角膜上皮片及其制作方法、以及使用該片的移植方法

專利名稱：角膜上皮片及其制作方法、以及使用該片的移植方法
技術領域：
本發明涉及角膜上皮片。詳細地說，本發明涉及不使用來自于異種動物的細胞作為飼養(フイ一ダ一)細胞，而通過在膠原凝膠上培養·增殖角膜上皮細胞來制作角膜上皮片及該片的制作方法，以及該片的應用(移植方法等)。
背景技術：
被期待的用于再生醫療的組織之一是角膜。角膜位于構成眼球光學系統的最外層，是一種透明的無血管的組織，通過與淚液共同形成平滑的表面從而有利于獲得良好的視力。另外，角結膜上皮細胞經常與外界接觸，具有防御外界的微生物等異物、紫外線等光線等來保護眼球的作用。即，角結膜上皮細胞，對于防御角膜的透明性和整個眼球、維持長期恒定性，發揮著極其重要的作用。
角膜例如由于角膜炎、角膜潰瘍、穿孔等的病態而混濁，有失去透明性的情況。對于這種因角膜渾濁而引起的永久性視力降低，采用從眼球提供者提供的角膜進行角膜移植來治療。角膜移植是指摘除患者的喪失透明性的角膜，然后移植透明的角膜，通過這種移植可以恢復透明性，再次恢復視力。
通過這種角膜移植可以期待有效的治療效果的另一方面，也存在僅靠角膜移植還不能應對的疾病。例如為史蒂芬強森綜合癥、眼類天皰瘡、化學外傷、熱灼傷等。通常，角結膜上皮細胞每天都在反復分裂，老化的細胞剝落，由干細胞組織再生出新的細胞。但是在上述病態中，已知使角膜再生的干細胞組織出現了障礙。
使角膜上皮再生的干細胞組織叫“角膜緣組織”，恰好局限在虹膜和鞏膜的交界部位，處于暴露于外界的特殊的環境中。在上述病態中，認為是該干細胞組織自身受到了某種損害而滅絕了。于是，由于該干細胞組織的滅絕，其缺損部位被周圍存在的結膜上皮所覆蓋，透明性不足，引起了視力的極端降低。這樣由于在上述的病態中角膜緣枯竭，僅靠移植角膜不能長期地維持所移植的角膜。因此為尋求持久地重建眼表面，有必要將角膜緣也移植。羊膜移植法作為這種角膜緣移植方法的一種已經被開發(Medical朝日1999年9月號p62～65、N Engl J Med3401697～1703、1999非專利文獻1)。用于該移植法的羊膜是從剖宮產孕婦等的胎盤中獲得的。羊膜由于具有厚的基底膜，移植時可以發揮作為用于角結膜上皮細胞增殖、分化的基質的作用。進一步，由于羊膜不但幾乎沒有免疫原性，而且還同時具有抵抗炎癥和抑制瘢痕形成等作用，因此移植到羊膜上的角結膜上皮或者其干細胞組織受到了保護而免受來自于接受移植者(接受者)的排斥反應等。
非專利文獻1Medical朝日1999年9月號p62～65、N Engl JMed3401697～1703、1999發明內容作為對角膜被結膜上皮覆蓋而產生渾濁的眼表面疾病的外科治療，目前施行角膜上皮移植術，但對于伴有嚴重炎癥的難治性角結膜疾病(如史蒂芬強森(Stevens-Johnson)綜合癥或眼類天皰瘡、角膜腐蝕等)，其預后極為不良。作為其最大原因，可舉出具有強抗原性的異系(アロ)的角膜上皮被宿主的免疫系統識別而受到排斥。進一步，為預防排斥反應在手術后用大量免疫抑制劑經全身或局部給藥而引起的并發癥也是其預后不良的主要因素。另一方面，利用異種的角膜上皮時，還有供體不足的問題。如果能夠實現用從一只眼睛獲得的角膜制作出數十個角膜上皮片的技術，就可以解決供體不足的課題。
本發明是鑒于以上的背景及課題而完成的，其目的在于提供一種能有望獲得高治療效果、并且移植時安全性高的角膜上皮片。基于這種目的，本發明人等考慮到安全性，在上皮細胞的培養時以不使用來自于異種動物的細胞(飼養細胞)作為條件的基礎上，嘗試了制作角膜上皮片。其結果是，通過在含有人成纖維細胞的膠原凝膠上培養角膜上皮細胞，不使用飼養細胞就能達到良好的多層化和上皮化。特別是通過使用無血清培養基取得了良好的結果。
如上所述本發明人等成功制作了完全不使用來自于異種動物的細胞的安全實用的角膜上皮片。
本發明是基于以上的成果和發現而完成的，提供以下內容。
(1)一種角膜上皮片，含有在不存在異種動物細胞的情況下，于含人成纖維細胞的膠原凝膠上被增殖的角膜上皮細胞。
(2)如(1)所述的角膜上皮片，其特征是，使用無血清培養基增殖上述角膜上皮細胞。
(3)如(1)所述的角膜上皮片，其特征是，使用只含有來自于受者的血清作為血清成分的培養基來增殖上述角膜上皮細胞。
本發明的角膜上皮片，由于在其制作過程中未使用來自于異種動物的細胞，因而具有極高的安全性。另外，通過使用含有成纖維細胞的膠原凝膠，形成極致密的細胞層，使多層培養首次成為可能，移植后的存活性非常高。


是顯示按實施例的方法制作的角膜上皮片的蘇木精·伊紅染色圖像。可以確認在含有成纖維細胞的凝膠上含有3-4層的角膜上皮細胞層。顯示細胞的形態接近于正常角膜，在最上層未見角質層形成的角膜的形態。
是顯示按實施例的方法制作的角膜上皮片的電子顯微鏡圖像。角膜上皮細胞層由3-4層的細胞構成(A)。在基底膜部能夠確認半橋粒的形成和致密板的形成(B)。在細胞之間橋粒形成良好(C)。在最上層有微絨毛形成，顯示出與人角膜的電子顯微鏡觀察幾乎相同的形態。基于這些，認為微細結構也呈現出了角膜的形態。
具體實施例方式
本發明提供含有以下構成的角膜上皮片。即，其是形成有細胞層的角膜上皮片，該細胞層含有在不存在異種動物細胞的情況下，于膠原凝膠上被增殖的角膜上皮細胞。本發明的角膜上皮片，可用作角膜上皮的再生(重建)。以下將詳細敘述本發明的角膜上皮片及其制作方法的特征。
本發明的角膜上皮片是通過含有以下步驟的方法制作而成(a)調制角膜上皮細胞的步驟、(b)在膠原凝膠內培養人成纖維細胞的步驟、(c)將上述角膜上皮細胞播種或載置于上述膠原凝膠上的步驟、(d)在不存在異種動物細胞的情況下，培養上述角膜上皮細胞使其增殖的步驟。
在步驟a調制角膜上皮細胞。除有特別記載，在本說明書中的“角膜上皮細胞”是作為包括角膜上皮細胞層所包含的細胞的用語而被使用，即包括角膜上皮細胞的干細胞和前體細胞。以下是顯示角膜上皮細胞的調制方法的一個例子。
角膜上皮細胞可以從角膜緣組織中得到。例如從角膜緣組織中剝離除去內皮細胞，切除結膜制成單一的細胞懸濁液。再將其用氮罐保存，然后迅速在37℃下融解，調制成角膜上皮細胞懸浮液。根據需要進行傳代培養。在傳代培養中，可以使用例如無血清培養基的EpilifeTM(CASCADE公司)、MCDB 153培養基(日水制藥株式會社)或改變這些培養基的氨基酸組成等而制作的培養基等。
角膜上皮細胞優選從接受角膜上皮片的受者(レシピエント)中來調制。即，優選角膜上皮細胞的供者和角膜上皮片的接受者為同一人。通過使用這種自體細胞來解決免疫排斥的問題。
在步驟b中，在膠原凝膠內培養人成纖維細胞。“膠原凝膠”是作為人成纖維細胞的培養基質而發揮功能。作為膠原凝膠的原材料的膠原，其種類不作特別限定，可以使用I型膠原、III型膠原和IV型膠原等。也可以使用多種類的膠原混合品。這些膠原可以從豬、牛、羊等動物的皮膚、軟骨等結締組織中，通過酸溶法、堿溶法、酶溶法等來提取并精制得到。另外，從降低抗原性的目的出發，優選使用通過采用胃蛋白酶或胰蛋白酶等分解酶處理來除去端肽的所謂端膠原。作為膠原凝膠的材料可以使用來自于羊膜的，特別是來自于人的羊膜的膠原。這里的來自于羊膜，是指廣義的以羊膜作為初始原材料得到的物質。
膠原基質含有的人成纖維細胞的來源不作特別限定，只要是產生膠原的物質，來自于任何組織的物質都可以，例如可以使用從皮膚組織、口腔粘膜組織等調制的人成纖維細胞。
下面示出膠原基質制作方法的具體例。首先，按以下步驟調制成纖維細胞。取皮膚，接著從皮膚上剝離真皮。將真皮細切，使其粘附在I型膠原被覆的試皿上。靜置培養，將來自真皮片的游走的成纖維細胞傳代。細胞從試皿底部剝離，調配細胞懸浮液，播種到細胞培養用試皿中。適當地冷凍保存(例如在液氮中保存)細胞。
另一方面，使用I型膠原調制中和膠原液(參照后述的實施例)。將其添加到培養容器(例如培養嵌套(カルチヤ一インサ一ト))中，在室溫下靜置10分鐘左右使之凝膠化。接著，根據上述方法將事先培養的處于對數增殖期的成纖維細胞混合到該凝膠中，再次使之凝膠化。然后，靜置培養。按照以上步驟得到含有成纖維細胞的膠原基質。通過該創新方法獲得的具有必要的強度、可以載置羊膜層或來自于活體的細胞的膠原基質成為本發明的基礎。在膠原基質上，可以播種(載置)另外準備的角膜上皮細胞。
角膜上皮細胞，按照例如細胞密度為約1×103個/cm2或更多來播種，優選為約1×103個/cm2～約1×107個/cm2，更優選為約1×104個/cm2～約1×106個/cm2來播種。
在膠原基質上播種的角膜上皮細胞的培養(步驟d)是在不存在異種動物細胞的情況下來實施的。本發明中的“在不存在異種動物細胞的情況下”，是指作為培養角膜上皮細胞時的條件，不使用相對于該角膜上皮細胞屬于異種的動物的細胞。具體地說，作為角膜上皮細胞在使用人細胞的情況下，是指在培養液中不存在(并存)小鼠或大鼠等人以外的動物種細胞的條件。通過在這種條件下實施培養，最終得到的移植材料(即角膜上皮片)中不可能混入來自于異種的成分(包含異種細胞本身)。
培養角膜上皮細胞時使用的培養基，只要是使該細胞增殖的物質則不作特別限定，特別是本發明優選使用無血清并且不含來自于異種動物的蛋白質的培養基。另一方面，可以使用添加了生長因子或抗生素等的培養基。但是優選使用不含血清的培養基。即，作為本發明的培養方法優選采用無血清培養法。這是由于可以避免因來自于血清的成分的混入而引起的免疫排斥等問題。另外，也可以在含有血清的培養基中培養，但這種情況下優選使用來自于同種的血清(在培養人的角膜上皮細胞時使用來自于人的血清)，或自體血清。勿庸置疑，只要可能，優選使用不可能引起免疫排斥反應的自體血清。
以角膜上皮細胞的良好增殖及多層化作為目的，在培養過程中也可以改變培養條件。
步驟d的結果是角膜上皮細胞在膠原基質上增殖。為促進這樣得到的細胞層的表層的角化，優選實施將細胞層的表層與空氣接觸的步驟(步驟e)。另外，該步驟在本說明書中也稱作空氣-上舉(Air-lifting)。該步驟e是以誘導形成的細胞層的細胞分化、屏障功能等作為目的而進行的。
該步驟可以通過采用吸液玻璃管、移液管等暫時移除一部分培養液來降低培養液的表面，從而使細胞層的最表層暫時暴露在培養液面之外來進行。或者，也可以通過將細胞層連同膠原基質一起提起來，使最表層暫時暴露在培養液面之外來進行。進一步，也可以采用管等將空氣送入培養液中，使細胞層的最上層與空氣接觸。從操作簡便的觀點出發，優選采用降低培養液表面使細胞層的最表層暴露的方法。
進行該步驟e的時間，即，使多層化的細胞層的最表層與空氣接觸的時間，根據細胞的狀態或培養條件等而變動，例如3天～3周左右，優選為5天～2周，更優選為約1周。
以下用實施例來更具體地說明本發明，但本發明不限于該實施例。
實施例1制作使用膠原凝膠制作三維角膜上皮片1.角膜上皮細胞的調制1-1.角膜的籌備角膜是從Northwest Lions Eye Bank(西雅圖、美國)購買的供者用的物質。
1-2.角膜上皮細胞的無血清培養法將角膜轉移到加有杜氏磷酸緩沖液(PBS)的培養皿中，在實體顯微鏡下用手術刀將緣部的一邊切細至2～3mm。切細的緣部多次用PBS洗凈，并在70％的乙醇中浸泡1分鐘滅菌。用PBS洗凈后，在分散酶溶液(分散酶II、合同酒精社、250單位/ml、杜氏改良MEM培養基；DMEM)中浸泡，在4℃下靜置一晚(18～24小時)。第二天，在實體顯微鏡下，用鑷子將上皮從實質剝離。剝離的角膜上皮用DMEM洗凈，接著用PBS洗凈后，在0.25％的胰蛋白酶溶液中浸泡，在37℃下處理10分鐘。將表皮轉移到加有胰蛋白酶中和液的塑料培養皿中，用鑷子解除表皮片，再轉移到15ml的滅菌試管中。加入PBS，調配角膜上皮細胞懸浮液。數細胞數，1000rpm離心5分鐘，使細胞沉淀。吸走上清，將細胞懸濁于無血清培養基的EpiLife培養基中，再按照每60mm膠原被覆培養皿(ASAHI TECHNOGLASS、I型膠原被覆試皿；4010-020)為1～2×106細胞/5ml培養液的比例播種。第二天交換培養液，之后每隔1天交換培養液。細胞密度達到70～80％左右時進行傳代培養。
另外，雖然在以上方法中使用無血清培養基來培養角膜上皮細胞，但也可以按照以下所示的步驟使用含有血清的培養基。
(1)從角膜緣部組織剝離除去內皮細胞，切除結膜。
(2)在4℃下在分散酶溶液(分散酶I、合同酒精社、250單位/ml、杜爾貝科改良(變法)MEM培養基；DMEM)中浸泡靜置一晚(18～24小時)。
(3)在0.25％的胰蛋白酶溶液中浸泡，在37℃下處理10分鐘。
(4)在顯微鏡下在胰蛋白酶溶液中僅剝離上皮。
(5)移液操作，并加入等量的30％FCS/DMEM懸濁。
(6)用PBS(-)進一步回收殘留細胞，進行離心處理。
(7)用適量的培養液作為單一的細胞懸浮液。
下面顯示調制的角膜上皮細胞的冷凍保存條件(包含保存液的組成)以及融解條件的一例。
冷凍保存條件按1℃/小時的速度將溫度降到-20℃，然后在氮罐中保存。
保存液組成20％FCS/10％DMSO/DMEM融解條件盡可能迅速地在37℃下融解，用PBS稀釋10倍。
2.成纖維細胞的調制將剝離的真皮用DMEM洗凈后，一邊用手術刀切細至1～2mm。將切細的真皮片以約1cm的間隔粘附在I型膠原被覆的試皿上。在二氧化碳培養箱中靜置30分鐘，使之完全粘附。然后，加入約5ml含10％牛胎兒血清的DMEM培養基，靜置7天。在第7天首次交換培養液。確認成纖維細胞從真皮片游動出來。細胞增殖，在游動到真皮片周圍5mm的階段，進行傳代。用PBS洗凈后，加入3ml含0.125％的胰蛋白酶和0.05％的EDTA的溶液，在37℃下處理3分鐘。在顯微鏡下確認細胞從皿底部剝離之后，加入3ml胰蛋白酶抑制劑，回收細胞，并轉移至50ml的試管中。用PBS回收殘留的細胞，用1000rpm、進行5分鐘離心處理使細胞沉淀，吸走上清液后，加入含10％牛胎兒血清的DMEM培養基，調配細胞懸浮液，播種到細胞培養用試皿中。傳代的細胞密度大約定為1∶3左右。適當地冷凍保存細胞。冷凍保存液使用10％甘油、20％FCS和70％DMEM，在液氮中保存。
3.中和膠原凝膠的制備在4℃下，相對于6體積的I型膠原溶液(細胞基質類型1A3mg/mlNITTA GELATIN)，按1體積的0.1N的NaOH、1體積的8倍濃度的DMEM和10體積的20％FCS/DMEM的比例調制中和膠原液(膠原的最終濃度1mg/ml)，向直徑為24mm的培養嵌套(Coming-Costar公司)中各加1ml，在室溫下靜置10分鐘使之凝膠化。將事先培養的處于對數增殖期的成纖維細胞(使用將分散酶處理過的剝離表皮的殘留真皮用outgrowth法培養并傳至5-10代的細胞)調配成5×105細胞/ml、10％FCS/DMEM的濃度，按照相對于該細胞懸濁液2體積，中和膠原液8體積的比例進行混合，調制成含細胞的中和膠原溶液(膠原的最終濃度0.8mg/ml)。將該溶液向各培養池中各加3.5ml，在二氧化碳培養箱(37℃、5％CO2)中靜置。經約30分鐘確認了凝膠化。然后將10％的FCS/DMEM加至浸沒凝膠的程度(培養池內側3ml、培養池外測3ml)后靜置培養5天。從培養的第2天起凝膠開始收縮，可以在位相差顯微鏡下觀察成纖維細胞的增殖。
4.角膜上皮細胞的播種在成纖維細胞培養開始后的第5天，膠原凝膠的底面在膜上粘附，另一方面，膠原凝膠上部收縮至直徑為13-15mm、厚度為2-3mm左右。另外，膠原凝膠中央凹陷成類似火山口狀。在該凹陷上播種角膜上皮細胞。即，將在1-2.調制的角膜上皮細胞用胰蛋白酶·EDTA從皿上剝離并回收。在1000rpm下，離心5分鐘，除去上清液，調配至3～4×106細胞/ml左右。從體積上講可以將50～60μl的懸濁液添加到膠原凝膠上。為使角膜上皮細胞與凝膠粘附，在二氧化碳培養箱內靜置1.5～2.0小時，然后緩慢加入表皮細胞增殖用的無血清培養基(培養嵌套內側3ml、培養嵌套外測3ml)，進一步，在液相下繼續培養14天。在角膜上皮細胞播種的第3天將培養液變更為多層化用的培養液(參照下述)，之后每2天更換1次培養液。
多層化用的培養基按如下調配。
杜氏改良MEM培養基∶F-12培養基＝1∶1鈣濃度1.95mM乙醇胺0.1mM鄰磷酸乙醇胺0.1mM胰島素5ug/ml氫化可的松0.4ug/mlL-谷氨酰胺4mM腺嘌呤0.18mM轉鐵蛋白5ug/ml亞硒酸53nM三碘甲狀腺原氨酸20pM絲氨酸1mM氯化膽堿0.64mM亞油酸2ug/mlFCS2％5.氣相下的培養在播種后的第14天將角膜上皮細胞進行空氣暴露(空氣-上舉)。在維持空氣暴露用的容器中設置滅菌的濾紙，加入多層化用的培養基至浸沒濾紙的程度(約9ml)。培養嵌套內側的培養液要十分注意地除去，將培養嵌套移至濾紙上，在二氧化碳培養箱內培養。在第3天交換培養液。通過3天的空氣暴露完成角膜的培養。
6.組織學的檢查在空氣暴露后的第3天，角膜上皮成為3～4層，確認了角質層的形成，呈現出與正常人的角膜幾乎相同的構造(圖1、2)。
工業上的可利用性本發明提供的角膜上皮片，用于角膜上皮的再生(再建)。另外，本發明的角膜上皮片也是可以用于基因的治療。基因治療大體可分為體內法(in vivo)和體外法(ex vivo)，前者是將基因直接導入活體內的方法，后者是先取出細胞，導入基因后再回到體內的方法。鑒于目前基因治療的技術水平，只要向培養角膜上皮導入遺傳基因就可以立刻向體外法發展。利用各種病毒載體向角質化細胞的基因導入顯示出了有效性，特別是在采用腺病毒載體的情況下幾乎能達到100％地導入角化細胞。
本發明不限定為上述發明的實施方式及實施例的說明。不脫離權利要求范圍所記載的內容、在該領域的技術人員容易聯想到的范圍內的各種變化形態也包含在本發明中。
在本說明書中明確表示的論文、公開專利公報以及專利公報等的全部內容在此引用。
權利要求
1.一種角膜上皮片，其特征是，含有在不存在異種動物細胞的情況下，于含人成纖維細胞的膠原凝膠上被增殖的角膜上皮細胞。
2.根據權利要求1所述的角膜上皮片，其特征是，使用無血清培養基使上述角膜上皮細胞增殖。
3.根據權利要求1所述的角膜上皮片，其特征是，使用只含有來自于受者的血清作為血清成分的培養基來使上述角膜上皮細胞增殖。
4.一種角膜上皮片的制作方法，其特征是，包含以下步驟(a)調制角膜上皮細胞的步驟；(b)在膠原凝膠內培養人成纖維細胞的步驟；(c)將所述角膜上皮細胞播種或載置于所述膠原凝膠上的步驟；(d)在不存在異種動物細胞的情況下，培養所述角膜上皮細胞使之增殖的步驟。
5.根據權利要求4所述的制作方法，其特征是，進一步含有以下的步驟(e)所述角膜上皮細胞增殖后，使最表層與空氣接觸的步驟。
6.根據權利要求4或5所述的制作方法，其特征是，所述步驟d使用無血清培養基來實施。
7.根據權利要求4或5所述的制作方法，其特征是，所述步驟d，使用只含有來自于受者的血清作為血清成分的培養基來實施。
8.一種移植方法，其特征是，將權利要求1～3中的任意一種角膜上皮片作為移植材料來使用。
全文摘要
本發明提供一種能有望獲得高治療效果并且移植時的安全性高的角膜上皮片。通過下述步驟制作角膜上皮片(a)調制角膜上皮細胞；另一方面，(b)在膠原凝膠內培養人成纖維細胞；(c)在上述膠原凝膠上播種或載置上述角膜上皮細胞；(d)在不存在異種動物細胞的情況下，培養上述角膜上皮細胞使之增殖。
文檔編號A61L27/38GK1929877SQ20058000768
公開日2007年3月14日 申請日期2005年2月14日 優先權日2004年3月11日
發明者橋本公二, 白方裕司, 大橋裕一, 羽室淳爾 申請人:阿如布勒斯特有限公司, 橋本公二