專利名稱：免疫tbid基因及其編碼的蛋白和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的基因治療，具體涉及基因工程方法構建免疫tbid基因(我們把它命名為Immuno-tbid)、上述基因編碼的蛋白及所述的基因和蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
背景技術：
隨著醫學新技術的不斷出現，原發性腫瘤，特別是早期診斷者的外科治療效果得到了明顯的提高。但是當腫瘤細胞發生遠隔器官的轉移后，尤其是泛發轉移者，常規的療法如化療、放療、手術治療等均不能達到徹底控制腫瘤的目的。分泌表達靶向促凋亡蛋白，誘導腫瘤細胞凋亡而殺滅腫瘤，這一思路將指導一些高效、低毒的腫瘤基因治療新方案的出現。
HER-2是一種由原癌基因編碼的表皮生長因子受體，在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤細胞中廣泛而高水平的表達，是一種公認的腫瘤標志物，而且，很多研究表明，HER-2陽性的乳腺癌預后往往很差，腫瘤表現出很強的轉移能力，目前還沒有行之有效的治療藥物和手段。通過對HER-2抗原的特異性識別，可望在對正常細胞不造成損害的情況下，實現對惡性腫瘤的特異性殺傷。
Bid(BH3Interacting Death Agonist；BH3相互作用促凋亡蛋白)是1996年發現的Bc1-2家族BH3亞家族的一個成員，具有促凋亡活性。Bid蛋白只含BH3結構域，通過它與Bc1-2和Bax等分子相互作用，當其在細胞內過表達時可以誘導細胞凋亡。
Bid的促凋亡活性主要依賴于Caspase-8的剪切。當有凋亡信號刺激時，Caspase-8活化并切割掉Bid蛋白N端片段，產生的Bid截短體片斷從細胞漿轉位到線粒體，引起多種與凋亡相關分子由線粒體中釋放，從而實現通過Cytc途徑和其它線粒體凋亡機制調節細胞凋亡。
將Bid截短體作為腫瘤殺傷效應分子其優勢在于，它是連接細胞凋亡內在和外在途徑的關鍵分子，通過內在途徑，放大外在途徑的凋亡信號，同時激活數條凋亡通路，引發級聯反應，使多個凋亡效應分子(caspase3，6，7和AIF)同時發揮作用。
發明內容
本發明的目的在于構建一種特異性強、活性高、免疫原性低、能持續殺傷腫瘤細胞的新型分子，提供一種免疫tbid基因、上述基因編碼的蛋白及所述的基因和蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
本發明的技術解決方案是免疫tbid基因，其具有序列表<400>1-2之一的序列。
由上述基因編碼的蛋白，其具有序列表<400>3-4之一的序列。
上述基因在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
上述蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
本發明應用了能特異性識別并結合HER-2陽性腫瘤細胞的單鏈抗體e23sFv基因(C.Richter King，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992；895867-5871和Chen SY，et al.Nature 1997；38578-80)，與綠膿桿菌外毒素PEA轉膜結構域編碼基因和活性截短型bid基因(tbid)融合。這樣，同時結合了抗體對腫瘤細胞的特異性識別功能和活性tbid對細胞的快速高效殺傷功能。本發明構建分泌型免疫靶向基因，表達分泌后產生能特異性地識別和殺傷腫瘤細胞的效應分子，無論是使用重組病毒直接進行瘤體和肌肉注射，或通過回輸基因修飾的淋巴細胞，抑或將基因的原核、真核表達產物通過肌肉、瘤體和靜脈注射入患者體內，均能在殺傷腫瘤細胞的同時產生免疫監視作用。這一兼具細胞免疫和體液免疫特點的基因治療策略同其它策略相比，具有明顯的優勢。
本發明所構建的免疫tbid基因具有以下特點①安全性——由于在N端融合了長的抗體和PEA序列，導致tbid分子不能正確折疊，因而這種融合蛋白在分泌后的轉移過程中和進入腫瘤細胞前，不具有的促凋亡活性。加之，免疫tbid效應分子通過抗體特異性地識別原發和轉移的HER-2陽性腫瘤細胞，而對正常組織細胞沒有識別和殺傷作用。另外，免疫tbid主要由人源化抗體和人自身蛋白構成，反復使用不會誘發體內產生中和抗體，而且細胞發生凋亡時不引起炎癥反應，所以治療的毒副作用較小。實驗中發現被修飾的淋巴細胞本身功能正常，回輸這種細胞將可以持續分泌效應蛋白。動物模型的抗腫瘤應用中也發現對除了HER-2陽性腫瘤組織以外的其他組織沒有毒性；②高效性——Bid是細胞凋亡通路中重要的信號傳導分子，向細胞中導入活性形式的tbid分子，不僅能夠激活caspases通路的凋亡效應，還可以促進AIF等不依賴caspases的凋亡誘導分子從線粒體中釋放，即使caspases被抑制也能啟動凋亡的發生，使其對腫瘤細胞的殺傷作用更直接，且效率更高；③持續性——免疫tbid基因轉染細胞后可長期表達，分泌進入血液循環系統，對機體進行長期的免疫監視。
本發明可望為HER-2陽性腫瘤的靶向治療提供一種新手段。
圖1為全長人bid基因的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。
圖2為截短型人bid基因(tbid61和tbid76)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。
圖3為pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76質粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。
圖4為pCMV-Immuno-tbid61或pCMV-Immuno-tbid76質粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。
圖5為人tbid61和tbid76基因轉染后，HeLa細胞的雙標間接免疫熒光染色圖(×200)。
圖6為人PEA-tbid61和PEA-tbid76基因轉染后，HeLa細胞的雙標間接免疫熒光染色圖(×200)。
圖7為轉染PEA-tbid61和PEA-tbid76基因后COS-7細胞生長狀況變化的曲線圖。
圖8為轉染PEA-tbid61和PEA-tbid76基因后，SKBR-3細胞Annexin V染色的流式細胞術分析圖。
圖9為免疫熒光顯示Imuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白在轉染細胞HeLa內的分布圖(×400)。
圖10為穩定分泌Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白的細胞培養上清的western blot鑒定圖。
圖11為不同的細胞上清與SKBR-3細胞培養后細胞計數結果的直方圖。
圖12為含有Immuno-tbid61蛋白的上清對細胞殺傷的特異性比較的直方圖。
圖13為Immuno-tbid61基因抗腫瘤應用研究中，腫瘤體積變化的曲線圖。
圖14為Immuno-tbid61基因抗腫瘤應用研究中，實驗動物生存期的曲線圖。
具體實施例方式
1.免疫tbid基因的構建本發明構建的免疫tb id基因包括三部分，分別為抗腫瘤表面抗原HER-2的單鏈抗體(e23sFv)，具有轉膜功能的綠膿桿菌外毒素(PEA)的轉膜結構域和具有誘導細胞凋亡功能的截短型Bid(tBid)。
(1)截短型bid基因(tbid)的克隆①全長bid基因的克隆提取人淋巴瘤Jurkat細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA。在PCR專用的薄壁管中依次加入反轉錄產物2μL、10×PCR buffer 5μL、50mM MgCl21.5μL、上下游引物(1E、2XS)各1μL、10mM dNTP 1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和H2O 38μL，進行PCR反應。PCR反應條件為96℃變性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸45秒；共進行20次循環。擴增出588bp(包括終止密碼子在內)的bid基因片段(參見附圖1，其中1PCRmarker(2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；2human bid gene(588bp))。將其克隆入載體pcDNA3一一命名為pcDNA3-bid，經序列測定，結果獲得的bid基因片段序列與GenBank中的序列完全一致。
1E5′-TTTGAATTCATGGACTGTGAGGTCAACAAC -3′2XS5′-TTTTCTAGAGTCGACTCAGTCCATCCCATTTCTGGC-3′②bid基因的截短在PCR專用的薄壁管中依次加入，pcDNA3-bid質粒1μL、10×PCR buffer 5μL、50mM MgCl21.5μL、上下游引物(2XS和3-61E或2XS和4-76E)各1μL、10mM dNTP 1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和H2O 398μL，進行PCR反應，擴增編碼61-195aa的tbid61基因(408bp；包括終止密碼子在內)和編碼76-195aa的tbid76基因(363bp；包括終止密碼子在內)(參見附圖2，其中1PCRmarker(2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；2tbid61(408bp)；3tbid76(363bp))。PCR反應條件為96℃變性30秒；55℃退火45秒；72℃延伸45秒；共進行20次循環。基因片段分別克隆入pcDNA3載體中，經酶切鑒定和測序證實。
3-61E5′-TTTGAATTCATGGGCAACCGCAGCAGCCACTCC-3′4-76E5′-TTTGAATTCATGTCTGAAAGTCAAGAAGACATC-3′(2)PEA-tbid61和PEA-tbid76融合基因的克隆在截短型bid基因(tbid61和tbid76)克隆成功的基礎上，與綠膿桿菌外毒素PEA的部分轉膜結構域(280-364aa)的編碼基因片斷，及線性化的pcDNA3載體進行連接反應，獲得重組質粒pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76，酶切鑒定證實(參見附圖3，其中1PCRmarker(2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；2pDNA3-tbid61/EcoR I+Xba I；3pDNA3-PEA-tbid61/EcoR I+Xba I；4pDNA3-PEA-tbid61/Hind III+Xba I；5pDNA3-tbid76/EcoR I+Xba I；6pDNA3-PEA-tbid76/EcoR I+Xba I；7pDNA3-PEA-tbid61/Hind III+Xba I)。
(3)Immuno-tbid融合基因的克隆將截短型bid基因(tbid61和tbid76)插入本室已的質粒pCMV-e23sFv-PEAII(253-364)-X中，替換“X”基因部分，得到包含有e23sFv-PEAII(253-364)-tbid61或e23sFv-PEAII(253-364)-tbid76融合基因的真核表達載體，經酶切鑒定(參見附圖4，其中1PCRmarker(2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；2pCMV-immuno-tbid61/EcoR I+XbaI；3pCMV-immuno-tbid61/Not I+Xba I；4pCMV-immuno-tbid76/EcoR I+Xba I；5pCMV-immuno-tbid76/Not I+Xba I)和序列測定后證實，分別命名為pCMV-Immuno-tbid61和pCMV-Immuno-tbid76。Immuno-tbid61和Immuno-tbid76的全序列分別為(1)Immuno-tbid61
aagcttatgaaacatctgtggttcttccttctcctggtggcagctcccagatgggtcctg 60tccgacgtccagctgacccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtc 120acaatgacttgcagggccaccccaagtgtaagttacatgcactggtatcagcagaagcca 180ggatcctcccccaaaccttggatttataccacatccaacctggcttctggagtccctgct 240cgcttcagtggcggtgggtctgggacctcttactctctcacagtcagcagagtggaggct 300gaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtcgtagcccacccacgttcggaggg 360gggtccaagctggaaataaaaggttctacctctggttctggtaaatcttctgaaggtaaa 420ggtgtgcagctgcaggagtcaggacctgaggtggtgaagcctggaggttcaatgaagata 480tcctgcaagacttctggttactcattcactggccacaccatgaactgggtgaagcagagc 540catggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccttacaatggtgatactaactac 600aaccagaagttcaagggcaaggccacatttactgtagacaagtcgtccagcacagcctac 660atggagctcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaaggagggtt 720acggactggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctccgcggccgcg 780aaaggcggcagcctggccgcgctgaccgcgcaccaggcttgccacctgccgctggagact 840ttcacccgtcatcgccagccgcgcggctgggaacaactggagcagtgcggctatccggtg 900cagcggctggtcgccctctacctggcggcgcggctgtcgtggaaccaggtcgaccaggtg 960atccgcaacgccctggccagccccggcagcggcggcgacctgggcgaagcgatccgcgag 1020cagccggagcaggcccgtctggccctgaccctggccgccgccgagagcgagcgcttcgtc 1080cggcagggcaccggcaacgacgaggccggcgcggccaacGgcaaccgcagcagccactcc 1140cgcttgggaagaatagaggcagattctgaaagtcaagaagacatcatccggaatattgcc 1200aggcacctcgcccaggtcggggacagcatggaccgtagcatccctccgggcctggtgaac 1260ggcctggccctgcagctcaggaacaccagccggtcggaggaggaccggaacagggacctg 1320gccactgccctggagcagctgctgcaggcctaccctagagacatggagaaggagaagacc 1380atgctggtgctggccctgctgctggcaagaaggtggccaagtcacacgccgtccttgctc 1440cgtgatgtctttcacacaacagtgaattttattaaccagaacctacgcacctacgtgagg 1500agcttagccagaaatgggatggactga 1527(2)Immun0-tbid76aagcttatgaaacatctgtggttcttccttctcctggtggcagctcccagatgggtcctg 60
tccgacgtccagctgacccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtc 120acaatgacttgcagggccaccccaagtgtaagttacatgcactggtatcagcagaagcca 180ggatcctcccccaaaccttggatttataccacatccaacctggcttctggagtccctgct 240cgcttcagtggcggtgggtctgggacctcttactctctcacagtcagcagagtggaggct 300gaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtcgtagcccacccacgttcggaggg 360gggtccaagctggaaataaaaggttctacctctggttctggtaaatcttctgaaggtaaa 420ggtgtgcagctgcaggagtcaggacctgaggtggtgaagcctggaggttcaatgaagata 480tcctgcaagacttctggttactcattcactggccacaccatgaactgggtgaagcagagc 540catggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccttacaatggtgatactaactac 600aaccagaagttcaagggcaaggccacatttactgtagacaagtcgtccagcacagcctac 660atggagctcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaaggagggtt 720acggactggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctccgcggccgcg 780aaaggcggcagcctggccgcgctgaccgcgcaccaggcttgccacctgccgctggagact 840ttcacccgtcatcgccagccgcgcggctgggaacaactggagcagtgcggctatccggtg 900cagcggctggtcgccctctacctggcggcgcggctgtcgtggaaccaggtcgaccaggtg 960atccgcaacgccctggccagccccggcagcggcggcgacctgggcgaagcgatccgcgag 1020cagccggagcaggcccgtctggccctgaccctggccgccgccgagagcgagcgcttcgtc 1080cggcagggcaccggcaacgacgaggccggcgcggccaactctgaaagtcaagaagacatc 1140atccggaatattgccaggcacctcgcccaggtcggggacagcatggaccgtagcatccct 1200ccgggcctggtgaacggcctggccctgcagctcaggaacaccagccggtcggaggaggac 1260cggaacagggacctggccactgccctggagcagctgctgcaggcctaccctagagacatg 1320gagaaggagaagaccatgctggtgctggccctgctgctggcaagaaggtggccaagtcac 1380acgccgtccttgctccgtgatgtctttcacacaacagtgaattttattaaccagaaccta 1440cgcacctacgtgaggagcttagccagaaatgggatggactga 14822.tbid基因及其表達產物活性的驗證將tbid61和tbid76基因克隆入熒光表達載體pIRES2-EGFP，構建成功pIRES2-EGFP-tbid61和pIRES2-EGFP-tbid76質粒。用脂質體包裹的方法，分別將pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-tbid61和pIRES2-EGFP-tbid76轉染入HeLa細胞。熒光顯微鏡觀察，空載體轉染組的細胞生長良好，pIRES2-EGFP-tbid61和pIRES2-EGFP-tbid76轉染的細胞，在轉染后12h即可見部分細胞內出現空泡，細胞體積發生固縮，至24h固縮的細胞熒光減弱而分散，許多細胞已不具有清晰的輪廓。結果表明，tbid61和tbid76基因轉染進入細胞后，引起細胞死亡程序的開放。
用脂質體分別包裹pcDNA3、pcDNA3-tbid61和pcDNA3-tbid76轉染HeLa細胞，20h后用Cy3標記的山羊抗人bid抗體和FITC標記的兔抗人細胞色素c抗體進行間接免疫熒光檢測，熒光顯微鏡觀察的結果顯示，pcDNA3-tbid61和pcDNA3-tbid76轉染組的細胞，細胞色素c的熒光標記轉移至細胞核的周圍，呈環簇狀存在，提示tBid可以促使細胞色素c從線粒體中釋放到細胞質中(參見附圖5)。
3.PEA-tbid61和PEA-tbid76融合基因及其表達產物活性的驗證(1)PEA-tbid61和PEA-tbid76在細胞內的表達用脂質體包裹pcDNA3、pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76轉染HeLa細胞，20h后用Cy3標記的山羊抗人bid抗體間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察的結果顯示，pcDNA3轉染組的細胞內有少量內源性的bid蛋白，而pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76轉染后的細胞著色較深，說明目的基因在細胞內大量表達(參見附圖6)。
(2)PEA-tbid61和PEA-tbid76基因轉染對細胞生長的影響PEA-tbid61和PEA-tbid76基因轉染COS-7細胞，于不同時間點取樣，進行噻唑藍(MTT)比色實驗，該實驗是檢測細胞存活和生長的重要方法，在一定細胞數范圍內，藍紫色結晶物形成的量(OD490nm值)與存活細胞數成正比。以490nm的光吸收值與時間做圖，顯示轉染目的基因后細胞生長狀況的變化(參見附圖7)。結果表明，與對照組相比，PEA-tbid61和PEA-tbid76融合基因的表達均可抑制COS-7細胞的生長。
(3)PEA-tbid61和PEA-tbid76的表達誘導細胞凋亡的發生①PEA-tbid61和PEA-tbid76的表達引發細胞色素c的釋放用脂質體包裹pcDNA3、pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76轉染HeLa細胞，20h后用FITC標記的兔抗人細胞色素c抗體進行間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察的結果顯示，與pcDNA3轉染組相比，pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76轉染后，細胞色素c的熒光標記轉移至細胞核的周圍，呈環簇狀存在，并出現典型的細胞皺縮及核固縮，核結構嚴重破壞，提示細胞色素c從線粒體中釋放到細胞質中(參見附圖6)。
②PEA-tbid61和PEA-tbid76融合蛋白引發磷脂酰絲氨酸外翻細胞凋亡早期，細胞膜表面會出現磷脂酰絲氨酸從細胞膜內側外翻，暴露于細胞膜外側，此時可以與Annexin V試劑結合而被檢測出來。Annexin V檢測是鑒定細胞凋亡的重要方法。脂質體包裹pcDNA3、pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76轉染SKBR-3細胞12h后，用Annexin V-FITC和PI染色，結果發現，與對照組相比，pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76轉染組的細胞呈現明顯的凋亡陽性，陽性率分別為10.9％和9.2％，說明融合基因PEA-tbid61和PEA-tbid76的表達可以導致細胞凋亡的發生(參見附圖8)。
③PEA-tbid61和PEA-tbid76基因表達后細胞的超微結構變化用脂質體包裹pcDNA3、pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76轉染HeLa細胞，固定并染色后，用電子顯微鏡觀察轉染細胞超微結構。結果發現，pcDNA3-PEA-tbid61和pcDNA3-PEA-tbid76轉染后的細胞，呈現典型的凋亡細胞特征如細胞膜表面微絨毛消失，核膜及細胞膜完整，細胞膜表面出泡，染色體凝集且聚集于核膜周邊。而未轉染細胞或轉染空載體細胞形態正常。
4.Immuno-tbid基因及其表達產物的腫瘤異性體外殺傷活性的驗證(1)Immuno-tbid61和Immuno-tbid76分泌型HeLa細胞系的建立將pCMV-e23sFv-PEA-tbid61(即pCMV-Immuno-tbid61)和pCMV-e23sFv-PEA-tbid76(即pCMV-Immuno-tbid76)用脂質體包裹后，轉染HeLa細胞。48h后進行免疫細胞化學染色，可觀察到Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白主要分布于內質網及高爾基體中，呈分泌表達模式，且Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白高表達對HER-2陰性的HeLa細胞無不良影響(參見附圖9)。
將轉染后的HeLa細胞，用800μg/mlG418篩選，3周后得到陽性克隆，擴大培養。收集建系HeLa細胞培養上清，除鹽并濃縮后進行Western blot檢測，可檢測到培養上清中Immuno-tbid蛋白的存在，由此證實篩選得到的HeLa細胞能持續分泌Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白。(參見附圖10)。
對篩選得到的細胞在不同時間進行細胞計數，并繪制細胞生長曲線，發現分泌Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白的HeLa細胞具有與未轉染HeLa細胞類似的生長曲線，表明轉染Immuno-tbid61和Immuno-tbid76基因后細胞能夠正常生長。
(2)Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白對HER-2陽性腫瘤細胞的特異性殺傷作用收集建系HeLa細胞培養上清，用于不同來源細胞的培養，研究Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白對腫瘤細胞的特異性殺傷活性。
首先，比較Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白對HER-2陽性乳腺癌細胞--SKBR-3殺傷作用的不同。以含有Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白的上清培養SKBR-3細胞，于不同時間點進行細胞計數。結果表明，Immuno-tbid61和Immuno-tbid76蛋白均能有效殺傷HER-2陽性腫瘤細胞，但以Immuno-tbid61蛋白的殺傷作用較強，并且殺傷率與培養時間有相關性。
(參見附圖11)以含有Immuno-tbid61蛋白的上清分別培養HER-2陽性的SKBR-3和SKOV-3細胞以及HER-2陰性的Hep2和ECV-304細胞，驗證殺傷作用是否具有靶向性。培養細胞每天換液，并進行計數，計算細胞的殺傷率。結果發現，HER-2陽性腫瘤細胞的生長明顯被抑制，而HER-2陰性腫瘤細胞——Hep2和正常細胞--ECV-304生長基本不受影響。充分表明，Immuno-tbid61蛋白對細胞的殺傷活性是具有靶向性的(參見附圖12)。
4.Immuno-tbid61和Immuno-tbid76基因及其表達產物的體內抗腫瘤應用皮下接種1～2×106SKBR-3細胞建立HER-2陽性荷瘤裸鼠模型。分別肌肉注射用脂質體包裹的pCMV空載體和pCMV-Immuno-tbid61重組質粒，觀察裸鼠存活時間的長短和測量腫瘤的體積變化。結果發現，治療組瘤體的生長速度明顯慢于對照組(附圖13)，治療組裸鼠存活期延長(參見附圖14)。
裸鼠組織石蠟切片的免疫組織化學染色結果顯示，Immuno-tbid61蛋白只選擇性地分布于治療組裸鼠的腫瘤組織中，在其他組織如心、肝、脾、肺、腎中，以及在對照組的腫瘤組織中，只檢測到少量內源性bid的表達。同時，只有實驗組的腫瘤組織中TUNEL染色呈陽性，表明Immuno-tbid61不僅能夠特異性的識別并結合于HER-2陽性的腫瘤組織，還通過引起腫瘤細胞凋亡而有效地殺滅腫瘤，而對分泌產生Immuno-tbid61蛋白的肌肉組織和其他正常組織細胞沒有殺傷，對其他組織沒有毒副作用。
序列表<110>楊安鋼<120>免疫tbid基因及其編碼的蛋白和應用<160>4<210>1<211>1527<212>DNA<213>人(homo sp.)和綠膿桿菌(Pseudomonas sp.)<220>
<221>CDS<222>(7)…(1524)<220>
<221>sig-peptide<222>(7)…(63)<400>1aagcttatgaaacatctgtggttcttccttctcctggtggcagctcccagatgggtcctg 60tccgacgtccagctgacccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtc 120acaatgacttgcagggccaccccaagtgtaagttacatgcactggtatcagcagaagcca 180ggatcctcccccaaaccttggatttataccacatccaacctggcttctggagtccctgct 240cgcttcagtggcggtgggtctgggacctcttactctctcacagtcagcagagtggaggct 300gaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtcgtagcccacccacgttcggaggg 360gggtccaagctggaaataaaaggttctacctctggttctggtaaatcttctgaaggtaaa 420
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<220>
<221>sig-peptide<222>(7)…(63)<400>2aagcttatgaaacatctgtggttcttccttctcctggtggcagctcccagatgggtcctg 60tccgacgtccagctgacccagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtc 120acaatgacttgcagggccaccccaagtgtaagttacatgcactggtatcagcagaagcca 180ggatcctcccccaaaccttggatttataccacatccaacctggcttctggagtccctgct 240cgcttcagtggcggtgggtctgggacctcttactctctcacagtcagcagagtggaggct 300gaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtcgtagcccacccacgttcggaggg 360gggtccaagctggaaataaaaggttctacctctggttctggtaaatcttctgaaggtaaa 420ggtgtgcagctgcaggagtcaggacctgaggtggtgaagcctggaggttcaatgaagata 480tcctgcaagacttctggttactcattcactggccacaccatgaactgggtgaagcagagc 540catggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccttacaatggtgatactaactac 600aaccagaagttcaagggcaaggccacatttactgtagacaagtcgtccagcacagcctac 660atggagctcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaaggagggtt 720acggactggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctccgcggccgcg 780aaaggcggcagcctggccgcgctgaccgcgcaccaggcttgccacctgccgctggagact 840ttcacccgtcatcgccagccgcgcggctgggaacaactggagcagtgcggctatccggtg 900cagcggctggtcgccctctacctggcggcgcggctgtcgtggaaccaggtcgaccaggtg 960atccgcaacgccctggccagccccggcagcggcggcgacctgggcgaagcgatccgcgag 1020cagccggagcaggcccgtctggccctgaccctggccgccgccgagagcgagcgcttcgtc 1080cggcagggcaccggcaacgacgaggccggcgcggccaactctgaaagtcaagaagacatc 1140atccggaatattgccaggcacctcgcccaggtcggggacagcatggaccgtagcatccct 1200ccgggcctggtgaacggcctggccctgcagctcaggaacaccagccggtcggaggaggac 1260cggaacagggacctggccactgccctggagcagctgctgcaggcctaccctagagacatg 1320gagaaggagaagaccatgctggtgctggccctgctgctggcaagaaggtggccaagtcac 1380acgccgtccttgctccgtgatgtctttcacacaacagtgaattttattaaccagaaccta 1440
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1.免疫tbid基因，其具有序列表<400>1-2之一的序列。
2.由權利要求1的基因編碼的蛋白，其具有序列表<400>3-4之一的序列。
3.如權利要求1所述的基因在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
4.如權利要求2所述的蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種免疫tbid基因、由所述基因編碼的蛋白、及上述基因和蛋白在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。本發明應用了能特異性識別并結合HER－2陽性腫瘤細胞的單鏈抗體e23sFv基因，與PEA轉膜結構域和活性截短型bid基因(tbid)融合構建了一種特異性強、活性高、免疫原性低、能持續殺傷腫瘤細胞的新型分子——免疫tbid基因。本發明構建分泌型免疫靶向基因，表達分泌后產生能特異性地識別和殺傷腫瘤細胞的效應分子，在殺傷腫瘤細胞的同時產生免疫監視作用。這一兼具細胞免疫和體液免疫特點的基因治療策略同其它策略相比，具有明顯的優勢。本發明所構建的免疫tbid基因具有安全性、高效性和持續性，本發明可望為HER－2陽性腫瘤的靶向治療提供一種新手段。
文檔編號A61P35/00GK1724666SQ200510067109
公開日2006年1月25日 申請日期2005年4月15日 優先權日2004年7月8日
發明者楊安鋼, 裘秀春, 許彥鳴, 賈林濤, 于翠娟, 趙晶, 張立紅, 王立鋒, 孟艷玲, 王智, 范清宇, 王成濟 申請人:楊安鋼