高親和力ny－esot細胞受體的制作方法

專利名稱：高親和力ny－eso t細胞受體的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有結合SLLMWITQC-HLA-A*0201特性并含有至少一個TCRα鏈可變區和/或至少一個TCRβ鏈可變區的T細胞受體(TCR)，其特征在于，所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于1μM和/或對該復合物的解離速率(off-rate)(koff)為1×10-3S-1或更慢。
背景技術：
SLLMWITQC肽衍生自各種腫瘤所表達的NY-ESO-1蛋白(Chen等，(1997)，PNAS USA 94 1914-1918)。這些癌性細胞的I類HLA分子呈遞含有SLLMWITQC的該蛋白的肽。因此，例如為向癌細胞遞送細胞毒性或免疫刺激性藥物，SLLMWITQC-HLA-A2復合物提供了TCR所靶向的一種癌癥標記。然而，對于該目的，如果TCR對肽-HLA復合物比對該復合物特異的天然TCR具有更高親和力和/或更慢的解離速率則更理想。
發明簡述本發明首次利用了與SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物相互作用的高親和力小于或等于1μM(KD)和/或較慢解離速率(koff)為1×10-3S-1或更慢的TCR。這種TCR可單獨使用或與治療性藥物聯用來靶向癌細胞呈遞該復合物。
發明詳述本發明提供具有結合SLLMWITQC-HLA-A*0201特性并含有至少一個TCRα鏈可變區和/或至少一個TCRβ鏈可變區的T細胞受體(TCR)，其特征在于，所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于1μM和/或對SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的解離速率(off-rate)(koff)為1×10-3S-1或更慢。可通過任何已知的方法測定KD和/或(koff)。優選方法是實施例5的表面等離振子共振(Biacore)方法。
為了比較，通過實施例5的Biacore方法測定天然1G4 TCR(TCRα鏈見SEQ ID NO9和TCRβ鏈見SEQ ID NO10)的二硫鍵連接的可溶性變體與SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物相互作用的KD約為10μM，解離速率(koff)為1.28×10-1S-1，半衰期為0.17分鐘。
SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的特異性天然1G4 TCR具有以下常用的Vα鏈和Vβ鏈基因α鏈-TRAV21β鏈-TRBV6.5。
天然1G4 TCR可用作模板在其中引入各種突變從而產生本發明TCR和SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物之間相互作用的高親和力和/或慢解離速率。因此，與天然1G4 TCR α鏈可變區(見附

圖1a和SEQ ID No1)和/或β鏈可變區(見附圖1b和SEQ ID No2)相比，本發明包括在其至少一個互補決定區(CDR)和/或可變區框架區中發生突變的TCR。本發明也考慮了本發明TCR可變區中的其它超變區，例如超變4(HV4)區發生突變從而產生高親和力的突變體。
天然TCR存在異源二聚體αβ或γδ形式。然而，以前的報道顯示一條TCRα鏈或TCRβ鏈構成的重組TCR即能與肽MHC分子結合。
在一個實施方案中，本發明的TCR同時包含α鏈可變區和TCRβ鏈可變區。
本領域技術人員明顯可知TCRα鏈序列和/或TCRβ鏈序列中的突變可以是一個或多個取代、缺失或插入。可用任何合適的方法來產生這些突變，包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)、限制性酶切克隆或不依賴于連接反應的克隆(LIC)方法。這些方法詳述于許多標準的分子生物學教材中。關于聚合酶鏈式反應(PCR)誘變和限制性酶切克隆的其它細節可見(Sambrook和Russell，(2001)，《分子克隆-實驗室手冊》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，(第三版)，CSHL Press)。LIC方法的其它信息可見(Rashtchian，(1995)，Curr OpinBiotechnol，6(1)30-6)。
應注意含有與天然1G4 TCR相似的常用Vα和Vβ基因和因此相同的氨基酸序列的任何αβTCR可用作方便的模板TCR。然后可能將產生本發明突變的高親和力TCR所需的改變引入編碼模板αβ TCR的一個或兩個可變區的DNA中。本領域技術人員顯然知道可通過許多方法，例如定點誘變引入所需的突變。
與圖1a和SEQ ID No1的天然1G4 TCRα鏈可變區序列中這些位置的氨基酸相比，本發明TCR包含對應于以下所列發生突變的一個或多個TCRα鏈可變區的氨基酸。
除非另有相反陳述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或M)殘基。本領域技術人員可知該殘基在重組蛋白產生過程中可以除去。此外，除非另有相反陳述，可溶性TCR和TCR可變區序列可在其N-末端截短。(分別導致TCRα和β鏈序列中的N-末端“K”和“NA”丟失)。本領域技術人員顯然可知這些“丟失”的N-末端TCR殘基可以重新引入本發明TCR中。本領域技術人員也顯然知道，可將其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5或更多個殘基，而基本不影響該TCR的pMHC結合性能，本發明包括所有這些不重要的變體。
本文所用的術語“可變區”應理解為包括某給定TCR的所有不包含在TCRα鏈的TRAC基因或TCRβ鏈的TRBC1或TRBC2(基因)所編碼的恒定區內的氨基酸(序列)。(《T細胞受體手冊》(T cell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學出版社，ISBN 0-12-441352-8)。
本領域技術人員可知，在如上定義的可變區和恒定區之間交界處密碼子所編碼的氨基酸中發生變異可導致TCR庫的部分多樣性。例如，存在于野生型IG4 TCR序列此交界處的密碼子(突變)導致本文可變區序列的C-末端存在酪氨酸(Y)殘基。該酪氨酸取代了圖8A所示，TRAC基因編碼的N-末端精氨酸(N)殘基。
本發明的實施方案包括含有對應于以下一個或多個α鏈可變區氨基酸發生突變的突變性TCR20V、51Q、52S、53S、94P、95T、96S、97G、98G、99S、100Y、101I和103T，例如以下氨基酸20A51P/S/T或M52P/F或G53W/H或T94H或A95L/M/A/Q/Y/E/I/F/V/N/G/S/D或R96L/T/Y/I/Q/V/E/X/A/W/R/G/H/D或K97D/N/V/S/T或A98P/H/S/T/W或A99T/Y/D/H/V/N/E/G/Q/K/A/I或R100F/M或D101P/T/或M103A以上采用的編號與圖1a和SEQ ID No1所示相同。
本發明的實施方案也包括對應于以下所列一個或多個TCRβ鏈可變區氨基酸相對于圖1b和SEQ ID No2的天然1G4 TCRβ鏈可變區中這些位置的氨基酸發生突變的TCR。所指示的可發生突變的氨基酸是18M、50G、51A、52G、53I、55D、56Q、70T、94Y、95V和97N，例如18V50S或A51V或I52Q53T或M55R56R70I94N或F
95L97G或D以上采用的編號與圖1b和SEQ ID No2所示相同。
本發明的其它優選實施方案是含有圖6所示突變的α鏈可變區氨基酸序列的TCR(SEQ ID No11到83)。這類TCR的表型沉默(phenotypicallysilent)變體也構成本發明的一部分。
本發明的其它優選實施方案是含有圖7或13所示突變的β鏈可變區氨基酸序列之一的TCR。(SEQ ID No84到99或117到121)。這種TCR的表型沉默變體也構成本發明的一部分。
天然TCR存在異源二聚體αβ或γδ形式。然而，以前的報道顯示αα或ββ同源二聚體構成的重組TCR才能與肽MHC分子結合。因此，本發明的一個實施方案是TCR αα或TCRββ同源二聚體。
本發明的其它優選實施方案是含有下列α鏈可變區氨基酸序列和β鏈可變區氨基酸序列組合的TCR，這類TCR的表型沉默變體也構成本發明的一部分
優選實施方案是含有以下部分的TCRSEQ ID NO49所示的α鏈可變區和SEQ ID NO94所示的β鏈可變區，或其表型沉默變體。
在另一優選實施方案中，含有以上詳述的可變區組合的本發明TCR還含有圖8a所示α鏈恒定區氨基酸序列(SEQ ID NO100)和圖8b和8c所示β鏈氨基酸恒定區序列之一(SEQ ID NO101和102)或其表型沉默變體。
本文所用的術語“表型沉默變體”應理解為指對所述SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于1μM和/或具有1×10-3S-1或更慢的解離速率(koff)的那些TCR。例如，與以上詳述的那些TCR相比，本領域技術人員已知可能產生在其恒定和/或可變區中摻入了最小變化但不改變與SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物相互作用的親和力和/或解離速率的TCR。本發明范圍包括這類不重要的變體。其中含有一個或多個保守取代的那些TCR也構成本發明的一部分。
就廣義而言，本發明TCR可以如WO 04/033685和WO 03/020763所述為單鏈TCR(scTCR)或二聚體TCR(dTCR)形式。
合適的scTCR形式包括由對應于TCRα鏈可變區的氨基酸序列構成的第一區段，由對應于TCRβ鏈可變區序列并與對應于TCRβ鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成的第二區段，和連接該第一區段C末端與該第二區段N末端的接頭序列。
或者，所述第一區段可由對應于TCRβ鏈可變區氨基酸序列構成，所述第二區段可由對應于TCRα鏈可變區序列并與對應于TCRα鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成。
以上scTCR在第一和第二鏈之間還含有二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβT細胞受體中沒有等價物，其中該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置應使第一和第二區段的可變區序列的相互取向基本上如天然αβT細胞受體中的那樣。
更具體地說，第一區段可由對應于TCRα鏈可變區序列并與對應于TCRα鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成，第二區段可由對應于TCRβ鏈可變區序列并與對應于TCRβ鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成，和在第一和第二鏈之間可以存在天然αβT細胞受體中沒有等價物的二硫鍵。
在以上scTCR形式中，接頭基團可連接第一區段C末端和第二區段N末端，其可如式-PGGG-(SGGGG)n-P-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。
-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQ ID NO103)-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P (SEQ ID NO104)本發明TCR的合適dTCR形式含有其序列對應于TCRα鏈可變區序列并與對應于TCRα鏈恒定區胞外序列的N末端相融合的第一多肽，和其序列對應于TCRβ鏈可變區序列并與對應于TCRβ鏈恒定區胞外序列的N末端相融合的第二多肽，該第一和第二多肽通過在天然αβT細胞受體中沒有等價物的二硫鍵相連。
所述第一多肽可含有與對應于TCRα鏈恒定區胞外序列的N末端相融合的TCRα鏈可變區序列，而第二多肽的序列對應于TCRβ鏈可變區序列并與對應于TCRβ鏈恒定區胞外序列的N末端相融合，該第一和第二多肽通過取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基或其非人等價物之間的二硫鍵相連。(“TRAC”等在本文根據《T細胞受體手冊》(T cell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學出版社，ISBN 0-12-441352-8命名)。
本發明TCR的dTCR或scTCR形式可具有對應于人αβTCR胞外恒定和可變區序列的氨基酸序列，和在天然TCR中沒有等價物的二硫鍵可連接所述恒定區序列的氨基酸殘基。與在天然TCR中其β碳原子距離小于0.6nm的氨基酸殘基相對應的半胱氨酸殘基之間存在二硫鍵，例如在取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基或其非人等價物之間。就TCRα鏈而言，可引入半胱氨酸形成二硫鍵的其它位點是TRAC*01外顯子1中的以下殘基，就TCRβ鏈而言，是TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1中的以下殘基
除了以上提及的非天然二硫鍵以外，本發明TCR的dTCR或scTCR形式可在對應于天然TCR中通過二硫鍵連接的殘基的殘基之間含有二硫鍵。
本發明TCR的dTCR或scTCR形式的序列優選不含有對應于天然TCR的跨膜或細胞質序列。
本發明的優選實施方案提供由以下部分構成的可溶性TCRSEQ ID NO122的α鏈氨基酸序列和SEQ ID NO123的β鏈氨基酸序列；SEQ ID NO122的α鏈氨基酸序列和SEQ ID NO124的β鏈氨基酸序列；SEQ ID NO122、123和124的形式分別包含TCRα和β鏈序列中的N-末端甲硫氨酸(M)和N-末端“K”和“NA”。
PEG化的TCR單體在一個具體的實施方案中，本發明的TCR與至少一條聚亞烷基二醇鏈結合。本領域技術人員已知有許多方法可產生這種結合。在一優選的實施方案中，該聚亞烷基二醇鏈與TCR共價相連。在其它實施方案中，本發明該方面的聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個聚乙烯重復單位。
多價TCR復合物本發明一方面提供含有至少兩種本發明TCR的多價TCR復合物。在該方面的一個實施方案中，至少兩種TCR分子經接頭部分相連形成多價復合物。這些復合物優選水溶性的，所以應照此選擇接頭部分。此外，接頭部分優選能與TCR分子上所確定的位置相連，從而盡可能降低所形成復合物的結構多樣性。該方面的一個實施方案所提供的本發明TCR復合物中聚合物鏈或肽接頭序列延伸于不位于TCR可變區序列中的每種TCR的氨基酸殘基之間。
由于本發明復合物可用作藥物，接頭部分應該適當考慮它們的藥學適用性，例如它們的免疫原性來選擇。
例如，本領域已知符合以上所需標準的接頭部分的例子有連接抗體片段的技術。
兩類接頭優選用于產生本發明的多價TCR分子。其中TCR通過聚亞烷基二醇鏈相連的本發明TCR復合物提供了該方面的一個實施方案。
第一類是親水性聚合物，例如聚亞烷基二醇。最常用的該類聚合物是結構如下式所示的聚乙二醇或PEG。
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而其它聚合物可以基于其它合適的、任選取代的聚亞烷基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇與丙二醇的共聚物。
這種聚合物可用于處理或偶聯治療性藥物，特別是多肽或蛋白質治療劑來有益地改變該療劑的PK分布，例如降低腎廓清率、提高血漿半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。據信，PEG分子在治療劑周圍形成的“外殼”能在立體上阻礙治療劑與免疫系統反應并降低其蛋白酶降解從而導致PEG-治療偶聯物PK分布的這種改善。(Casey等，(2000)，Tumor Targetting，4 235-244)。所用親水性聚合物的分子大小可根據TCR復合物預定的治療應用來具體選擇。因此，例如當要該產品離開循環(系統)透過組織時，如用于治療腫瘤時，宜利用5 KDa級別的低分子量聚合物。已有許多綜述文章和書籍詳細描述了PEG和類似分子在藥物制劑中的應用。例如，參見Harris，(1992)，《聚乙二醇化學-生物技術和生物醫藥應用》(Polyethylene GlycolChemistry-Biotechnical and Biomedical Applications)，Plenum，New York，NY或Harris和Zalipsky，(1997)，《聚乙二醇化學和生物學應用ACS手冊》(Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACS Books)，Washington，D.C.。
所用的聚合物可具有線形或分支構型。可通過加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和賴氨酸來誘生分支PEG分子或其衍生物。
該聚合物一般在其結構中，例如在其一端或兩端，和/或骨架的支鏈處具有化學反應活性基團而使該聚合物能與PCR中的靶位點相連。如下所示，這種化學反應活性基團可與親水性聚合物直接相連，或者在親水性聚合物或反應活性化學(基團)之間可以具有間隔基團/部分反應活性化學(基團)-親水性聚合物-反應活性化學(基團)反應活性化學(基團)-間隔基團-親水性聚合物-間隔基團-反應活性化學(基團)用于形成以上概述的該類型構建物的間隔基團可以是無反應活性、化學穩定的、鏈狀任何有機部分。這種間隔基團包括但不限于以下基團-(CH2)n-，其中n＝2到5-(CH2)3NHCO(CH2)2其中二價亞烷基間隔基團位于聚亞烷基二醇鏈和其與該復合物的TCR連接點之間的本發明TCR復合物是該方面的另一種實施方案。
其中聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復單位的本發明TCR復合物是該方面的其它實施方案。
本發明可用的直接或經間隔基團與反應活性化學物質相連的親水性聚合物有許多商業供應商。這些供應商包括Nektar Therapeutics(CA，美國)、NOF Corporation(日本)、Sunbio(韓國)和Enzon Pharmaceuticals(NJ，美國)。
本發明可用的直接或經間隔基團與反應活性化學物質相連的親水性聚合物包括但不限于以下聚合物
可利用各種偶聯化學(物質)將聚合物分子偶聯于蛋白質和肽治療劑。選擇最合適的偶聯化學(物質)在很大程度上取決于所需的偶聯部位。例如，以下偶聯化學(物質)已用于連接PEG分子(來源Nektar分子工程目錄2003(Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003))的一個或多個末端N-馬來酰亞胺乙烯砜苯并三唑碳酸酯琥珀酰亞胺丙酸酯(Succinimidyl proprionate)琥珀酰亞胺丁酸酯硫代酸酯乙醛丙烯酸酯生物素伯胺如上所述，非PEG聚合物也可為本發明TCR的多聚化提供合適的接頭。例如，可以利用含有通過脂肪鏈相連的馬來酰亞胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，產品號22330和22323)。
肽接頭是另一類TCR接頭。這些接頭由氨基酸鏈組成，其作用為在TCR分子上產生可連接的簡單接頭或多聚化結構域。曾采用生物素/鏈霉親和素系統來產生體外結合研究用的TCR四聚體(參見WO/99/60119)。然而，鏈霉親和素是微生物來源的多肽，因此用于治療劑不理想。
其中TCR通過源自人多聚化結構域的肽接頭連接的本發明TCR復合物提供了本發明的另一種實施方案。
有許多含多聚化結構域的人蛋白質可用于產生多價TCR復合物。例如，與單體scFV片段相比，已用于產生scFv抗體片段四聚體的p53四聚化結構域顯示血清持久性增加和解離速率明顯降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血紅蛋白也具有可能用于該類應用的四聚化結構域。
含有至少兩種TCR的本發明多價TCR復合物提供了該方面的最后一種實施方案，該復合物中所述TCR的至少一種與治療性藥物結合。
在一方面，本發明TCR(或其多價復合物)或者還可在其α或β鏈的C-末端或N-末端包含反應活性半胱氨酸。
診斷和治療應用一方面，本發明TCR可以與治療性藥物或可檢測部分結合。例如，所述治療性藥物或可檢測部分可與TCR共價相連。
在本發明的一個實施方案中，所述治療性藥物或可檢測部分與一條或兩條TCR鏈的C-末端共價相連。
一方面，可利用可檢測部分，例如適用于診斷目的的標記物來標記本發明TCR的scTCR或一條或兩條dTCR鏈。這種標記的TCR可用于檢測SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的方法，該方法包括使TCR配體與該TCR配體特異性的TCR(或多聚高親和力TCR復合物)接觸；和檢測與該TCR配體的結合情況。在例如利用生物素化的異源二聚體形成的四聚體TCR復合物(檢測)中，可利用熒光鏈霉親和素來提供可檢測標記。這種熒光標記的TCR四聚體適用于FACS分析，例如來檢測攜帶這些高親和力TCR特異的SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的抗原呈遞細胞。
可檢測本發明可溶性TCR的另一種方法是利用TCR特異性抗體，特別是單克隆抗體。有許多商業可購得的抗-TCR抗體，例如αFl和βF1可分別識別α和β鏈的恒定區。
在其它方面，本發明TCR(或其多價復合物)或者還可與治療性藥物結合(例如，以共價或其它方式相連)，所述藥物可以是，例如用于殺傷細胞的毒性部分，或免疫效應分子，如白介素或細胞因子。與非多聚野生型或本發明的T細胞受體異源二聚體相比，本發明的多價TCR復合物對TCR配體的結合能力提高。因此，本發明的多價TCR復合物特別可用于在體外或體內追蹤或靶向呈遞特定抗原的細胞，也可用作中間體來產生具有這種用途的其它多價TCR復合物。因此，這些TCR或多價TCR復合物可以在體內應用的藥學上可接受的制劑中提供。
本發明也提供將治療性藥物遞送至靶細胞的方法，該方法包括在允許潛在的靶細胞與本發明TCR或多價TCR復合物結合的條件下使二者接觸，所述TCR或多價TCR復合物對SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物具有特異性并結合有治療性藥物。
具體地說，本發明的可溶性TCR或多價TCR復合物可用于將治療性藥物遞送至呈遞具體抗原的細胞。這可用于許多情況，特別是抵御腫瘤。治療性藥物的遞送應可在局部起作用而非只對與其結合的細胞起作用。因此，一種具體方案設想可采用與腫瘤抗原特異性的本發明TCR或多價TCR復合物相連的抗腫瘤分子。
為此可利用許多治療性藥物，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化療藥物(例如，順鉑)。為保證在所需部位發揮毒性作用，可將毒素包裹在與鏈霉親和素相連的脂質體內從而使該化合物緩慢釋放。這防止了毒素在體內轉運期間遭受破壞并且保證了TCR與相關的抗原呈遞細胞結合后毒素具有最大作用。
其它合適的治療性藥物包括·小分子細胞毒性藥物，即分子量小于700道爾頓，能殺傷哺乳動物細胞的化合物。這種化合物也可含有具有細胞毒性作用的毒性金屬。此外，應該理解這些小分子細胞毒性藥物也包括藥物前體，即能在生理條件下分解或轉變從而釋放細胞毒性藥物的化合物。這種藥物的例子包括順鉑、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、多西他賽(docetaxel)、鬼臼亞乙苷、吉西他濱(gemcitabine)、異環磷酰胺、依利替康(irinotecan)、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer sodiumphotofrin II、替莫唑胺(temozolmide)、拓撲替康(topotecan)、trimetreate glucuronate、奧利斯他汀E(auristatin E)、長春新堿和阿霉素；肽細胞毒素，即能殺傷哺乳動物細胞的蛋白質或其片段。包括但不限于蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素、假單胞菌細菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即一些元素的不穩定同位素，其在衰減同時發射一種或多種α或β粒子，或γ射線。包括但不限于；碘131、錸186、銦111、銥90、鉍210和213、錒225和砹213；也可利用螯合劑來促進這些放射性核素與高親和力TCR或其多聚體結合；·藥物前體，包括但不限于抗體定向的酶前體藥物；·免疫刺激劑，即能激活免疫應答的部分。包括但不限于細胞因子，例如IL-2和IFN；超抗原和其變體；TCR-HLA融合物和趨化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長刺激蛋白等；抗體或其片段；補體激活劑；異種蛋白結構域；同種蛋白結構域；病毒/細菌蛋白結構域；病毒/細菌蛋白肽和抗T細胞決定簇抗體(例如，抗-CD3或抗-CD28)。
功能性抗體片段和變體適用于本文所述組合物和方法的抗體片段和變體/同類物包括但不限于以下。
抗體片段本領域技術人員已知可能產生基本上保留了親代抗體相同結合特性的某給定抗體的片段。下文提供了這種片段的細節微小體(minibody)一這些構建物由具有截短的Fc部分的抗體組成。同樣，它們保留了其所衍生抗體的完整結合結構域。
Fab片段-這些(構建物)包含與免疫球蛋白重鏈的一部分共價相連的一條免疫球蛋白輕鏈。同樣，Fab片段包含一個抗原結合位點。Fab片段定義為用木瓜蛋白酶處理而釋放的IgG的一部分。這種片段一般可經重組DNA技術生產。(Reeves等，(2000)，《免疫學講稿》(Lecture Notes onImmunology)，(第四版)，Blackwell Science出版)F(ab’)2片段-這些(構建物)包含一種抗體的二個抗原結合位點和絞鏈區。F(ab’)2片段定義為用胃蛋白酶處理而釋放的IgG的一部分。這種片段一般可經重組DNA技術生產。(Reeves等，(2000)，《免疫學講稿》(LectureNotes on Immunology)，(第四版)，Blackwell Science出版)Fv片段-這些(構建物)包含與免疫球蛋白輕(鏈)可變區共價相連的免疫球蛋白重(鏈)可變區。已產生了許多Fv設計。這些(構建物)包含通過引入二硫鍵來增強兩結構域之間締合的dsFv。或者，可利用肽接頭將兩個結構域結合到一起成為一條多肽來形成scFv。也已產生了含有免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變區，并與相應的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變或恒定區相結合的Fv構建物。Fv也可多聚化而形成二抗體或三抗體(Maynard等，(2000)，Annu Rev Biomed Eng，2 339-376)。
NanobodiesTM-由Ablynx(比利時)投入市場的這些構建物包含衍生自camelid(例如，駱駝或美洲駝)抗體的一個合成的免疫球蛋白重(鏈)可變區。
結構域抗體-由Domantis(比利時)投入市場的這些構建物包含親和力成熟的一個免疫球蛋白重(鏈)可變區或免疫球蛋白輕(鏈)可變區。
抗體變體和同類物本發明抗體所定義的功能特性是它們能特異性結合靶配體。本領域技術人員已知可能工程改造許多其它蛋白質的這種結合特性。適用于本發明組合物和方法的抗體變體和同類物的例子包括但不限于以下。
基于蛋白質支架的多肽-該結合構建物家族包括含天然結合環的蛋白質的突變同類物。例子包括由Affibody(瑞典)投入市場，基于衍生自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的一個IgG結合結構域的三螺旋基序的Affibodies。另一例子是由EvoGenix(澳大利亞)投入市場，基于移植了類似于抗體結合環結構域的CTLA-4胞外結構域的Evibodies。最后一個例子是由Regeneron Pharmaceuticals(US)投入市場，將細胞因子受體結構域移植入抗體支架的Cytokine Traps。(Nygren等，(2000)Current Opinion inStructural biology，7 463-469)是利用支架來工程改造蛋白質中新結合位點的綜述。該綜述提及以下支架來源的蛋白質CP1鋅指(結構)、淀粉酶抑制肽(Tendamistat)、Z結構域(蛋白A同類物)、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1和細胞色素b562。其它蛋白質支架研究報道了纖連蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)和錨蛋白重復(單位)的應用。
本領域技術人員已知可以產生能與某給定蛋白配體不同部分結合的抗體或其片段，變體或同類物。例如，可產生針對形成CD3復合物多肽鏈(即，γ、δ、ε、ζ和η CD3鏈)之一的抗-CD3抗體。能與εCD3鏈結合的抗體是本發明組合物和方法所用的優選抗-CD3抗體。
本發明的可溶性TCR或多價TCR復合物可與能將藥物前體轉化為藥物的酶相連。這可使藥物前體只在所需部位轉化為藥物(即，通過sTCR靶向)。
預計本文所述的高親和力SLLMWITQC(SEQ ID NO125)-HLA-A*0201特異性TCR可用于癌癥的診斷和治療方法。
就癌癥治療而言，定位在腫瘤或轉移(性腫瘤)的附近可提高毒素或免疫刺激劑的效力。就疫苗遞送而言，可將疫苗抗原定位在抗原呈遞細胞附近，從而提高該抗原的效力。該方法也可應用于攝像目的。
分離能呈遞本發明TCR的細胞是實施方案之一。例如，所述細胞可以是T細胞。
本發明的其它實施方案是含有以下組分的藥物組合物
本發明的TCR或多價TCR復合物(任選與治療性藥物相結合)，或能呈遞至少一種本發明TCR的多個細胞與藥學上可接受的運載體。
本發明也提供一種癌癥治療方法，包括給予患癌癥的對象有效量的本發明TCR或多價TCR復合物(任選與治療性藥物相結合)，能呈遞至少一種本發明TCR的多個細胞。在一相關實施方案中，本發明提供本發明的TCR或多價TCR復合物(任選與治療性藥物相結合)，或能呈遞至少一種本發明TCR的多個細胞在制備治療癌癥組合物中的應用。
本發明的治療性或攝像TCR一般可作為含有藥學上可接受的運載體的無菌藥物組合物的一部分提供。該藥物組合物可采用任何合適的形式(取決于給予患者的所需方法)。該藥物組合物可以單位劑型提供，一般裝在密封容器中或作為試劑盒的一部分提供。這種試劑盒通常(雖然不一定)裝有使用說明書。該試劑盒可裝有多個所述單位劑型。
該藥物組合物可采用任何合適的途徑給予，例如胃腸外、透皮或經吸入，優選胃腸外(包括皮下、肌肉內，或最優選靜脈內)途徑。可通過藥學領域已知的任何方法，例如在無菌條件下混合活性成分與運載體或賦形劑來制備這種組合物。
取決于待治療的疾病或病癥、待治療個體的年齡和狀況等，本發明物質的劑量范圍很廣，醫師可最終確定所用的合適劑量。
其它方面本發明的scTCR或dTCR(優選由對應于人序列的恒定區或可變區序列構成)可以是基本純形式、或作為純化或分離的制劑提供。例如，可以基本上不含其它蛋白質的形式提供。
本發明也提供與SLLMWITQC-HLA-A*0201結合特性具有高親和力的TCR的制備方法。所述TCR的特征在于(i)含有至少一個TCRα鏈可變區和/或至少一個TCRβ鏈可變區，和(ii)對所述SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于1μM和/或對SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的解離速率(koff)為1×10-3S-1或更慢，該方法包括(a)制備含有1G4 TCR的α和β鏈可變區的TCR，其中α和β鏈可變區的一個或兩個在權利要求7和8中所鑒定的一個或多個氨基酸中含有突變；(b)在適合于TCR和SLLMWITQC-HLA-A*0201結合的條件下使所述突變的TCR與SLLMWITQC-HLA-A*0201接觸；和測定該相互作用的KD和/或koff。
本發明各方面的優選特征與已作了必要修正的其它各方面的一樣。本文提及的現有技術文件按照法律所允許的最大程度納入。
實施例以下實施例進一步描述了本發明，但不以任何方式限制本發明的范圍。
下文參考的附圖是圖1a和1b分別詳細描述了天然1G4 TCR的α鏈可變區氨基酸序列和β鏈可變區氨基酸序列。
圖2a和2b分別顯示了可溶性天然1G4 TCRα鏈和β鏈的DNA序列。
圖3a和3b分別顯示了從圖2a和2b的DNA序列產生的1G4 TCRα和β鏈胞外氨基酸序列。
圖4a和4b分別顯示了可溶性1G4 TCRα和β鏈的DNA序列經突變而含有額外的半胱氨酸殘基從而形成非天然的二硫鍵。陰影表示突變的密碼子。
圖5a和5b分別顯示了從圖4a和4b的DNA序列產生的1G4 TCRα和β鏈胞外氨基酸序列。陰影表示所引入的半胱氨酸。
圖6詳細描述了高親和力1G4 TCR變體的α鏈可變區氨基酸序列。
圖7詳細描述了高親和力1G4 TCR變體的β鏈可變區氨基酸序列。
圖8a詳細描述了可溶形式TRA的氨基酸序列。
圖8b詳細描述了可溶形式TRBC1的氨基酸序列。
圖8c詳細描述了可溶形式TRBC2的氨基酸序列。
圖9詳細描述了pEX954質粒的DNA序列。
圖10詳細描述了pEX821質粒的DNA序列。
圖11詳細描述了pEX202質粒的DNA序列。
圖12詳細描述了pEX205質粒的DNA序列。
圖13詳細描述了高親和力1G4 TCR變體的其它β鏈可變區氨基酸序列。
圖14a詳細描述了優選的可溶性高親和力1G4 TCR變體的α鏈氨基酸序列。
圖14b詳細描述了采用TRBC1恒定區的優選(c58c61)可溶性高親和力1G4TCR變體的β鏈氨基酸序列。
圖14c詳細描述了采用TRBC2恒定區的優選(c58c61)可溶性高親和力1G4TCR變體的β鏈氨基酸序列。
圖14d詳細描述了優選(c58c61)的可溶性高親和力1G4 TCR的β鏈氨基酸序列，其采用了經肽接頭與野生型人IL-2融合的TRBC2編碼的恒定區。
圖15a顯示了采用高親和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各種濃度范圍的NY-ESO-同類物SLLMWITQV肽脈沖的T2細胞的FAC染色。
圖15b顯示了采用高親和力c58c611G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各種濃度范圍NY-ESO-衍生SLLMWITQV肽脈沖的T2細胞的FAC染色。
圖16顯示了采用高親和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以產生SLLMWITQV肽的泛素小基因(±蛋白體抑制劑)轉染的SK-MEL-37、ScaBER、J82、HcT119和Colo 205癌細胞的FAC染色。
圖17顯示的ELISPOT數據證明可溶性高親和力c58c61 1G4 TCR能抑制抗MEL-624癌細胞的CTL激活。
圖18顯示的ELISPOT數據證明可溶性高親和力c58c61 1G4 TCR能抑制抗SK-MEL-37癌細胞的CTL激活。
圖19顯示了如IFNγ產生所檢測的那樣，可溶性c58c61高親和力1G4 TCR抑制了抗肽脈沖T2細胞的T細胞激活。
圖20顯示如IFNγ產生所檢測的那樣，可溶性野生型1G4 TCR不能抑制抗肽脈沖T2細胞的T細胞激活。
圖21顯示了可溶性c58c61高親和力1G4 TCR-IL-2免疫偶聯物導致的腫瘤生長抑制。
圖22顯示了熒光顯微術測定的Me1 526、Mel 624和SK-Mel-37癌細胞表面SLLMWITQC-HLA-A*0201抗原的數目。通過與鏈霉親和素-R-藻紅蛋白(PE)偶聯幫助目測與細胞結合的生物素化可溶性c58c61高親和力1G4 TCR。
實施例1-制備含有天然1G4 TCR可變區的二硫鍵連接的可溶性TCRRNA分離將10000克隆的T細胞重懸在100μl三試劑(tri-reagent)(Sigma)中按照生產商使用說明進行裂解分離得到總RNA。最后沉淀后，將RNA再溶解于12.5μl無RNA酶的水中。
制備cDNA在以上RNA樣品中加入2.5μl的10mM寡聚dT15(Promega)，60℃培育樣品2分鐘然后置于冰上。加入2μl RT緩沖液(10×)、2μl5mM dNTP、1μl Omniscript逆轉錄酶，用OmniscriptRT試劑盒(Qiagen)進行逆轉錄。混合樣品，37℃培育1小時。然后將cDNA保存在-80℃。
以上cDNA用作模板。采用含有所有可能的α和β可變鏈的一組正向引物來篩選并通過PCR擴增α和β鏈基因。利用得自《T細胞受體手冊》(T cellreceptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學出版社，ISBN0-12-441352-8的登錄號從NCBI網址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)設計用于TCR鏈基因擴增的引物序列。設計α鏈正向引物含有ClaI限制性位點和通用的α鏈反向引物含有Sall限制性位點。設計β鏈正向引物含有AseI限制性位點和通用的β鏈反向引物含有AgeI限制性位點。
TCR基因片段的受體載體以含有能在大腸桿菌菌株BL21-DE3(pLysS)中高水平表達的T7啟動子的pGMT7親代質粒為基礎(Pan等，Biotechniques(2000)，29(6)1234-8)。
用ClaI和SalII消化α鏈純化的PCR產物，連接入用ClaI和XhoI切割后的pEX954(見圖9)中。
用AseI和AgeI消化β鏈純化的PCR產物，連接入用NdeI/AgeI切割后的pEX821(見圖10)中。
連接按照生產商使用說明利用快速DNA連接試劑盒(Roche)連接切割的PCR產物和切割的載體。
將連接的質粒轉化入感受態大腸桿菌菌株XL1-藍細胞中接種于含有100mg/ml氨芐西林的LB/瓊脂板上。37℃培育過夜后，挑出單個菌落，37℃在含有100mg/ml氨芐西林的10ml LB中振蕩培養過夜。用Miniprep試劑盒(Qiagen)純化所克隆的質粒，用自動DNA測序儀(Lark Technologies)測序插入物。
圖4a和4b分別顯示了可溶性1G4 TCRα和β鏈的DNA序列經突變而含有額外的半胱氨酸殘基所形成的非天然二硫鍵。
圖5a和5b分別顯示了從圖4a和4b的DNA序列產生的NY-ESO TCRα和β鏈的胞外氨基酸序列。
實施例2-制備二硫鍵連接的可溶性1G4 TCR的高親和力變體如實施例1所述制備的二硫鍵連接的可溶性天然1G4 TCR可用作制備本發明的對SLLMWITQC(SEQ ID NO125)-HLA-A*0201復合物的親和力增加的TCR的模板。
圖6和7分別詳細列出了顯示對SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物具有高親和力的突變TCRα和β鏈可變區的氨基酸序列。(分別是SEQ ID No11-83和84-99)。本領域技術人員已知，可將制備這些突變鏈所需的密碼子變化通過定點誘變引入編碼這些鏈的DNA。(Stratagene的QuickChangeTM定點誘變試劑盒)。
簡言之，這可通過利用摻入了所需密碼子變化的引物和含有相關1G4 TCR鏈作為誘變模板的質粒來實現。
采用以下條件進行誘變50ng質粒模板、1μl的10mM dNTP、5μl生產商提供的10×Pfu DNA聚合酶緩沖液、25pmol正向引物、25pmol反向引物、1μl pfu DNA聚合酶，總體積50μl。2分鐘95℃初始變性步驟后，反應經過變性(95℃，10秒)、退火(55℃，10秒)和延伸(72℃，8分鐘)，共25輪。用DpnI限制性內切酶消化得到的產物以除去模板質粒并將其轉化入大腸桿菌XL1-藍菌株。通過測序來驗證誘變。
實施例3-制備可溶性“扣緊的”高親和力TCRα鏈-c-jun亮氨酸拉鏈(結構)通過PCR縫合(stitching)制備此構建物。
就基因的5’-端而言，將編碼高親和力TCRα鏈和含有所引入的鏈間二硫鍵的密碼子的質粒用作模板。用以下兩對引物進行PCR產生所需的可變區。
5’-TRAV21正向引物tctctcattaatgaaacaggaggtgacgcagattcct(SEQ ID NO105)C-α反向引物CGGCAGGGTCAGGGTTCTGG(SEQ ID NO106)就基因的3’-端而言，將編碼與人c-jun亮氨酸拉鏈區融合的野生型親和力TCRα鏈和不含有所引入的鏈間二硫鍵的密碼子的質粒用作模板。用以下引物對進行PCR產生所需的恒定區。
C-α正向引物CCAGAACCCTGACCCTGCCG(SEQ ID NO107)3’-α反向引物aagcttcccgggggaactttctgggctggg(SEQ ID NO108)混合兩種產物并稀釋1000倍，取1μl加入含5’-TRAV21正向引物和3’-α反向引物的50μl PCR(反應液)中用作模板。
用限制性內切酶AseI和XmaI消化得到的PCR產物，連接入用NdeI和XmaI切割后的pEX202中。
采用以下條件進行PCR50pg質粒模板、1μl的10mM dNTP、5μl生產商提供的10×Pfu DNA聚合酶緩沖液、25pmol正向引物、25pmol反向引物、1μl Pfu DNA聚合酶，總體積50μl。2分鐘95℃初始變性步驟后，反應經過變性(95℃，10秒)、退火(55℃，10秒)和延伸(72℃，2分鐘)，共30輪。
β鏈-c-fos亮氨酸拉鏈(結構)通過PCR縫合制備此構建物。
就基因的5’-端而言，將編碼高親和力TCRβ鏈和含有所引入的鏈間二硫鍵(的密碼子)的質粒用作模板。用以下兩引物進行PCR產生所需的可變區基因片段。
TRBV6-5正向引物tctctcattaatgaatgctggtgtcactcagacccc(SEQ ID NO109)C-β反向引物CTTCTGATGGCTCAAACACAGC(SEQ ID NO110)就基因的3’-端而言，將編碼與人c-fos亮氨酸拉鏈結構域融合的野生型親和力TCRβ鏈和不含有所引入的鏈間二硫鍵的密碼子的質粒用作模板。用以下兩種引物進行PCR產生所需的恒定區基因片段。
C-β正向引物GCTGTGTTTGAGCCATCAGAAG(SEQ ID NO111)TRBC反向引物aagcttcccggggtctgctctaccccaggc(SEQ ID NO112)混合兩種產物并稀釋1000倍，取1μl加入含TRBV6-5正向引物和TRBC反向引物的50μl PCR(反應液)中用作模板。如上所述進行PCR。
利用限制性內切酶AseI和XmaI消化得到的PCR產物并用NdeI和XmaI連接入pEX205切口。
實施例4-可溶性TCR的表達、重折疊和純化將實施例1、2或3所制備的分別含有突變的α-鏈和β-鏈的表達質粒分別轉化入大腸桿菌菌株BL21pLysS，將氨芐西林抗性的單個菌落于37℃在TYP(氨芐西林100μg/ml)培養基中生長至OD600為0.4，然后用0.5mM IPTG誘導蛋白質表達。誘導后3小時在Beckman J-6B中4000rpm離心30分鐘收集細胞。細胞沉淀重懸于含有50mM Tris-HCI、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、10mM DTT，pH 8.0的緩沖液中。凍融過夜后，在MilsonixXL2020超聲波儀中用標準的12mm直徑探頭對重懸細胞進行1分鐘爆發性超聲波處理，共約10分鐘。在Beckman J2-21離心機中13000 rpm離心30分鐘回收包涵體沉淀。然后用洗滌劑洗滌3次除去細胞碎片和膜組分。每次包涵體在Triton緩沖液(50mM Tris-HCI、0.5％Triton-X100、200mM NaCI、10mMNaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT，pH 8.0)中勻漿，然后在Beckman J2-21中以13000 rpm離心沉淀15分鐘。然后用以下緩沖液進行類似的洗滌除去洗滌劑和鹽50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮鈉、2mM DTT，pH 8.0。最后，將包涵體分為30mg等份試樣，-70℃冷凍。用6M胍-HCl溶解并用Bradford染料結合試驗(PerBio)來定量測定包涵體蛋白產量。
從冷凍儲備物中融解含約30mg TCRβ鏈和60mg TCRα鏈的溶解包涵體，然后混合樣品，將混合物稀釋在15ml胍溶液(6M鹽酸胍、10mM乙酸鈉、10mM EDTA)中以保證鏈完全變性。然后將含有完全還原變性的TCR鏈的胍溶液注入1升以下重折疊緩沖液中100mM Tris pH 8.5，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5mM還原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，5M脲，0.2mMPMSF。加入氧化還原對(2-巰基乙胺和胱胺(至終濃度分別為6.6mM和3.7mM))，約5分鐘后加入變性的TCR鏈。溶液放置5小時±15分鐘。重折疊的TCR在Spectrapor 1膜(Spectrum；產品號.132670)中用10L 10mM Tris、pH 8.1于5℃±3℃透析18-20小時。然后將透析緩沖液更換為新鮮的10mMTris pH 8.1(10L)，繼續5℃±3℃透析20-22小時。
將透析的重折疊物加樣于POROS 50HQ陰離子交換柱上，用Akta純化儀(Pharmacia)以超過50個柱體積的0-500mM NaCl梯度液洗脫結合的蛋白質從而將sTCR與降解產物和雜質分開。將諸峰組分保存于4℃，考馬斯染色SDS-PAGE分析，然后合并與濃縮。最后，用HBS-EP緩沖液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3.5 mM EDTA，0.05％乙基苯基聚乙二醇(nonidet p40))中預平衡的Superdex 200HR凝膠過濾柱純化和特征鑒定sTCR。合并與濃縮相對分子量約50 kDa的洗脫峰后用Biacore表面等離振子共振分析來特征鑒定。
實施例5-Biacore表面等離振子共振特征鑒定與特異性pMHC結合的sTCR用表面等離振子共振生物傳感器(Biacore 3000TM)分析sTCR與其肽-MHC配體的結合情況。制備以半定向方式固定在鏈霉親和素包被的結合表面上的單種pMHC復合物(描述于下文)有助于該項分析，可同時有效地測試可溶性T-細胞受體與多達4種不同pMHC(固定在不同的流動小室上)的結合情況。手動注入HLA復合物可以方便地操控固定的I類分子的精確水平。
在體外重折疊含有組成型亞基蛋白和合成肽的細菌表達的包涵體的生物素化I類HLA-A*0201分子，然后純化并進行體外酶(催化)生物素化(O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.2669-15)。表達的HLA-A*0201-重鏈含有以合適的結構取代了該蛋白質的跨膜和細胞質結構域的C-末端生物素化標簽。得到的包涵體表達水平約為75mg/升細菌培養液。MHC輕鏈或β2-微球蛋白也在大腸桿菌中以約500mg/升細菌培養液的水平以合適的結構表達為包涵體。
裂解大腸桿菌，將包涵體純化至約80％純。包涵體的蛋白質用6M胍-HCl、50mM Tris pH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA變性，通過在＜5℃時將變性蛋白質一次脈沖加入重折疊緩沖液中，以30mg/升重鏈、30mg/升β2m的濃度加樣HLA-A*0201分子，需要在0.4ML-精氨酸-HCl、100mM Tris pH 8.1、3.7mM胱胺、mM半胱胺、4mg/ml SLLMWITQC肽(溶液)中重折疊。重折疊在4℃至少進行1小時方達到完全。
用10倍體積的10mM Tris pH 8.1透析更換緩沖液。為充分降低溶液的離子強度，緩沖液需要更換兩次。然后將蛋白質溶液通過1.5μm乙酸纖維素濾膜過濾，加樣于POROS 50HQ陰離子交換柱上(床體積8ml)。用0-500mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白。HLA-A*0201-肽復合物大約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)，各組分冷藏于冰上。
用以相同緩沖液預平衡的Pharmacia快速脫鹽柱將生物素化標記pMHC分子的緩沖液更換為10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl。洗脫后立即將含有蛋白質的組分冷藏于冰上，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化試劑1mM生物素、5mM ATP(緩沖至pH 8)、7.5mM MgCl2和5μg/mlBirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.2669-15純化)。然后將混合物在室溫培育過夜。
采用凝膠過濾層析純化生物素化的pHLA-A*0201分子。用已過濾的PBS預平衡Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱，加入1ml生物素化反應混合物，用PBS以0.5ml/分鐘過柱。生物素化的pHLA-A*0201分子作為單峰洗脫約15ml。合并含有蛋白質的組分，在冰上冷藏，加入蛋白酶抑制劑混合物。采用考馬斯結合試驗(PerBio)測定蛋白質濃度，生物素化的pHLA-A*0201分子等份試樣保存在-20℃。采用標準的胺偶聯方法固定鏈霉親和素。
這種固定的復合物能結合T-細胞受體和輔助受體CD8αα，可將二者注射入溶液相。即使在低濃度(至少40μg/ml)也能獲得TCR的特異性結合，提示該TCR較穩定。如果采用溶液相或固定相的sTCR，觀察到sTCR的pMHC結合特性在質量和數量上相似。這是控制可溶性TCR部分活性的重要方法，也提示生物素化pMHC復合物與非生物素化復合物生物活性相同。
在Biacore 3000TM表面等離振子共振(SPR)生物傳感器上分析含有新的鏈間鍵的1G4 sTCR與其配體/MHC復合物或無關的HLA-肽混合物(制備方法如上所述)之間的相互作用。SPR檢測到在小流動室中接近傳感器表面的折射指數變化，以應答單位(RU)表示，此種原理可用于檢測受體配體相互作用并分析它們的親和力和動力學參數。通過交聯于β2m上的生物素和鏈霉親和素(二者用化學方法交聯于流動小室的活化表面)之間的結合作用將各個HLA-肽復合物固定在不同的流動小室中來制備探針流動小室。然后使sTCR以恒定流速流過不同流動小室的表面，再測定這樣做時的SPR應答來進行該試驗。
測定平衡結合常數制備WT IG4 sTCR的連續稀釋液，以5μl每分鐘的恒定流速注入兩個不同的流動小室；一個小室用約1000 RU的特異性SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物包被，第二個用約1000 RU的非特異性HLA-A2-肽復合物包被。用對照小室的測量值使每種濃度的應答標準化。將標準化數據應答對TCR樣品的濃度作圖并擬合為雙曲線計算出平衡結合常數KD。(Price和Dwek，《生物化學家的物理化學原理與問題》(Principles and Problems in Physical Chemistry forBiochemists)，(第二版)，1979，Clarendon Press，Oxford)。
測定動力學參數通過實驗性測定解離速率常數kd和結合速率常數ka來測定高親和力TCR的KD。平衡常數KD計算為kd/ka。
將TCR注入兩個不同的小室中，一個小室用約300 RU的特異性HLA-A2-nyeso肽復合物包被，第二個用約300 RU的非特異性HLA-A2-肽復合物包被。流速設置為50μl/分鐘。一般注入約3μM濃度的250μl TCR。然后使緩沖液流過直至應答(曲線)回歸至基線。用Biaevaluation軟件計算動力學參數。也將解離階段擬合為能計算半衰期的單指數衰退方程。
結果用以上方法分析了二硫鍵連接的可溶性天然1G4 TCR(由SEQ ID NO9和10分別詳細描述的α和βTCR鏈構成)和SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物之間的相互作用，顯示KD為15μM，koff為1.28×10-1S-1。
下表所述的TCR的KD小于或等于1μM和/或koff為1×10-3S-1或更慢。
實施例6-用高親和力c58c61 NY-ESO TCR-IL-2融合蛋白的體外細胞染色37℃用濃度范圍10-5-10-10M的NY-ESO-衍生的SLLMWITQC、NY-ESO-同類物SLLMWITQV肽或無關肽，脈沖T2成淋巴細胞樣細胞180分鐘。利用NY-ESO-同類物SLLMWITQV肽(V-變體肽)是因已知該肽對HLA-A*0201復合物結合槽的親和力高于天然NY-ESO-衍生的SLLMWITQC肽。脈沖后，用不含血清的RPMI洗滌細胞，將5×105個細胞室溫與高親和力c58c61 NY-ESO TCR-IL-2融合蛋白培育10分鐘，然后室溫與偶聯PE的抗-IL-2 mAb(Serotec)二抗培育15分鐘。洗滌后，用FACSVantage SE(BectonDickinson)作流式細胞術定量測定所結合的TCR-IL-2。也包括用肽-脈沖的T2細胞作對照，其中省去了TCR-IL-2。
圖14a詳細描述了c58c61 NY-ESO TCR的α鏈的氨基酸序列。(SEQ IDNO122)。
圖14c詳細描述了采用TRBC2編碼恒定區的c58c61 NY-ESO TCRβ鏈的氨基酸序列。
圖14d(SEQ ID NO125)詳細描述了采用經肽接頭與野生型人IL-2融合的TRBC2編碼恒定區的c58c61 NY-ESO TCRβ鏈的氨基酸序列。
可溶性c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白中含有的α和β鏈可變區突變分別對應于SEQ ID NO49和SEQ ID NO94中詳述的那些突變。應注意SEQ IDNO121-125提供的形式中包括在大多數其它TCRα鏈和β鏈氨基酸序列中已刪除的N-末端甲硫氨酸(M)與“K”和“NA”殘基。
在類似實驗中，利用以表達NY-ESO-衍生的SLLMWITQC肽的泛素小基因構建物轉染的SK-MEL-37、ScaBER、J82、HcT119和Colo 205癌細胞。基本上采用(Rimoldi等，(2000)，J.Immunol.，165 7253-7261)所述的方法轉染癌細胞。如上所述標記這些細胞。
結果圖15a顯示了采用高親和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各種濃度范圍的NY-ESO-同類物SLLMWITQV肽脈沖T2細胞的FAC染色。
圖15a顯示了采用高親和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各種濃度范圍的NY-ESO-同類物SLLMWITQV肽脈沖T2細胞的FAC染色。
圖15b顯示了采用高親和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以各種濃度范圍的NY-ESO-衍生SLLMWITQV肽濃度脈沖T2細胞的FAC染色。
圖16顯示了采用高親和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白，以產生SLLMWITQV肽的泛素小基因(±蛋白體抑制劑)轉染的SK-MEL-37、ScaBER、J82、HcT119和Colo 205癌細胞的FAC染色。
實施例9-CTL激活的ELISPOT試驗進行以下試驗來證明可溶性高親和力c58c61 NY-ESO TCR能抑制SLLMWITQC-HLA-A*0201特異性CTL克隆(1G4)的激活。利用IFN-γ產生作為CTL激活的讀出值。
試劑R10試驗培養基10％FCS(熱滅活，Gibco，目錄號10108-165)、88％RPMI1640(Gibco，目錄號42401-018)、1％谷氨酰胺(Gibco，目錄號25030-024)和1％青霉素/鏈霉素(Gibco，目錄號15070-063)。
肽(得自各種來源)最初以4mg/ml溶解于DMSO(Sigma，目錄號D2650)并冷凍。
洗滌緩沖液0.01M PBS/0.05％吐溫20(將Sigma的1袋含吐溫20的磷酸緩沖鹽，pH7.4(目錄號P-3563)溶解于1升蒸餾水中得到最終組成為0.01MPBS、0.138M NaCl、0.0027M KCl、0.05％吐溫20)。
PBS(Gibco，目錄號10010-015)。
EliSpot試劑盒含有所需的所有其它試劑，即捕獲與檢測抗體、脫脂奶粉、BSA、鏈霉親和素堿性磷酸酶、BCIP/NBT溶液(人IFN-g PVDF Eli-spot 20×96孔板(IDS目錄號DC-856.051.020，DC-856.000.000)。以下方法按照每個試劑盒提供但有所不同的使用說明書進行。
用胰蛋白酶37℃處理MEL-624和SK-MEL-37黑色素瘤細胞系5分鐘。然后用R10培養基洗滌并重懸細胞。
然后以每孔50000個靶細胞(50μl R10培養基)接種在96孔ELISPOT板上(Diaclone)。
在以上靶細胞培養液加入以下組分
50μl R10培養基配制的1×10-7M高親和力c58c61 TCR或無關TCR，50μl R10培養基配制的600個SLLMWITQC-HLA-A*0201特異性T細胞(克隆1G4)。
然后在37℃、5％CO2培育這些培養物24小時。按照生產商使用說明書處理ELISPOT板。
結果通過IFN-γ產生，檢測到可溶性高親和力c58c61 1G4 TCR強烈抑制了抗黑色素瘤細胞的1G4 T細胞克隆的激活。而無關的高親和力TCR無此抑制作用。(MEL-624癌細胞系的結果見圖17，SK-MEL-37癌細胞系的結果見圖18)實施例10-CTL激活的ELISA測定進行以下試驗證明了可溶性高親和力c58c61 1G4 TCR能抑制SLLMWITQC-HLA-A*0201特異性CTL克隆(1G4)的激活。利用IFN-γ產生作為CTL激活的讀出值。
試劑R10試驗培養基10％FCS(熱滅活，Gibco，目錄號10108-165)、88％RPMI1640(Gibco，目錄號42401-018)、1％谷氨酰胺(Gibco，目錄號25030-024)和1％青霉素/鏈霉素(Gibco，目錄號15070-063)。
肽(得自各種來源)最初以4mg/ml溶解于DMSO(Sigma，目錄號D2650)并冷凍。
洗滌緩沖液0.01M PBS/0.05％吐溫20(將Sigma的1袋含吐溫20的磷酸緩沖鹽，pH7.4(目錄號P-3563)溶解于1升蒸餾水中得到最終組成為0.01MPBS、0.138M NaCl、0.0027M KCl、0.05％吐溫20)。
PBS(Gibco，目錄號10010-015)。
ELISA試劑盒裝有除BSA(Sigma)以外的所需的所有其它試劑，即捕獲與檢測抗體、脫脂奶粉、鏈霉親和素-HRP、TMB溶液(人IFN-g Eli-pair 20×96孔板。以下方法基本上依據每個試劑盒提供的使用說明書進行。
方法根據生產商使用說明準備ELISA板。(Diaclone試劑盒，免疫診斷系統，英國)用含或不含不同濃度(100nM-10pM)的SLLMWITQC肽的R10培養基洗滌并重懸T2細胞系靶細胞，然后在37℃、5％CO2培育1小時。
然后以每孔10,000個靶細胞接種入96孔ELISA板。
在這些板的相關孔中加入以下組分50μl R10培養基配制的1×10-6M到3×10-12M高親和力c58c611G4TCR，50μl R10培養基配制的5000個效應細胞。
然后在37℃、5％CO2培育這些板48小時。按照生產商使用說明處理ELISA(板)。
結果通過IFN-γ產生，檢測到可溶性高親和力c58c61 1G4 TCR強烈抑制了抗肽脈沖靶細胞的1G4 T細胞克隆的激活。而野生型1G4 TCR無此抑制作用。(高親和力c58c61 1G4 TCR的結果見圖19，野生型1G4 TCR的結果見圖20)實施例11-利用高親和力c58c61 IG4 TCR-IL-2融合蛋白的體內靶向腫瘤進行該項工作研究了實施例6所述高親和力c58c61 1G4 TCR-IL-2融合蛋白能否抑制裸鼠中植入的人腫瘤細胞生長。
55只雌性裸鼠(HARLAN，法國)用于該項試驗。
所有動物皮下注射人黑色素瘤腫瘤形成細胞系(SK-MEL-37)，該細胞系穩定轉染了NY-ESO肽/泛素小基因構建物以確保合適的I類靶肽在細胞表面的表達增加。腫瘤在動物中生長5天以使腫瘤發育然后開始治療。
然后給大鼠以下靜脈內注射藥團劑量的c58c61高親和力NY-ESOTCR/IL-2融合蛋白劑量范圍為0.02-1.0mg/kg PBS配制的高親和力1G4 TCR/IL-2融合蛋白，在腫瘤移植5、6、7、8、11、13、17、20、24、28和30天后給予。所有實驗均包括單用PBS取代TCR/IL-2免疫偶聯物作治療的對照組。
然后用卡尺測定腫瘤大小，根據下式確定腫瘤體積(W2×L)/2，其中W＝腫瘤的最短直徑，L＝最長的直徑。
結果TCR/IL-2免疫偶聯物對腫瘤生長抑制的治療性效果見圖21。
結論如圖21所述的腫瘤生長曲線所示，TCR/IL-2免疫偶聯物顯示了明顯的劑量依賴性抗腫瘤作用。
實施例12-用高親和力c58c61 1G4 TCR進行熒光顯微術定量測定細胞表面TCR配體用高親和力c58c61 1G4 TCR通過單分子熒光顯微術定量測定了癌細胞(Mel 526、Mel 624和SK-Mel-37細胞系)上SLLMWITQC-HLA-A*0201抗原的數目(假定一種熒光信號與和靶細胞表面同源pMHC配體相結合的一種標記的TCR相關)。利用生物素化TCR靶向表達抗原的癌細胞以及隨后用鏈霉親和素-R藻紅蛋白(PE)偶聯物標記結合細胞的TCR有助于該定量測定。然后通過三維熒光顯微術拍攝各種PE分子圖像。
粘附細胞的染色。將癌細胞接種入含小室孔的載玻片(chamber wellslide)上，在培育箱中粘附過夜(37℃，5％CO2)。除去培養液換以新鮮的R10。除去培養液，用補加了400μM MgCl2的500μl PBS(PBS/Mg)洗滌細胞二次。細胞于4℃在200μl TCR溶液(含有0.5％BSA白蛋白的PBS/Mg配制的5μg/ml高親和力c58c61 1G4 TCR，或5μg/ml“無關的”HLA-A2-tax肽特異性高親和力TCR)中培育30分鐘。除去TCR溶液，用500μl PBS/Mg洗滌細胞三次。細胞于室溫在200μl鏈霉親和素-PE溶液中(含有0.5％BSA的PBS/Mg配制的5μg/ml鏈霉親和素-PE)黑暗培育20分鐘。除去鏈霉親和素-PE溶液，用500μl PBS/Mg洗滌細胞5次。除去洗滌培養液，將細胞維持在400μl攝像培養液中，然后通過熒光顯微術攝像。
熒光顯微術。用配有63×油鏡(Zeiss)的Axiovert 200M(Zeiss)顯微鏡進行熒光顯微術。裝有300W氙弧光燈(Sutter)的λLS光源用于照明，在光路中放置0.3到0.6的中性密度濾光片(neutral density filter)將光強度降低至最佳水平。用TRITC/DiI濾光片組(filter set)(Chroma)分開激發和發射光光譜。通過z-層(stack)采樣(21個平面，間隔1μm)三維攝像細胞。如(Irvine等，Nature，(419)，第845-9頁和Purbhoo等，Nature Immunology，(5)，第524-30頁)所述用Metamorph軟件(通用成像)進行圖像采集和分析。
結果如圖22所示，用以上方法成功地拍攝到與Mel 526、Mel 624和SK-Mel-37癌細胞表面SLLMWITQC-HLA-A*0201抗原相結合的高親和力1G4 TCR的圖像。
權利要求
1.一種T細胞受體(TCR)，所述T細胞受體對SLLMWITQC-HLA-A*0201具有結合特性并含有至少一個TCRα鏈可變區和/或至少一個TCRβ鏈可變區，其特征在于，所述TCR對所述SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于1μM和/或對SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的解離速率(koff)為1×10-3S-1或更慢。
2.如權利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR同時含有α鏈可變區和TCRβ鏈可變區。
3.如權利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αα或ββ同源二聚體。
4.如以上權利要求中任一項所述的T細胞受體(TCR)，其特征在于，所述KD和/或koff通過表面等離振子共振測定。
5.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，與天然1G4TCRα鏈可變區(SEQ ID No1)和/或β鏈可變區(SEQ ID NO2)相比，所述TCR在至少一個互補決定區中發生了突變。
6.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，與天然1G4TCRα鏈可變區(SEQ ID No1)和/或β鏈可變區(SEQ ID NO2)相比，所述TCR在其至少一個可變區的框架區中發生了突變。
7.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，采用SEQ IDNO1所示編號的以下一個或多個α鏈可變區氨基酸發生了突變20V、51Q、52S、53S、94P、95T、96S、97G、98G、99S、100Y、101I和103T。
8.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，采用SEQ IDNO2所示編號的以下一個或多個β鏈可變區氨基酸發生了突變18M、50G、51A、52G、53I、55D、56Q、70T、94Y、95V和97N。
9.如權利要求1到6中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR中含有采用SEQ ID NO1所示編號的一個或多個α鏈可變區氨基酸20A、51P、51S、51T、51M、52P、52F、52G、53W、53H、53T、94H、94A、95L、95M、95A、95Q、95Y、95E、95I、95F、95V、95N、95G、95S、95R、95D、96L、96T、96Y、96I、96Q、96V、96E、96X、96A、96W、96R、96G、96H、96K、96D、97D、97N、97V、97S、97A、97T、98P、98H、98S、98T、98W、98A、99T、99Y、99D、99H、99V、99N、99E、99G、99Q、99K、99A、99I、99R、100F、100M、100D、101P、101T、101M或103A。
10.如權利要求1到6或9中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR中含有采用SEQ ID NO2所示編號的一個或多個β鏈可變區氨基酸18V、50S、50A、51V、51I、52Q、53T、53M、55R、56R、70I、94N或94F、95L、97G或97D。
11.如權利要求1到6中任一項所述的TCR，所述TCR包含(SEQ ID No11到83)所示α鏈可變區氨基酸序列之一，所述TCR任選含有一個或多個表型沉默取代。
12.如權利要求1到6或11中任一項所述的TCR，所述TCR包含(SEQID No84到99，或117到121)所示的β鏈可變區氨基酸序列之一，所述TCR任選含有一個或多個表型沉默取代。
13.如權利要求2所述的TCR，所述TCR包含下表所示的α和β鏈可變區配對物，所述TCR任選含有一個或多個表型沉默取代
14.如權利要求2所述的TCR，所述TCR包含SEQ ID NO49所示α鏈可變區和SEQ ID NO94所示β鏈可變區，所述TCR任選含有一個或多個表型沉默取代。
15.如以上任一項權利要求所述的TCR，所述TCR還包含SEQ ID NO100所示α鏈恒定區氨基酸序列和/或SEQ ID NO101和102所示β鏈氨基酸恒定區序列之一，所述TCR任選含有一個或多個表型沉默取代。
16.如以上任一項權利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR是二聚體T細胞受體(dTCR)或單鏈T細胞受體(scTCR)。
17.如權利要求4到16中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是包含以下部分的scTCR由對應于TCRα鏈可變區的氨基酸序列構成的第一區段，由對應于TCRβ鏈可變區序列并與對應于TCRβ鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列N末端相融合的氨基酸序列構成的第二區段，連接該第一區段C末端與該第二區段N末端的接頭序列。
18.如權利要求4到16中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是包含以下部分的scTCR由對應于TCRβ鏈可變區的氨基酸序列構成的第一區段，由對應于TCRα鏈可變區序列并與對應于TCRα鏈恒定區胞外序列的氨基酸序列N末端相融合的氨基酸序列構成的第二區段，和連接該第一區段C末端與該第二區段N末端的接頭序列。
19.如權利要求17或18所述的TCR，其特征在于，所述TCR在第一和第二鏈之間還含有二硫鍵，所述二硫鍵在天然αβT細胞受體中沒有等價物，該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置使第一和第二區段的可變區序列的相互取向基本上如天然αβT細胞受體中那樣。
20.如權利要求17到19中任一項所述的scTCR，其特征在于，在連接部分中，接頭序列連接該第一區段C末端和該第二區段N末端。
21.如權利要求17到20中任一項所述的scTCR，其特征在于，在結合部分中，接頭序列如下式所示-PGGG-(SGGGG)5-P-(SEQ ID NO103)或-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQ ID NO104)，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。
22.如權利要求1、2或4到6中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是包含以下部分的dTCR第一多肽，其中對應于TCRα鏈可變區序列的序列與對應于TCRα鏈恒定區胞外序列的序列的N末端相融合，和第二多肽，其中對應于TCRβ鏈可變區序列的序列與對應于TCRβ鏈恒定區胞外序列的序列的N末端相融合，該第一和第二多肽通過在天然αβT細胞受體中沒有等價物的二硫鍵相連。
23.如權利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵連接所述恒定區序列的氨基酸殘基，所述二硫鍵在天然TCR中無等價物。
24.如權利要求23所述的TCR，其特征在于，所述二二硫鍵位于對應于天然TCR中β碳原子相距小于0.6nm的氨基酸殘基的半胱氨酸殘基之間。
25.如權利要求23所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵位于取代TRAC*01外顯子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 57或它們的非人等價物的半胱氨酸殘基之間。
26.如權利要求16到25中任一項所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR的結合部分在與天然TCR中通過二硫鍵連接的殘基相對應的殘基之間含有二硫鍵。
27.如權利要求14到24中任一項所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR結合部分不含與天然TCR的跨膜或胞質序列相對應的序列。
28.一種可溶性TCR，所述可溶性TCR由SEQ ID NO122的α鏈氨基酸序列和SEQ ID NO123的β鏈氨基酸序列構成。
29.一種可溶性TCR，所述可溶性TCR由SEQ ID NO122的α鏈氨基酸序列和SEQ ID NO124的β鏈氨基酸序列構成。
30.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，該TCR與至少一條聚亞烷基二醇鏈結合。
31.如權利要求30所述的TCR，其特征在于，所述聚亞烷基二醇鏈與所述TCR共價相連。
32.如權利要求30或31所述的TCR，其特征在于，所述聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復單位。
33.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR在其α或β鏈的C末端或N-末端還包含反應活性半胱氨酸。
34.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR與治療性藥物或可檢測部分結合。
35.如權利要求34所述的TCR，其特征在于，所述TCR與治療性藥物或可檢測部分共價相連。
36.如權利要求34所述的TCR，其特征在于，所述治療性藥物或可檢測部分與一條或兩條TCR鏈共價相連。
37.如權利要求34到36中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR與是免疫效應分子的治療性藥物結合。
38.如權利要求37所述的TCR，其特征在于，所述免疫效應分子是細胞因子。
39.如權利要求37所述的TCR，其特征在于，所述免疫效應分子是IL-2，或其功能性變體或片段。
40.如權利要求34到36中任一項所述的TCR，其特征在于，所述治療性藥物是細胞毒性藥物。
41.如權利要求34到36中任一項所述的TCR，其特征在于，所述治療性藥物是放射性核素。
42.一種多價TCR復合物，所述多價TCR復合物含有至少兩個如以上權利要求中任一項所述的TCR。
43.一種多價TCR復合物，所述多價TCR復合物含有至少兩個如以上權利要求中任一項所述的TCR并通過非肽聚合物鏈或肽接頭序列相連。
44.如權利要求43所述的TCR復合物，其特征在于，該聚合物鏈或肽接頭序列延伸在各TCR中不位于TCR可變區序列中的氨基酸殘基之間。
45.如權利要求43或44中任一項所述的TCR復合物，其特征在于，所述TCR通過聚亞烷基二醇鏈或衍生自人多聚化結構域的肽接頭相連。
46.如權利要求45所述的TCR復合物，其特征在于，二價亞烷基間隔基團位于所述聚亞烷基二醇鏈和其與該復合物的TCR連接點之間。
47.如權利要求43或44所述的TCR復合物，其特征在于，所述聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復單位。
48.一種多價TCR復合物，所述多價TCR復合物含有至少兩個如權利要求1到33中任一項所述的TCR，其中，(i)至少一個所述TCR如權利要求31到38中任一項所述地與治療性藥物結合。
49.一種分離的細胞，所述分離的細胞呈遞如權利要求1到26中任一項所述TCR。
50.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有如權利要求1到48中任一項所述的TCR或多價TCR復合物，或含有如權利要求49所述多個細胞，以及藥學上可接受的運載體。
51.一種治療癌癥的方法，所述方法包括給予患這種癌癥的對象有效量的權利要求1到48中任一項所述的TCR或多價TCR復合物，或給予權利要求49所述多個細胞。
52.權利要求1到48中任一項所述的TCR或多價TCR復合物，或權利要求49所述多個細胞在制備治療癌癥的組合物中的用途。
53.一種制備對SLLMWITQC-HLA-A*0201具有結合特性的高親和性TCR的方法，其特征在于，該TCR(i)含有至少一個TCRα鏈可變區和/或至少一個TCRβ鏈可變區，和(ii)對所述SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的KD小于1μM和/或對SLLMWITQC-HLA-A*0201復合物的解離速率(koff)低于1×10-3，所述方法包括(a)制備含有1G4 TCR的α和β鏈可變區的TCR，其中α和β鏈可變區的一個或兩個在權利要求7和8所鑒定的一個或多個氨基酸中含有突變；(b)在適合于TCR和SLLMWITQC-HLA-A*0201結合的條件下使所述突變的TCR與SLLMWITQC-HLA-A*0201接觸；并測定該相互作用的KD和/或koff。
全文摘要
本發明提供具有對SLLMWITQC－HLA－A*0201的結合特性的T細胞受體(TCR)，該SLLMWITQC肽衍生自許多癌細胞表達的NY－ESO－1蛋白。所述TCR對所述肽－HLA復合物的K
文檔編號A61K38/16GK1989153SQ200580016449
公開日2007年6月27日 申請日期2005年5月18日 優先權日2004年5月19日
發明者J·M·伯爾特, B·K·雅各布森, 李懿, P·E·莫洛伊, S·M·鄧恩 申請人:阿維德克斯有限公司