉀和不可逆性不育的毒副作用已從80年代終止使用。90年代我國科學家和國際合作者在臨床上嘗試用高劑量庚酸睪酮(TU)或長效睪酮(T)作為男性避孕藥，通過抑制垂體促性腺激素釋放來降低睪丸內源睪酮的水平從而抑制精子發生。但高劑量和長期使用使志愿受試者出現乳房增大、高密度脂蛋白下降、睪丸萎縮和性功能下降等副作用。生殖學家很早就注意到隱睪癥患者不育的現象，從而提出利用升高溫度達到避孕目的的設想。近年來有許多來自細胞和分子生物學的證據表明實驗性隱睪或短期熱休克處理(43℃，20min)能夠引起大量精母細胞和圓形精子細胞的凋亡從而減少正常精子的數目。但是目前臨床上還沒有這類可行的避孕技術。我們認為未來男性避孕有兩條路線可循一是將上面提到的幾種已知避孕措施進行不同的組合，并調整用藥劑量和使用時間，找出一種最佳避孕方案；二是利用當今基因組學時代所有可利用的資源和技術，研發新一代男性避孕藥物。在這一方案中，我們認為附睪特異表達的蛋白質是十分理想的避孕藥靶。因為它們不影響精子的發生，藥物的作用可逆性好。另外，世界衛生組織預測，在21世紀，不育癥將成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大疾病。目前在我國，約有15％的育齡夫婦存在著生殖障礙，其中男性約占一半。由于精子發育障礙不能自然受精，需要醫生通過精子顯微注射試管嬰兒獲取后代。因此，研究避孕和男性不育，應作為我國目前科研的重要研究方向之一。
精子在睪丸中產生后，必需經過附睪孵育后才能成熟具備受精功能。附睪內任何一種蛋白異常，都可能影響精子的發育成熟。目前發現，附睪管腔中大約200余種分泌蛋白，人們對其功能知之甚少。70年代末，人們致力于附睪流體的主要蛋白的純化。在純化蛋白產生抗體后，用抗體篩選cDNA表達文庫，得到兩個大鼠附睪特異性基因E-RABP(B/C)和AEG(D/E)。澳大利亞Holland實驗室運用抗REP38多抗對兔附睪文庫進行免疫篩選，得到了REP38-cl克隆。美國的Orgebin-Crist實驗室應用2-D電泳技術發現了3個能和精子結合的附睪分泌蛋白，用微量蛋白測序技術測定它們的N端序列，發現其中兩個是E-RABP和AEG在小鼠中的同源物，而另一個則是小鼠磷脂結合蛋白(Phospholipid-binding protein)。該領域雖然取得了這些結果，但由于蛋白質分離純化技術的困難，進一步的研究未能得到展開。絕大部分蛋白的順序和功能都未能得到鑒定。
90年代以來由于分子生物學技術的日新月異，幾個實驗室采用了不同的分子克隆技術來研究和克隆附睪特異基因。(1)利用動物同源序列設計探針篩選人附睪cDNA文庫，但由于物種間DNA順序的差異，并非所有基因的篩選工作都能成功；(2)德國的Kirchhoff實驗室應用差別篩選(Differential Screening)的方法，克隆人(老年前列腺癌患者)的附睪特異基因，他們用人附睪和人睪丸cDNA探針分別去篩選人附睪cDNA文庫，對只和附睪探針雜交的克隆在第二輪用人肝和腦cDNA探針進行篩選，結果選出6個附睪特異性新基因HE1-HE6。其中HE2具有defensin-like結構，研究表明HE2α的C端片段具有抗大腸桿菌的活性[25]。(3)用同樣方法又對狗附睪進行了研究，與人相對應的CE1，CE4和CE5被克隆，后來在人附睪未被發現的CE7/GPX5和CE8-CE10也被克隆。(4)Hall實驗室用附睪cDNA探針去篩選附睪cDNA文庫，選出那些具有很強雜交信號的克隆(也就是具有較高豐度的克隆)。通過進一步分析測序得到4個附睪特異性的基因，其中prE17對應于D/E，prE23對應于B/C，prE15報道并命名為EAP-I。后來該實驗室又得到猴CD52/HE5和ESP14.6/HE1。猴cy-ESP13.2在1999年被克隆，利用此克隆篩選猴附睪cDNA文庫，分離到12個不同的克隆，其中pcy-ESP13.2-a和pcy-ESP13.2-b序列最長[32]。由于差別篩選方法中所用cDNA探針的復雜性，只適合于篩選很高豐度的克隆，對中等豐度和低豐度的克隆并不適合；(5)2001年，中科院上海生化研究所張永蓮院士實驗室與美國北卡大學French實驗室合作，采用差減雜交方法，構建了一個猴附睪特異的cDNA文庫。用猴睪丸，肝和腦作負對照，進行與Kirchhoff實驗室類似的兩輪篩選。除了篩選到一些已在人，猴和其它動物被報道的附睪特異基因如HE1，HE3，HE5，HE6，GPX5，EAPI和ARP外，還得到約30個新的猴附睪特異表達的克隆(11個是全長cDNA)。其中ESC-42在附睪頭部高表達，定位在染色體20q11.1-11.22上，含半胱氨酸富集區，與三葉草家族同源。猴的與人的cDNA有94％的同源性，編碼的蛋白有89％的同源性。ESC-42的N端與靠近HE2C端的57個氨基酸有48％的同源性，因此，推測其具有抗菌功能。ESC-461屬于RNaseA家族，其核糖核酸酶樣功能未見報道。同年，Katherine G等從獼猴附睪中，克隆到CST11基因，用其重組蛋白50ug/ml與大腸桿菌37℃培養2小時，可以觀察到它的抗菌活性。(6)何彬等用DD-PCR的方法克隆到大鼠兩個新基因Bin1b和Bin2a。其中Bin1b只在附睪頭部表達，同源分析表明，它可能是β-defensin家族成員，并通過附睪上皮細胞的體外培養及反義核酸技術證明了它的抗菌活性。2002年，用同樣的方法，LI.Y等克隆到小鼠cystatin multigene家族的兩個新成員，其中cystain TE-1在附睪和睪丸中表達，其結構含有高度保守的4個半胱氨酸殘基，其功能尚不分清楚。(7)French實驗室通過EST測序發現幾個新附睪特異基因。這樣隨著分子克隆技術的發展，部分附睪特異基因被克隆和發現，使我們對精子在附睪中的成熟過程有了一定的了解。
由于正常人的附睪組織來源困難，限制了對人附睪基因和表達蛋白的研究進展。盡管德國實驗室已建立了人的附睪cDNA文庫，但由于是老年前列腺癌患者的附睪組織，不能代表健康年青人附睪中的基因表達狀況。基于以上想法，我們研究室2002年利用一個正常青年人外傷死后捐獻的附睪組織建立了附睪cDNA文庫，正在運用大規模測序及生物信息技術篩選新的附睪特異基因。從我們建立的人附睪cDNA文庫中獲得人附睪ESC-42的cDNA序列。人ESC-42蛋白質序列與猴有90％的同源性，與小鼠有28％的同源。PROSITE掃描分析顯示，轉錄后加工位點含1個天冬酰胺的糖基化位點、4個PKC磷酸化位點以及酪激酶磷酸化位點。目前已利用基因工程的重組技術生產出蛋白，并成功制備出單克隆抗體。經Genbank上查詢，迄今為止，只有16個附睪特異蛋白的全長cDNA被克隆。研究這些基因的功能將比獲得這些蛋白的cDNA序列任務更艱巨。完全弄清楚這種程序化的基因表達和精子成熟過程之間的關系還需要大量的艱苦的工作。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的具有多種生物活性的人附睪特異表達蛋白ESC42及編碼序列。
本發明的另一目的是提供分離純化、生產hESC42蛋白的方法。
本發明的另一目的是提供與ESC42蛋白特異性結合的單抗及由此而建立的ESC42蛋白的檢測方法。
本發明的另一目的是提供hESC42蛋白在抗菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤以及在治療男性不育癥和開發避孕藥等方面的用途。
本發明提供一種新的人附睪特異表達蛋白ESC42(hESC42蛋白)及編碼序列。該蛋白是人附睪上皮細胞分泌的一種具有β-defensin樣結構的抗菌肽。人ESC42基因由附睪組織特異表達，其編碼基因定位在20q11號染色體上，全長cDNA由589堿基組成(堿基序列見序列表SEQ ID NO1)，編碼123個氨基酸(氨基酸序列見序列表SEQ ID NO2)，等電點pI＝6.88，分子量為11978.12Da。。據SignalP分析，其功能區具有6個半胱氨酸，與β-defensin家族具有相似的結構，提示具有潛在的抗菌功能；ESC42含有明顯的信號肽(1-20aa)，提示其可能為分泌蛋白；29-32位為N端糖基化位點，58-101位為2個酪氨酸激酶II磷酸化位點，47-99位為3個蛋白激酶C磷酸化位點，111-116位為N端myristoylation位點。人ESC-42蛋白質序列與猴有90％的同源性，與小鼠有28％的同源。
本發明還提供生產人ESC42蛋白(hESC42蛋白)的方法。天然人ESC42蛋白存在于人附睪分泌液中，用于科研、藥物開發的人ESC42蛋白，可以采用下列方法之一制備1、根據序列表SEQ ID NO2所述ESC42蛋白的氨基酸序列，用固相化學方法合成蛋白。
2、基因工程技術生產。根據GenBank公布的ESC42cDNA序列(No.AF34073)設計上下游引物，從本室構建的人附睪cDNA文庫中擴增人ESC42基因，將基因克隆于重組表達載體，并將重組后的DNA轉化宿主細胞，通過原核和真核細胞表達蛋白，純化后的蛋白經過Westernblot、基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜進行肽指紋圖譜分析和分子量鑒定。
本發明還提供能與ESC42蛋白特異性結合的單克隆抗體和檢測ESC42蛋白及異常表達的方法。將純化的EST42融合蛋白與等體積的福氏完全佐劑混勻后免疫小鼠，制備、篩選雜交瘤細胞，制備腹水，純化獲得能夠與hESC42特異性結合的單克隆抗體。采用該抗體制備ELISA檢測試劑盒、免疫熒光檢測試劑盒、放射免疫試劑盒、免疫組化試劑盒和蛋白質芯片，可從精子、精漿和細胞培養上清等多種樣本中特異性檢測hESC42蛋白的表達水平與差異，在科研和不育癥的診斷中有重要應用價值。
本發明還提供了rhESC42蛋白的多種生物功能，該蛋白可用于治療人和動物的細菌、真菌、病毒感染和腫瘤等疾病，是一種可供開發和有廣泛臨床應用前景的藥物組合物。其主要用途如下1、抗菌作用。純化的rhESC42蛋白在體外實驗研究證明能夠抑制G+菌和G-菌的生長，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及臨床分離耐藥菌株大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、霉菌都有抑菌作用，其最低MIC50的藥物濃度為25μg/ml。
2、抑瘤作用。將腫瘤細胞株與純化的rhESC42蛋白共同孵育，腫瘤細胞生長受到明顯的抑制作用。隨著蛋白濃度的增加其殺傷效率逐漸上升，其MIC50最低抑制濃度為25ug/ml。
3、rhESC42蛋白可能為開發男性避孕方法提供新的途徑。該蛋白與精子運動和精卵結合有關，封閉該蛋白或敲除其編碼基因，可能達到避孕的目的。
4、rhESC42蛋白可能作為治療男性不育癥的有效藥物成分。通過抗ESC42抗體進行免疫定位，發現了ESC42在精子頭頸部有明顯的表達。說明精子在通過附睪的過程中與該蛋白結合，從而獲得運動和受精能力。如果病人該蛋白未正常表達，受精能力減弱。將弱精子與hESC42蛋白共同孵育，可改善受精能力，治療不育癥。
本發明中所指的多肽與ESC42蛋白、ESC42多肽和抗菌肽可互換使用。
具體實施例方式
實施例一構建健康年輕人附睪組織cDNA文庫1、總RNA的提取取意外事故死亡者捐獻的人附睪組織，提取總RNA、純化與鑒定。取一完整附睪組織，稱重，迅速加入Trizol，剪碎，電動勻漿，室溫放置，參照Trizol試劑說明書提取總RNA，采用紫外分光光度計在260nm和280nm波長下比色鑒定其濃度和純度，用1.1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性。總RNA提取后，A260/A280＝1.85，1.1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳可見28S和18S及5S三條亮帶，其中28S∶18S亮度比值約為2∶1，清晰無降解(

圖1)。2、cDNA第一鏈合成0.5ml離心管中依次加入人附睪組織中RNA lug，SMART IV寡核苷酸，CDS III 3’引物，滅菌水，混勻，72℃2min，置冰上2min，終止反應。再依次加入5×第一鏈緩沖液，DTT，dNTP混合物，逆轉錄酶，混合，42℃孵育1小時后置冰上終止反應。3、LD-PCR方法合成雙鏈cDNA在PCR反應管中依次加入下列物質雙鏈cDNA滅菌去離子水，10×PCR緩沖液，50×dNTPs，5’PCR引物，CDS III 3’引物，50×多聚酶混合物，總體積100ul，混勻，PCR循環。用1.1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙鏈cDNA分布范圍為200bp～4kb，呈涂布狀(圖2)，沒有特異帶型，完全符合哺乳動物細胞mRNA分布規律，其中＜500bp的片斷在隨后的步驟中除去。
4、PCR產物的抽提純化和分級分離取50ul雙鏈cDNA，用蛋白酶K滅活DNA聚合酶，用酚氯仿異戊醇對PCR產物進行抽提純化，用Sfi I酶進行酶切。酶切產物用CHROMASPIN-400柱子進行分級分離，并收集單滴組分，連續收集16管，每管分別取3ul進行1.1％瓊脂糖凝膠電泳，收集前4個含有cDNA的組分，將4管純化產物并在一個滅菌的離心管中，進行乙醇沉淀回收。
5、cDNA與載體pDNR-LIB連接按照cDNA∶載體＝1∶1的比例進行連接，孵育過夜。向反應體系內加入滅菌水，糖原，冰冷的95％乙醇，混勻后，-70℃放置1小時，離心，棄上清后用5ul滅菌水重懸連接產物。
6、電轉化與滴度滴定取5ul連接產物與25ul電轉化感受態細胞進行電轉化，宿主菌為大腸桿菌XL1-Blue，電擊后立即加入1ml LB培養基，37℃搖床培養，連續稀釋法滴定細菌培養液，取1μl菌液，用1ml LB培養基稀釋后，取100ul鋪到氯霉素抗性的LB平板上，倒置，37℃過夜培養，記數平板上菌落數，文庫滴度(cfu/ml)為2×107cfu/ml。
根據所檢測的文庫滴度來計算需要的150mm平板數，LB培養基稀釋文庫菌液后涂氯霉素抗性的LB平板，倒置，37℃過夜培養。隨機挑取14個克隆至滅菌水中，煮沸，各取1ul加入含有10×PCR緩沖液，dNTPs，M13上游引物，M13下游引物，50×多聚酶混合物的PCR反應體系中。反應結束后，用1.2％瓊脂糖凝膠電泳進行cDNA文庫的鑒定，其中有13個克隆含有插入子，擴增片段中＞700bp的有3個，＞1kb的有2個(圖3、4)，表明已經成功獲得了人附睪組織cDNA的重組質粒，轉化效率較高92.8％。
實施例二從文庫中釣取人附睪特異性表達基因ESC42根據GenBank中報道的基因的mRNA序列設計兩對引物，ESC42上游引物5’-CGGAATTCTACAGCGGTGAAAAAAAATGC-3’，下游引物5’-TCCCCCCCGGGAAGTCATGAGCTATGGTGAAC-3’，取人附睪cDNA文庫1ul作為模板，在ESC42引物參與下行PCR擴增，成功擴增出目的片段(圖5)，擴增產物用2.0％的瓊脂糖電泳膠鑒定其長度為333bp。
實施例三原核表達載體重組表達hESC42蛋白1.ESC42原核表達質粒的構建根據人ESC42的序列設計去信號肽上、下游引物5-GGAATTCCATATGTACAGCCGGTGAAAAAAAATGC-3；5CGGAATTCAAGTCATGAGCTATGGTGAAC-3。分別含有EcoRI和NdeI酶切位點(橫線表示)。
2.pET-ESC42質粒的重組和篩選取文庫1μl進行PCR，同時設β-actin為陽性對照。擴增條件為94℃變性2min，94℃30s，60℃1min，68℃2min，30個循環，68℃延伸7min。將擴增的產物先用NdeI酶切過夜，再用EcoRI 37℃酶切1h，電泳回收大片段；載體pET-25b(+)用NdeI和EcoRI進行雙酶切，回收大片段，二者按3∶1摩爾比混勻，以T4連接酶連接后轉化大腸桿菌BL21，定向連接，命名為pET-ESC42。用PCR方法篩選陽性克隆。從人附睪cDNA文庫中，先擴增含信號肽序列391bp，再擴增去信號肽片段，目的片段預期長度為333bp，β-actin內參323bp片段。
3、重組質粒的酶切鑒定和測序鑒定挑選陽性克隆進行質粒提取，方法參照Qiagen質粒提取試劑盒。用EcoRI和NdeI進行酶切鑒定；最后用DNA序列測序鑒定。測序引物為T7通用引物。DNA測序表明，所獲克隆序列與理論序列完全一致，證明連入的片段是正確的4.ESC42蛋白的表達與純化我們從誘導溫度、IPTG的誘導濃度、誘導時間等幾個方面做了優化表達條件的嘗試，最終選擇IPTG的終濃度為0.5mmol/L，溫度為35℃，誘導3h表達量最高。經反復凍融并在冰浴中超聲裂解，功率300W，時間10秒，間隔30秒，共5次。10000r/min離心10分鐘，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定。用120型凝膠成像分析系統分析蛋白表達情況(美國，Kodak公司)，表達量可達30％。誘導后的蛋白大部分表達在上清，將大部分表達在上清的蛋白用0.45μm濾膜過濾，過CM陽離子柱，用醋酸鹽緩沖液平衡2個柱體積，于0.1mo/L Nacl濃度下洗脫目的蛋白，透析后定量，冷凍抽干。
5.Western blot鑒定分別將純化的ESC42蛋白進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后與特異性抗體進行Western blot，方法參考分子克隆。實驗中所用小鼠抗ESC42單抗(稀釋度分別為1∶500)，二抗分別為兔抗羊、羊抗鼠IgG/HRP(稀釋度為1∶10 000)，最后利用DAB進行顯色，PBS終止顯色。Anti-ESC42抗體能夠特異性與純化的ESC42蛋白5ng、10ng、100ng、200ng結合，且最低檢測到5ng，表明此抗體靈敏度很高。
6.質譜鑒定①分子量分別取1mg/ml的蛋白1μl和基質B(芥子酸)9μl，徹底混勻，于上樣板上點樣，干燥5min后上Voyage-DETMSTR質譜儀(美國，Applied Biosystems公司)，用來鑒定hESC42的分子量為11978.12Da，與預算的理論值11961.24Da基本相符，誤差在0.01％。②測定的肽質量指紋圖譜從考馬斯亮藍染色、脫色后的膠中回收ESC42蛋白質，空氣干燥后加入10μl胰酶液吸脹，37℃過夜。50μl萃取液(50％乙腈，5％三氟乙酸)室溫放置1h，重復2次，合并上清，真空干燥。取樣品和基質各1μl混合后上質譜，得到肽指紋圖譜(見附圖1)。③經質譜檢測出的ESC42的氨基酸覆蓋率為mkllllalpm lvllpqvipa ysgekkcwnr sghcrkqckd geavkdtckn Iraccipsne dhrrvpatsp tplsdstpgiiddiltvrfttdyfevsskk dmveeseagrgtetslpnvh hss其覆蓋率為48％7、生物信息學分析通過功能區分析顯示ESC42具有6個半胱氨酸(C-X6-C-X3-C-X9-C-X5-CC)，與β-defensin家族(C-X6-C-X4-C-X9-C-X6-CC)具有相似的結構，提示具有潛在的抗菌功能。其序列如下β-defensin氨基酸序列VSCRRNGGICVPIRCPGHMRQIGTCFGPRVK CCESC42氨基酸序列(6個半胱氨酸陣列)KKCWNRSGH C RKQCKDGEAVKDTCKNLRACC實施例四利用真核表達系統生產rhESC42蛋白1、hESC42基因的擴增根據GenBank(AL031650)中人ESC42的序列設計兩對引物。含信號肽序列上游引物分別為5‘CGGAATTCATGAAACTCCTGCTGCTGCT-3’下游引物5‘GGGGTACCCCTGAGCTATGGTGAACATTTGG-3’；分別含有EcoRI和KpnI酶切位點。從人附睪cDNA文庫中進行擴增，先擴增含信號肽序列，再擴增去信號肽片段。反應條件為95℃變性45s，60℃退火45s，68℃延伸1min，共進行30個循環。同時設β-actin為陽性對照。可得到預期長度為333bp的目的片段。
2、pEGFP-N1-ESC42真核表達質粒的構建將純化的PCR產物用EcoRI和KpnI酶切，回收大片段。載體pEGFP-N1用同樣的酶進行雙酶切，回收大片段，二者按1∶3比例混勻，以T4連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5α，用PCR方法篩選陽性克隆。命名為pEGFP-N1-ESC42。
3、pCDNA3.1-ESC42真核表達質粒的構建將純化的pEGFP-N1-ESC42質粒用EcoRI和KpnI酶切，回收小片段。載體pCDN3.1用同樣的酶進行雙酶切，回收大片段，二者按1∶3比例混勻，以T4連接酶連接后轉化大腸桿菌XLI blue，用PCR方法篩選陽性克隆。命名為pCDN3.1-ESC42。
4、重組DNA的酶切鑒定和測序鑒定將陽性克隆用Qiagen質粒提取試劑盒提取，方法參照試劑說明。將pEGFP-N1-ESC42和pCDN3.1-ESC42質粒進行定量后，分別用于EcoRI和KpnI酶切和DNA序列測序鑒定，分別用GFP N端引物5‘CGTCGCCGTCCAGCTCGACCA-3’，T7通用引物(5‘TAATACGACTCACTATAGGG-3’)進行測序。
5、pEGFP-ESC42在亞細胞中的定位將上述構建成功的pEGFP-ESC42、pEGFP-N1載體、pCDN3.1和pCDN3.1-ESC42分別轉染HEK-293細胞，轉染方法按Invitrogen公司的產品說明進行。48h后在共聚焦顯微鏡下觀察發現在轉染空載體pEGFP-N1的細胞中，熒光呈彌漫性分布；而重組質粒轉染的293細胞，熒光位于細胞的一側，呈指環狀分布，為典型的分泌型表達模式。
6、RT-PCR鑒定ESC42的表達應用Trizol一步法分別提取轉染后細胞的總RNA，經DNase I處理后，經逆轉錄和PCR反應擴增目的片段。反應條件為95℃變性45s，60℃退火45s，68℃延伸1min，共進行30個循環。以β-actin為內參照同時進行PCR擴增。擴增產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示，轉染pEGFP-ESC42質粒組有擴增的條帶，而空載體對照組沒有條帶，說明質粒已進入細胞并進行目的基因的轉錄。
7、ESC42蛋白的純化收集pCDN3.1-Esc42轉染的培養上清，純化過程按照ProBondPurification System系統操作手冊進行。
實施例五ESC42蛋白單克隆抗體的制備及應用一、ESC42單克隆抗體(mAb)的制備1.免疫方案40ug EST-ESC42融合蛋白與等體積的福氏完全佐劑完全混勻，小鼠多點皮下注射，3周后，再次多點皮下注射。3周后，20ug EST-ESC42融合蛋白腹腔注射。3周后間接ELISA檢測小鼠血清效價，大于10-4以上方可用于融合。融合前72小時腹腔注射融合蛋白加強免疫。
2.效價檢測包被ESC42，以正常小鼠血清為陰性對照。
3.制備飼養細胞融合前一天，取6-10周齡的小鼠的腹腔巨嗜細胞(106/ml)，96孔板100ul/孔。
4.細胞融合收集對數生長期的Sp2/0細胞，離心洗滌后與免疫小鼠的脾細胞混合，45％PEG作用90秒后，800rpm離心6分鐘，用20％FCS RPMI 1640重懸細胞，加入96孔板，100ul/孔，37℃，5％CO2孵箱中培養。
5.雜交瘤的選擇培養用HAT選擇培養基維持兩周后改用HT培養基，再維持2周后改用一般培養液。
6.陽性雜交瘤的篩選融合后第10-14天，以MS2-ESC42包被，用ELISA間接篩選陽性雜交瘤。
7.雜交瘤的克隆化，以有限稀釋法進行克隆化，一般克隆化檢測兩次以上100％陽性后，擴增培養陽性雜交瘤，收集細胞培養上清，制備腹水。
8.腹水的制備小鼠腹腔注射降植烷，1-2周腹腔注射雜交瘤細胞，7-14天可產生腹水，取腹水，2000rpm離心20min，收集上清二、ESC42單克隆抗體的鑒定1.間接ELISA鑒定mAb的特異性及腹水的效價，腹水梯度稀釋后，間接ELISA檢測效價。
2.MAb類和亞類的鑒定，按照試劑盒說明書進行。
3.辛酸硫酸銨沉淀法和離子交換層析法從腹水中純化mAb。
4.Western blot鑒定mAb與SDS-PAGE蛋白的反應性。
5.酶標抗體競爭結合實驗檢測mAb識別ESC42的表位。
6.免疫組織化學的方法對mAb進行鑒定。
7.免疫熒光染色法鑒定mAb與ESC42天然分子的反應性。
三、建立雙mAb夾心ELISA方法，用于檢測細胞培養上清、正常人和患者精漿可溶型ESC42的水平并分析與疾病的關系。
四、建立免疫熒光檢測法，檢測正常人和不育癥精子ESC42蛋白的表達差異。
取正常人的精子液化后，經生理鹽水洗滌2遍，取10ul進行涂片，4％的多聚甲醛固定20分鐘。封閉液封閉10分鐘，加ESC42單抗(1∶1000)37℃1小時，PBS洗滌3遍，加FITC標記的羊抗鼠-IgG(1∶50)，37℃1小時，PBS洗滌3遍，封片后在共聚焦顯微鏡下觀察ESC42蛋白主要在精子頭部和頸部表達。ESC42是分泌蛋白，我們通過抗ESC42抗體進行免疫定位，發現了ESC42在精子頭頸部有明顯的表達。說明精子在通過附睪的過程中與該蛋白結合。
實施例六rhESC42蛋白的抗菌活性1、微量稀釋法細菌敏感試驗將標準菌株大腸埃希氏菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC29213，銅綠假單胞菌ATCC17853以及臨床分離耐藥菌株大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌分別用生理鹽水調整濃度為0.5號麥氏管濁度(108CFU/ml)，再將菌液用LB培養基稀釋成105CFU/ml，各取100ul于96孔板中；將蛋白濃度用LB培養基進行倍比稀釋使每孔終濃度為100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6μg/ml，陰性對照為不加蛋白組。陽性對照為慶大霉素(4萬u/ml)溶液。37℃過夜培養，次日，測OD490值顯示，應用不同的蛋白濃度作用細菌，隨著時間延長和蛋白濃度的增加其抑制率逐漸增加。
2、抑菌活性將大腸桿菌XL1-Blue生長至對數期(OD＝0.4)。用0.01mol PBS pH7.4稀釋到工作濃度。與100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，10μg/ml，5μg/ml終濃度的分泌上清37℃孵育過夜，PBS為陰性對照。分別將混合液鋪于LB板上。37℃倒置過夜，次日早晨數克隆數。其抑制率按公式 通過計算發現，蛋白作用組的細菌克隆數為隨著蛋白濃度的增高而減少，其抑制率與蛋白濃度成正相關。
3、電鏡觀察ESC42蛋白對細菌的作用將108CFU/ml大腸桿菌用10mM PBS pH7.4洗三遍，用50ug/ml ESC42蛋白37℃作用120分鐘，孵育后，用10mM PBS pH7.4洗三遍，用等量的4％戊二醛固定，樣本用0.1mol PB緩沖夜洗一次；1％鋨酸固定30分鐘。常規電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋、超薄切片，鈾鉛染色。透射電鏡觀察。ESC42蛋白作用的細菌形態變化呈時間依賴性，30分鐘后，細菌表面發生鄒摺，120分鐘后細菌膜表面變的粗糙和腫脹。這些結構的變化進一步證明蛋白對細菌胞膜產生作用，使其滲透性發生改變。
實施例七rhESC42蛋白的抗腫瘤活性1、腫瘤細胞藥物敏感實驗(MTT法)將標準腫瘤細胞株K562/S、K562/R、NB4分別進行復蘇，傳代，按105/ml細胞密度接種于96孔板中。次日，將蛋白濃度倍比稀釋使每孔終濃度為100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6ug/ml。65小時后加噻唑藍(MTT)溶液，20ul/孔。繼續孵育6小時，2000rpm/min 10分鐘，去上清，加100ul/孔DMSO，振蕩混勻。測OD490。計算殺傷率[1-(處理孔AOD490÷對照孔AOD490)]×100％。隨著蛋白濃度的增加其殺傷效率逐漸上升，其MIC50最低抑制濃度為25ug/ml。
2、顯微鏡觀察ESC42蛋白對腫瘤細胞的作用收集經ESC42蛋白作用的腫瘤細胞，置離心管中離心，800-1000/min，10分鐘；用0.01molPBS5ml重懸細胞；將細胞懸液吸入有瓊指空槽的離心管中；800r/min，10min.取出離心管內的瓊脂塊用戊二醛固定；用0.1mol PB緩沖夜洗一次；1％鋨酸固定30分鐘。常規電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋、超薄切片，鈾鉛染色。透射電鏡觀察發現ESC42蛋白作用于靶細胞，使胞膜通透性改變，最終導致靶細胞死亡。光學顯微鏡觀察，未經ESC42蛋白作用的細胞生長旺盛，細胞圓潤；經ESC42蛋白作用的細胞大部分損傷破裂。
3、流式細胞儀分析細胞周期分別取常規條件培養的和經ESC42蛋白(50mg·L-1)作用4h的NB4細胞，經PBS洗滌、離心后，將細胞注入振蕩的-20℃，700mL·L-1乙醇中固定，制成單細胞懸液，取該懸液100μL，加入碘化丙啶-DNA熒光染液500μL，4℃避光靜置30min，進行DNA熒光染色，經濾網過濾去除細胞團后上流式細胞儀，進行細胞周期分析發現NB4細胞在經過ESC42作用后，對細胞S期過程具有延遲或阻抑作用，其S期細胞比例有所減少，分析認為可能處于DNA合成期的細胞對ESC42更敏感。
表1 ESC42作用于NB4細胞的流式細胞儀分析(n＝3，x±s，％)

aP＜0.05，vs對照組。
4、rhESC42蛋白的溶血實驗取家兔血2ml，肝素抗凝，用2ml生理鹽水，洗3遍，2500rpm，5min。將所得紅細胞按其容積，用生理鹽水稀釋成5％混懸液。加100μl/孔于96孔板中，蛋白濃度為100ug/ml，50μg/ml，2μg/ml，12.5ug/ml，6ug/ml，陰性對照為生理鹽水，陽性對照為1％trton X-100，設三個重復孔。37℃過夜培養，次日，測OD490值。10-100ug/ml的蛋白濃度作用1h后沒有引起紅細胞的裂解。陽性對照1％triton X-100導致紅細胞完全裂解，陰性對照生理鹽水對紅細胞無裂解作用。說明rhESC42蛋白對正常細胞無損傷作用。
序列表1、一般信息(i)發明名稱ESC42基因表達蛋白其制備方法和用途(ii)序列數目22、SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度589bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ctaccacctc ctgcttccca aggaccatga aactcctgct gctggctctt cctatgcttg 60tgctcctacc ccaagtgatc ccagcctata gtggtgaaaa aaaatgctgg aacagatcag 120ggcactgcag gaaacaatgc aaagatggag aagcagtgaa agatacatgc aaaaatcttc 180gagcttgctg cattccatcc aatgaagacc acaggcgagt tcctgcgaca tctcccacac 240ccttgagtga ctcaacacca ggaattattg atgatatttt aacagtaagg ttcacgacag 300actactttga agtaagcagc aagaaagata tggttgaaga gtctgaggcg ggaaggggaa 360ctgagacctc tcttccaaat gttcaccata gctcatgact tcctctcggc tatcactcac 420ccctgtcctc agagtgataa actaagtcac atacagataa agcactgaaa acaccacagt 480gaccctccca ccccccacca atatgtaatt ctattaatag aaacagctgt gtaaagaagt 540ctaaaatttt cactatttcc aatgataaac tcttcagtgc tcttcttga 5893、SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度123aa(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2MKLLLLALPMLVLLPQVIPAYSGEKKCWNRSGHCRKQCKDGEAVKDTCKN 50LRACCIPSNEDHRRVPATSPTPLSDSTPGIIDDILTVRFTTDYFEVSSKK 100DMVEESEAGRGTETSLPNVHHSS 12權利要求
1.一種ESC42蛋白，其特征在于，具有序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的ESC42蛋白，其特征在于，該蛋白還包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中個別氨基酸的缺失、取代或修飾而得到的變異體或功能等同物。
3.根據權利要求1或2所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白可采用固相化學法合成。
4.根據權利要求1或2所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白可采用基因工程方法合成，利用SEQ ID NO1所述的DNA序列所編碼。
5.根據權利要求4所述蛋白的制備方法，其特征在于，表達載體是質粒。
6.根據權利要求4所述蛋白的制備方法，其特征在于，重組工程細胞是原核或真核細胞。
7.根據權利要求6所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述及的原核細胞主要包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。
8.根據權利要求6所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述及的真核細胞是酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞或昆蟲細胞。
9.一種能與權利要求1所述的蛋白特異性結合的單克隆抗體。
10.根據權利要求9所述的單抗，可用于制備酶標、免疫熒光、放射免疫、免疫組化、金標試劑盒或蛋白芯片，檢測ESC42蛋白的表達差異，可輔助診斷不育癥。
11.根據權利要求1或2所述的蛋白，是一種藥物組合物，以此作為有效活性成分，并混有一種或多種醫藥上可接受的載體或添加劑，用于生產對抗病原微生物感染或腫瘤性疾病的藥物。
12.一種可作為開發新的避孕藥的靶蛋白。
13.一種作為治療不育癥的藥物組合物。
全文摘要
本發明提供一種新的人附睪特異表達蛋白ESC42及編碼序列。該蛋白由人附睪特異表達基因ESC42所編碼。本發明還公開了該蛋白的制備方法，可以用化學方法合成，也可以通過基因工程技術生產；還提供了采用單克隆抗體特異性檢測ESC42蛋白的方法。另外，這種蛋白不僅可用于制備抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤藥物，還為開發新的避孕藥和治療不育癥提供新的靶位點。
文檔編號A61K38/17GK1840544SQ20051005963
公開日2006年10月4日 申請日期2005年3月30日 優先權日2005年3月30日
發明者李建遠, 王海燕, 沈肖方 申請人:李建遠