專利名稱：抗人cd45ra鼠免疫球蛋白可變區基因及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術，主要涉及抗人⑶45RA鼠免疫球蛋白ZCH-6-3A4(簡稱3A4) (單克隆抗體或單抗)可變區基因及其在制備治療血液系統惡性腫瘤靶向藥物中的用途。
背景技術：
血液系統惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病，早在20世紀70年代前，白血病被 認為是不治之癥，其病死率幾乎是100%。隨著世界各國對白血病診療的深入研究，新的抗 腫瘤藥物的不斷問世和造血干細胞移植的實施， 白血病的預后已經有了明顯的改善。但嚴 重的毒副作用仍然是臨床成功治療白血病的主要障礙，且復發耐藥的病例缺乏藥物選擇， 給治療帶來了極大的困難。近年來隨著分子生物學及抗體工程技術的進步，只殺傷腫瘤細胞而不損傷正常細 胞的白血病靶向治療得到了廣泛的關注和發展，其中單克隆抗體(單抗)導向的靶向治療 是該領域的主要方向。與化療比較，單克隆抗體靶向治療具有良好的選擇性和特異性，它們 只殺傷表達靶分子的細胞，而不損傷無靶分子表達的血細胞成分和組織器官細胞，從而可 大大提高靶向治療的特異性，降低藥物的全身毒副作用。有效的靶向治療取決于良好的先 導分子，系列特異性表面分化抗原單抗作為先導分子，將藥物或毒素特異地帶到腫瘤細胞 膜上或細胞內，或通過完整抗體激活補體(CDC)或通過抗體介導細胞毒(ADCC)作用以達到 殺滅白血病細胞的目的，有著無可替代的優勢。RituximaM商品名美羅華)是美國FDA 批準用于腫瘤治療的第一個單抗藥物，是一種非結合型人鼠嵌合型CD20單抗，其作用靶點 是⑶20抗原，主要在前B細胞和成熟B細胞上表達，95 %以上B系非霍奇金淋巴瘤(B-NHL) 病例淋巴瘤細胞上呈高表達，在成人B系NHL及⑶20+的ALL治療中取得令人滿意的療效。 在靶向藥物的研究中，為了提高靶向藥物對靶細胞的選擇性殺傷，減少對非靶向組織的毒 副作用，確定一個特異性強的單抗是首要問題。⑶45是白細胞共同抗原，⑶45分子三個外顯子A、B、C或稱4、5、6的可變剪接產生 了多種變構體，⑶45在白細胞表面廣泛表達，而在其它實體組織細胞上不表達，這最大限度 地避免了大多數化療藥物能造成多器官損傷的副作用[1]。目前國際上已經采用放射性核素 標記的⑶45抗體用于造血干細胞移植前的預處理。Glatting G利用111In標記的抗⑶45單 抗YAML568預處理8名骨髓移植患者，生物學分布檢測表明紅骨髓中的濃度明顯高于脾臟、 肝臟、腎臟等重要組織，在對骨髓產生明顯抑制的同時，機體其它重要臟器功能無明顯受損 [2]。John M在臨床I期試驗中發現，46位AML患者在HLA配型外周血干細胞移植前預處理 方案中采用131I-BCS鰲合白消安和環磷酰胺，達到了較理想的骨髓清除，結果顯示患者移植 排斥反應減輕，移植后存活率提高，與509名預處理中使用無放射免疫標記白消安和環磷 酰胺AML移植患者比較，前者的總體死亡率為后者的0. 65[3]。但是，普通⑶45抗體不能常 規用于一般靶向治療白血病，因為，其與造血組織的反應性過于廣泛，特別是其在所有T、B、 粒細胞、單核細胞、NK細胞、DC細胞表面均有表達，常規應用能產生嚴重的細胞免疫缺陷或 嗜中性粒細胞缺乏M。
⑶45RA是⑶45分子的一種變構體，在初始T細胞、B細胞、部分粒細胞、部分單核 細胞表面表達，而在活化T細胞、成熟紅細胞和血小板及機體實質器官組織細胞上不表達。 ⑶45RA僅與未刺激過的T細胞亞群(NaiVe τ)反應，而對已經受過抗原刺激并使機體對已 接觸過的抗原建立了免疫活性的記憶T細胞亞群(⑶45R0+)細胞不反應，因此，采用⑶45RA 作為分子靶向殺傷或治療時，應該不會破壞機體業已建立的細胞免疫功能，而受CD45RA抗 體清除的NaiVe T細胞雖會暫時失去對新病原體(如病毒)的免疫反應，但是，待治療結束 后，正常造血干細胞能產生后備的NaiVe T細胞可以彌補這種暫時性細胞免疫功能低下。 至于B細胞上有CD45RA高表達，這與CD20抗體類似，可以通過輸注丙種球蛋白來彌補暫時 的體液免疫功能缺陷。另外，⑶45RA在紅細胞和血小板上不表達，不會產生貧血和血小板 減少。因此，CD45RA應該是一種較為理想的靶向殺傷白血病細胞的靶點。但是目前國內外 尚無針對該抗原靶向治療的系統研究。在白血病的治療中，細胞毒性藥物可以殺死大部分的白血病細胞，骨髓常規甚至 流式細胞儀均不能檢測到白血病細胞。但是此時病人體內仍可能存在白血病干細胞，白血 病干細胞是白血病細胞中極微量的一群細胞，往往處于細胞周期之外，不能被常規的細胞 毒性藥物殺死，成為復發的根源。從理論上講，如果有單抗能夠識別白血病干細胞，就可以 通過該抗體藥物徹底治愈白血病。⑶34+⑶38-⑶123+被認為是髓系白血病干細胞的標志[5]。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種抗人⑶45RA鼠免疫球蛋白(ZCH-6-3A4單抗)重鏈 和輕鏈可變區基因，所述單抗的重鏈可變區基因具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列和其編碼 的SEQ ID NO 3的氨基酸序列；所述單抗的輕鏈可變區基因具有SEQ ID NO 2的核苷酸序 列和其編碼的SEQ ID NO 4的氨基酸序列。本發明的另一個目的是提供抗人CD45RA鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區基因 (ZCH-6-3A4單抗)在制備靶向治療血液系統惡性腫瘤藥物中的應用。研究表明，抗人 ⑶45RA單克隆抗體能夠有效識別白血病病人及白血病細胞株⑶34+⑶38-⑶123+的白血病 干細胞及⑶34+⑶38+⑶123+的子代白血病細胞，具有靶向治療白血病的應用前景。采用單抗靶向治療某種特定血液腫瘤的基本條件是抗體必須能識別某種血液腫 瘤細胞膜抗原。ZCH-6-3A4單抗具有良好的識別人白細胞膜CD45RA抗原而不識別成熟紅細 胞和血小板及機體實質器官組織細胞。體外實驗表明，3A4免疫毒素對3A4陽性的髓系白 血病細胞株具有良好的選擇性殺傷作用，而對3A4陰性的細胞卻無作用。進一步的研究表 明，3A4與細胞表面的抗原結合后能內化至細胞漿內，因此，以其為靶向分子制備免疫毒素， 有利于增加藥物對靶細胞的殺傷而減少對非靶組織器官的毒副作用。此外，白血病干細胞是白血病難治和復發的根源，捕獲并徹底清除白血病干 細胞使白血病患者治愈成為可能。3A4能夠識別白血病細胞株和白血病病人骨髓中的 ⑶34+⑶38-⑶123+的白血病干細胞，對于靶向白血病干細胞的研究和治療具有極為重要的意義。鼠源性單抗用于人體治療的主要障礙是異體蛋白與病人間產生免疫反應，從而產 生病人難以耐受的毒副作用，其根本原因是鼠源性免疫球蛋白(抗體)的Fc段對人體具有免疫原性，因此，有必要對鼠源性抗體進行人源化改造，而抗體的重鏈和輕鏈可變區基因序 列是研制人源化抗體的關鍵。本發明提供的抗人CD45RA新克隆鼠免疫球蛋白ZCH-6-3A4 單抗重鏈和輕鏈可變區基因(分別簡稱為VH3a4和VL3a4)序列，是以小兒未分化型急性淋巴 細胞白血病細胞作為免疫原，致敏Balb/C純種小白鼠，通過經典鼠-鼠雜交瘤單抗技術研 制成功的鼠抗人CD45RA膜抗原[國際分化簇(CD)命名為CD45RA]的單抗，該抗體已在第 7屆國際人類白細胞分化抗原協作組會議(HLDA7)上進行了全面鑒定并獲得了分化簇(CD) 命名ο由于鼠抗人⑶45RA抗體ZCH-6-3A4并非天然存在，而是需要刻意應用特定的抗原 進行免疫致敏動物，然后通過細胞融合、篩選、鑒定等一系列繁瑣而復雜的技術過程研制而 成，本發明完成了對該抗人CD45RA抗體(ZCH-6-3A4)重鏈和輕鏈可變區基因的克隆、測序 和完整3A4抗體免疫毒素體外靶向殺傷急性髓系白血病細胞株KGla細胞。尤其是3A4能 夠識別⑶34+⑶38-⑶123+細胞，對于白血病干細胞的研究具有極為重要的應用價值。而基 于該基因序列所研制的人源化基因工程抗體將可能對臨床血液系統惡性腫瘤靶向治療具 有十分重要的應用價值。
圖1. 3A4與KGla細胞株反應流式圖，3A4對美國Becton-Dickinson (BD)公司的抗 ⑶45RA單抗(克隆名L48)行阻滯實驗流式圖。圖2.鑒定3A4蛋白亞類流式圖。圖3. pGEM -T Easy/VH3A4 禾口pGEM _T Easy/VL3A4 酶切鑒定電泳圖。圖4.抗人⑶45RA抗原單抗ZCH-6-3A4的可變區重鏈基因(VH3a4)序列(兩個黑 色箭頭之間的序列)。圖5.抗人⑶45RA抗原單抗ZCH-6-3A4的可變區重鏈基因(VH3a4)序列(兩個黑 色箭頭之間的序列)。圖6.采用流式細胞術，以KGla細胞株為反應細胞，檢測不同溫度和孵育時間3A4 的內化程度。圖7. 3A4-去甲斑蝥素免疫毒素(3A4-NCTD)對CD45RA+的KGla和CD45RA-的 Nalm-6白血病細胞的靶向殺傷作用比較。圖8. 3A4單抗識別⑶34+⑶38-⑶123+KGla細胞株(8A)和初發髓系白血病患者骨 髓 CD34+CD38-CD123+細胞(8B)的能力。
具體實施例方式本發明結合附圖和實施例，作進一步的說明。實施例一本發明2個基因的核苷酸序列及氨基酸序列1、抗人⑶45RA鼠免疫球蛋白重鏈可變區基因(單抗ZCH-6_3A4VH3A4)的核苷酸序 列(SEQID NO 1)及氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。2、抗人⑶45RA鼠免疫球蛋白輕鏈可變區基因(單抗ZCH-6_3A4VL3A4)的核苷酸序 列(SEQID NO 2)及氨基酸序列(SEQ ID NO 4)。
實施例二流式細胞儀間標法檢測3A4識別抗原能力及檢測其對BD公司的抗CD45RA單抗 (克隆名L48)阻滯作用(圖1)，圖中IB為3A4與KGla細胞株反應流式檢測圖，IC為與BD 公司的抗⑶45RA單抗比較流式圖，ID為3A4對抗⑶45RA抗體的阻滯實驗流式圖。結果發 現，3A4與KGla細胞反應陽性率為99. 51%，MFI為432. 63，表明3A4抗體活性佳。圖IE 中峰1為陰性對照，峰2為阻滯后圖，峰3為未阻滯圖，表明3A4能完全阻滯BD公司的抗 ⑶45RA抗體與KGla的反應，提示抗⑶45RA抗體和3A4識別的為同一抗原表位。步驟如下1、計數KGla細胞，調整濃度至1 X 107ml，每個流式管取100 μ 1細胞懸液；實驗 設4個反應管，依次為Α.陰性對照管；B. 3Α4識別抗原能力檢測管；C.抗CD45RA單抗管； D. 3Α4阻滯抗⑶45RA單抗管。2、B管和D管加入3Α4培養上清50μ 1，4°C孵育30min ；3、加PBS IOOOg離心10分鐘，洗去未結合的3A4 ；4、A管和B管分別加入2 μ 1 GAM-FITC，C管和D管分別加入和2 μ 1CD45RA-FITC ；5、加PBS IOOOg離心10分鐘，洗去未結合的抗體；6、流式細胞儀檢測、分析。實施例三3Α4免疫球蛋白亞類的鑒定采用流式細胞儀間標法，KGla細胞株為反應細胞，以 3Α4為一抗，免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒為二抗，檢測不同免疫球蛋白為二抗時陽性率和平 均熒光強度，參見圖2，圖2為采用流式細胞術間標法，以KGla細胞株為反應細胞，3Α4為一 抗，以FITC標記的羊抗鼠免疫球蛋白亞類抗體為二抗，檢測不同二抗時的陽性率和平均熒 光強度(MFI)。結果發現IgGl FITC為二抗時陽性率為98. 48%，MFI 332. 85，Kappa FITC 為二抗時，陽性率為99. 02%, MFI為252. 20，表明3Α4抗體屬于IgGl κ。步驟如下1、計數KGla細胞，調整濃度至IX 107ml，每個流式管取100 μ 1細胞懸液；2、每管加3Α4培養上清50 μ 1，4°C孵育30min ；3、加PBS IOOOg離心10分鐘，洗去為結合的3A4 ；4、加入免疫球蛋白試劑盒中的二抗，分別為FITC標記的羊抗鼠IgGl、IgG2a、 IgG2b、IgG3、IgM、Ig κ、Ig λ，4°C避光孵育 30min ；5、加PBS IOOOg離心10分鐘，洗去未結合的二抗；6、流式細胞儀檢測、分析。實施例四本發明提供的2個抗人⑶45RA鼠免疫球蛋白可變區基因通過下列步驟獲得1、ZCH-6-3A4單抗的研制基本按Koller&Milstein報告的鼠-鼠雜交瘤經典方 法進行[6]，以小兒急性未分化型淋巴細胞性白血病(uALL)細胞(其免疫表型為HLA-DR+， CD19+，CD10-, CD33-，TdT+, CD7-，CD41a_)作為免疫原，將IO7白血病細胞給8周齡雌性 Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一次，共4次，于第4次注射后第3天，脫臼殺死小鼠，無菌取 脾細胞與處于對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株NS-I細胞(美國ATCC產品)按6 1混合， 以50%聚乙二醇(PEG，美國Sigma公司，分子量3350道爾頓)溶液作為融合媒介進行細胞融合，于96孔板(美國Falcon公司)中進行選擇性培養。于融合后第9 20天，隔日用 免疫原細胞對培養上清進行間接免疫熒光法(IIF)篩選。陽性孔細胞經3次克隆化并連續 2次100%孔達到陽性，即建立了能持續分泌3A4單抗的雜交瘤細胞系。經8個多月的連續 傳代培養和反復凍融，其分泌3A4單抗的能力穩定。以其腹水(熒光法效價1 3200)或 培養上清(熒光法效價1 16)作為3A4單抗的來源。2、3A4重、輕鏈基因(VH3a4、VL3a4)的擴增和克隆2. 1總RNA的抽提和處理收集3A4雜交瘤細胞8 X 106，以核糖核酸(RNA)抽提試劑盒(TRIZ0L液)按說明 書步驟抽提總RNA。最后溶于25μ1 DEPC(diethyl-pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水中，
并加入RNasin (核糖核苷酸酶抑制劑)至終濃度為IU/ μ 1 (單位/微升)。紫外分光 光度計測定Α260、Α280及其比值，瓊脂糖電泳觀察總RNA。進行逆轉錄-多聚酶鏈反應 (RT-PCR)前，取2 μ 13Α4總RNA，按照RQl (無RNA酶的DNA酶試劑盒)說明的方法，消化總 RNA中污染的基因組DNA。2. 2 總 RNA 的抽提(1)計數細胞，共8Χ IO6個活細胞；(2)常溫下1000轉/分鐘(rpm)離心15分鐘，棄上清；(3)沉淀中加入無菌生理鹽水后在IOOOrpm條件下離心15分鐘，重復洗滌2次；(4)向沉淀中加入8ml TRIZOL (lml/106細胞)，立即用5ml無菌針筒反復抽打剪 切數分鐘；(5)將上述TRIZOL溶液按Iml/管轉入1. 5ml帶蓋小塑料(印pendorf)管中，室溫 下靜置5分鐘；(6)每管加入0. 2ml氯仿，劇烈搖動15秒，室溫下靜置10分鐘；(7)4°C下12000g離心15分鐘，將水相轉入新的1. 5ml的印pendorf管中，每管加 入0. 5ml異丙醇，立即搖勻，室溫下靜置10分鐘；(8)4°C下，12000g 離心 10 分鐘；(9)棄上清，每管加入1.5ml 75%乙醇，混勻，4°C下，7500g離心5分鐘，棄上清；(10)真空干燥機中晾干，每管加入25 μ 1無RNA酶的DEPC水溶解沉淀，_80°C冰 箱保存。2. 3總RNA濃度的測定取出2 μ 1新抽提的總RNA，加入98 μ 1 DEPC水混勻，紫外分光光度計(GeneQuant II)測定260吸光值(Α260)及280吸光值(Α280)，RNA實際濃度用如下公式計算
Α260
RNA濃度(iigtf) = -X稀釋倍數
242. 4總RNA凝膠電泳取新抽提的總RNA3 μ 1加入電泳上樣緩沖液5 μ 1，1%瓊脂糖凝膠內含溴乙啶 (EB)濃度0. 5μ g/ml，經100V直流電壓下電泳5分鐘，凝膠成像系統觀測結果并攝像保存。2. 5 總 RNA 的處理取總 RNA 1 μ 1+ 無 RNA 酶的 DNA 酶(RNase-freeDnase) (IU/ μ 1)10μ l+RNasin(40U/y 1)1μ 1，總量達 12μ 1，經 37°C Xl 小時，90°C X 5 分鐘孵浴后立即置冰上待用。2. 6RT-PCR 按照說明書，將RQl無RNA酶的DNA酶處理過的總RNA進行逆轉錄(25 μ 1體系)， 并用DNA純化試劑盒(QIAquick)純化mRNA/cDNA雜交雙鏈。取純化的cDNA 2. 5 μ 1進行 PCR。2. 6. IRT反應體系取RQl處理過的總RNA 13 μ 1+寡聚脫氧胸苷
l. 5μ 1，總量達14. 5 μ L，經65°C預變性5分鐘，立即置冰上，加入以下試劑 DEPC水2. 5 μ 1+5倍緩沖液5 μ l+25mM dNTP (脫氧核苷混合物)0. 5 μ 1+RNA酶抑制劑 1.5 μ 1+逆轉錄酶(200υ/μυ μ 1至總體積25 μ 1，經37°C，30分鐘孵浴以合成互補脫氧 核糖核苷酸(cDNA)，置95°C 5分鐘，然后移至4°C冰浴備用。2. 6. 2PCR 體系(1) 50 μ 1的PCR反應體系2. 5 μ 1純化的3Α4，IOpmol的輕鏈或重鏈可變區上下 游引物各1μ 1，0. 5μ 1 25mM的dNTP，5y IlOX高保真PCR緩沖液，0. 2 μ 1高保真Taq聚合
酶(Platinum —Taq High Fidelity)；引物序列如下重鏈可變區5'引物序列(SEQ ID NO 5)CAG GTG CAG CTGAAG CAG TC重鏈可變區3'引物序列(SEQ ID NO 6)CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACAAGC TTG GGT GTC GTT TT 輕鏈可變區 5'引物序 列(SEQ ID NO 7)CAAATT GTT CTC ACC CAG TCT輕鏈可變區3'引物序列(SEQ ID NO 8)GGATAC AGT TGG TGC AGC ATC(2)反應條件94°C預變性2分鐘，94°C變性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸30 秒，共38個循環；(3)最后一個循環完成后，加入 1 μ 1 Taq DNA Polymerase (Taq DNA 聚合酶)72°C 延伸7分鐘；(4)取5μ 1 PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，同時加標準分子量標志物，鑒定 PCR產物片斷大小，分別命名為VH3a4和VL3a4基因。結果可觀察到350堿基對(bp)左右的 VH3a4條帶和325bp左右的VL3a4條帶。將前述陽性條帶切膠回收純化得到VH3a4和VL3a4基 因。3. VH3a4> VL3a4基因擴增產物的克隆和鑒定將純化的VH3a4和VL3a4基因片段通過連 接酶分別與克隆載體pGEM -T Easy連接，獲得的連接產物pGEM -τ Easy/VH和 pGEM _T Easy/VL，通過轉化DH5a感受態細菌，得到數十個白色菌落和數個藍色菌落， 分別挑取3個白色菌落進行質粒擴增，抽提后進行核酸限制性內切酶EcoRI酶切鑒定，
瓊脂糖電泳結果均可見350bp和325bp左右的目的片段(圖3)。圖3中，M 低核糖核苷酸 (DNA)標準分子量標志物；1 3 重組質粒pGEM -T Easy/VH3A4的EcoRI酶切；4 6 重組質粒pGEM _T Easy/VL3A4 的 EcoRI 酶切；7 8 空質粒pGEM -T Easy 的 EcoRI 酶切。
4. VH3a4> VL3a4基因序列測定和分析對陽性重組質粒純化后進行測序，VH3A4(參見圖4)和VL3A4(參見圖5)基因均符合小鼠Ig可變區框架結構。VH3a4基因全長351bp(見序列SEQ ID NO 1)，編碼117個氨基酸 (見序列SEQ ID NO 3)，在美國國家生物技術信息中心(NCBI)上進行檢索，發現此重鏈可 變區基因與小鼠免疫球蛋白重鏈可變區基因的同源性達95. 83%，氨基酸序列與小鼠Ig重 鏈的同源性達87%，歸屬于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析結果顯示，重鏈可變區含 有明確的4個框架區(FR)和3個抗原決定簇互補區(CDR)，在第21位和第96位為特征性 Cys (半胱氨酸)。VH3a4氨基酸序列結構框架如下1 25FRl26 33 CDRl34 50FR251 58 CDR259 96FR397 105CDR3106 117 FR4VL3a4基因全長327bp (見序列SEQ ID NO 2)，編碼109個氨基酸(見序列SEQ ID NO 4)，在NCBI上進行檢索，發現此輕鏈可變區基因與小鼠IgK鏈的同源性達98. 58%，氨 基酸序列與小鼠IgK鏈的同源性達88%，歸屬于小鼠Ig的VK基因。氨基酸序列分析結 果顯示，輕鏈可變區含有明確的4個框架區(FR)和3個抗原決定簇互補區(CDR)，在第23 位和第89位為特征性半胱氨酸(Cys)。VL3a4氨基酸序列框架如下1 26 FRl27 33 CDRl34 30 FR251 53 CDR254 89 FR390 98 CDR399 109 FR4實施例五木瓜酶(Papain)酶切結合流式細胞儀檢測3A4內化程度木瓜酶是木瓜中提取的 酶類，它能夠將免疫球蛋白的Fc段從Fab段切除，抗體經木瓜酶作用后，分解為2個Fab段 和1個Fc段共三個片段[7]。抗體的Fab段與抗原結合，而FITC則連于抗體的Fc段。在抗 體內化檢測中，木瓜酶能夠切除結合在細胞表面的抗體的Fc段，與Fc段連接的FITC隨之 被切除，但不能切除內化至胞漿的抗體Fc段。實驗步驟如下(1)計數KGla細胞，調整濃度至5X 106/ml，每個反應管取100 μ 1。(2)每管加 3Α4 FITC 2 μ 1，分別在 37°C和 4°C孵育 0. 25h、0. 5h、lh、2h、4h、24h。(3) PBS IOOOg離心10分鐘終止孵育。(4)實驗組加木瓜酶(終濃度2mg/ml)酶切15分鐘。(5) PBS IOOOg離心10分鐘終止酶切。(6)流式細胞儀檢測。
結果參見圖6 在37°C孵育時，細胞跨膜蛋白質轉運接近生理狀態，3A4快速內化 至細胞內，而在4°C孵育時，跨膜蛋白質轉運靜止，3A4并不內化(6A)。37°C孵育時，3A4的 內化程度隨孵育時間延長而增加，孵育2小時，抗體內化量接近最大值，其內化率為70. 8% (6B)。實施例六為證實3A4抗體的臨床治療應用前景，我們將純化的3A4鼠源性完整抗體與去甲 斑蝥素(Norcantharidin，簡稱NCTD)偶合制成3A4抗體的免疫毒素(3A4-NCTD)，觀察其 對3A4陽性(急性髓系細胞性白血病細胞株，KGla)和陰性(急性B細胞白血病細胞株， Nalm-6)細胞進行靶向殺傷研究，結果發現，3A4-NCTD對KGla細胞具有很強的選擇性殺傷 作用，明顯高于對照組(加PBS組)，且3A4-NCTD對3A4陰性的Nalm-6細胞卻無殺傷作 用，說明3A4-NCTD具有良好的靶向殺傷髓系白血病細胞株的作用，結果參見圖7 作用72 小時，對KGla的抑制率為25. 8%，而對Nalm-6抑制率為0. 63% ；作用96小時，對KGla的 抑制率達42. 8%，而對Nalm-6抑制率為3. 5% 了，其中PBS為磷酸鹽緩沖液。3A4-NCTD對 KGla增殖具有顯著的抑制作用，與PBS組比較，96h抑制率達42. 8% (7A)，細胞計數同樣顯 示3A4-NCTD對于KGla有殺傷作用，而對Nalm-6無明顯殺傷作用(7B)。
實施例七為證實3A4能捕獲白血病干細胞，流式細胞儀檢測3A4識別白血病細胞株和 初發白血病患者骨髓中⑶34+⑶38-⑶123+白血病干細胞的能力。結果發現3A4在 ⑶34+⑶38-⑶123+KGla細胞株上陽性率為99.05% (參見圖8A)，在初發白血病患者骨髓 ⑶34+⑶38-⑶123+細胞上陽性率可高達90. 3% (參見圖8B)。無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度 地應用本發明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明 的范圍。本發明涉及的參考文獻1. Holmes N. CD45 :all is not yet crystal clear. Immunology. 2006,117 (2) 145-155.2. Glatting G，Miiller M，Koop B，et al. Anti~CD45 monoclonal antibody YAML568 :Apromising radiοimmunoconjugate for targeted therapy of acute leukemia. J Nucl Med. 2006，47 (8) : 1335-1341.3. John M，Pagel,Frederick R，et al· 131I_anti_CD45 antibody plus busulfan andcyclophosphamide before allogeneic hematopoietic eel 1 transplantation for treatment of acutemyeloid leukemia in first remission. Blood,2006, 107(5)2184-2191.4. Michelle L. Hermistonl, Zheng Xu, et al. CD45 :A critical regulator of signalingthreshoIds in immune cells. Annu. Rev. Immunol.2003，21 :107—1375. Hauswirth AW, Florian S，Printz D，et al. Expression ofthe target receptor CD33 inCD34+/CD38_/CD123+AML stem cells.Eur J Clin Invest. 2007，Jan ； 37(1) 73-826.林學顏，張玲主編.現代細胞與分子免疫學.第一版.北京科學技術出版社· 2000，p489-521.7.Pierre Haquette,Barisa Talbi,Sigolene Canaguier,et al. Functionalized cationic ( η 6-arene)ruthenium (II) complexes for site-specific and covalent anchoring to papain frompapaya latex. Synthesis,X-ray structures and reactivity studies. Tetrahedron Letters, 2008,49(31) 4670-467.本發明涉及的序列<120>抗人⑶45RA鼠免疫球蛋白可變區基因及用途<160>8
<170>Patent In Version 2. 1<210>1<211>351<213>人工序列<220><223>94a 88c 91g 78t<400>11 CAGGTGCAGC TGAAGCAGTC TGGGGCTGAA CTGGCAAAAC CTGGGGCCTC AGTGAAGATG61 TCCTGCAAGG CTTCTGGCTC CACCTTTACT ACCTACTGGA TACACTGGGT AAAACAGAGG
121 CCTGGACAGG GTCTGGAATG GATTGGATAC ATTAATCCTA ACACTGGTTA TACTGAGTAC181 AATCAGAAGT TCAAGGCCAA GGCCACATTG ACTGCAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAC241 ATGCAACTGA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGT AAGATTTATT301 ACGGTAGTAG GGGGGTGGGG CCAAGGCACC ACTCTCACAG TCTCCTCAGC C<210>2<211>327<212>DNA<213>人工序列<220><223>75a 99c 75g 78t<400>21 CAAATTGTTC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT ATCTAGGGGA ACGGGTCACC61 ATGACCTGCA CTGCCAGTTC AAGTGTAAGT TCCAGTCACT TGCACTGGTA CCAGCAGAAG121 CCAGGATCCT CCCCCAAACT CTGGATTTAT AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCA181 GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGCATGGAG241 ACTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAC CAGTATCATC GTTCCCCGCT CACGTTCGGT301 GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGG<210>3<211>117<212><213>人工序列<220>
<400>31 QVQLKQSGAE LAKPGASVKM SCKASGSTFT TYffIHWVKQR PGQGLEffIGY61 INPNTGYTEY NQKFKAKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCVRFI101 TVVGGffGQGT TLTVSSA<210>4<211>109<212><213>人工序列
<220><221><400>41 QIVLTQSPAI MSAYLGERVT MTCTASSSVS SSHLHWYQQK PGSSPKLffIY51 STSNLASGVP ARFSGSGSGT SYSLTISSME TEDAATYYCH QYHRSPLTFG101 AGTKLELKR<210>5<211>20<212><213>人工序列<220><223>重鏈可變區5’引物序列<400>5CAG GTG CAG CTG AAG CAG TC<210>6<211>38<212><213>人工序列<220><223>重鏈可變區3’引物序列<400>6CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACA AGC TTG GGT GTC GTT TT<210>7<211>21<212><213>人工序列<220><223>輕鏈可變區5’引物序列<400>7CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT<210>8
<211>21<212><213>人工序列<220><223>輕鏈可變區3’引物序列<400>8
GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC
權利要求
一種抗人CD45RA鼠免疫球蛋白可變區基因，具有SEQ ID NO 1和SEQID NO 2的核苷酸序列。
2.根據權利要1所述的一種抗人CD45RA鼠免疫球蛋白可變區基因，其編碼的氨基酸序 列為 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4。
3.根據權利要1或2所述的一種抗人CD45RA鼠免疫球蛋白可變區基因在制備靶向治 療血液系統惡性腫瘤藥物中的應用。
4.根據根據權利要3所述的應用，其特征在于，在制備有效識別白血病干細胞及子代 白血病細胞藥物中的應用。
5.根據根據權利要3所述的應用，其特征在于，以所述的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白可 變區基因為靶向分子制備免疫毒素，在制備有效殺傷靶細胞而減少對非靶組織器官的毒副 作用的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種抗人CD45RA鼠免疫球蛋白可變區基因，具有SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的核苷酸序列，以及編碼的SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的氨基酸序列。研究表明，抗人CD45RA鼠免疫球蛋白可變區基因能夠有效識別白血病病人及白血病細胞株CD34+CD38-CD123+的白血病干細胞及CD34+CD38+CD123+的子代白血病細胞，具有靶向治療白血病的應用前景，可在制備靶向治療血液系統惡性腫瘤藥物中應用。
文檔編號A61K39/395GK101831434SQ20091024602
公開日2010年9月15日 申請日期2009年11月20日 優先權日2009年7月27日
發明者李思思, 湯永民 申請人:浙江大學