專利名稱：噻唑烷酮衍生物作為抗血管生成劑的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及能夠抑制HIF-1α轉錄因子與其輔激活物p300之間相互作用并防止血管內皮細胞生長因子生成的噻唑烷酮化合物。
背景技術：
血管內皮細胞生長因子在生理和生理病理性血管生成過程中扮演關鍵角色。眾多機制牽涉于VEGF基因的調節中，其中基本的角色由組織氧張力扮演，如在體內和體外低氧條件下VEGF mRNA水平的可逆增加所證明。VEGF mRNA的表達增加主要通過轉錄因子HIF-1(低氧誘導型因子-1)來介導，其結合于VEGF基因啟動子區域的結合位點。
大量試驗資料顯示HIF-1是氧體內平衡的總體調節劑，HIF-1的活性受損促進腫瘤細胞的存活、增殖、侵襲和轉移(1)。因此已經建議集中于抑制HIF-1活性的治療策略可能增加癌癥患者的存活率(2)。
HIF-1是一種雜二聚體，由HIF-1α和HIF-1β亞單位組成，它們發生二聚化并通過bHLH-PAS結構域結合于DNA(3)。HIF-1α亞單位的表達受到組織氧張力的嚴格調節(4)，其通過由VHL蛋白與HIF-1α的結合所介導的遍在蛋白化和蛋白酶體降解過程調節。這類相互作用僅當HIF-1α已經在402和564脯氨酸殘基處被羥化時發生。氧是修飾HIF-1α的脯氨酰-羥化酶的限制性底物(5)。HIF-1α的表達隨著O2濃度降低呈指數方式增加，并且決定HIF-1的總體活性水平。
HIF-1α反式激活域的功能還受到由氧部分壓力控制的負性調節。N-末端反式激活域通過VHL和結合于VHL和HIF-1α二者的HIF-1抑制因子(FIH-1)對組蛋白脫酰酶的募集而受到負性調節(6)。
HIF-1活化通過p300/CBP輔激活物而發生，所述p300/CBP輔激活物以物理方式與HIF-1結構域的活化相互作用，促進基因如VEGF的轉錄(7)。p300和CBP還都是其他轉錄因子如Stat-3、NF-κB、p53的輔激活物。
p300/CBP和HIF-1的相互作用對于轉錄是必不可少的，近期的出版物已經證實了HIF-1/p300相互作用對腫瘤生長的重要性(8)。HIF-1α C-末端反式激活域(C-TAD)結合于被稱為CH1的p300和CBP結構域。CBP和p300與HIF-1α的結合通過FIH-1對C-末端激活域中天冬酰胺83的氧依賴性羥化作用而受到負性調節。由此，低氧可引起對蛋白酶體降解的穩定化和HIF-1的轉錄活性。
HIF-1α TAD-C和p300或CBP的CH1結構域之間相互作用的結構細節已有闡述(9，10)。p300/CBP和被認為是Hif-1α活性負性調節劑(11)的CITED2蛋白(也稱為p35srj)之間相互作用的細節也已公開。
HIF-1活化誘導眾多基因的轉錄，所述基因涉及于血管生成因子、葡萄糖載體、糖酵解酶、存活、遷移和侵襲因子的生成，而這些對于腫瘤進展特別重要。
Hif-1α的異常表達可見于超過70％的人類腫瘤和它們的轉移中，并且與血管形成增加和腫瘤進展相關聯(12-14)。在臨床實踐中，Hif-1α的異常表達與眾多腫瘤病變的治療失敗和死亡率增加相關，如非小細胞肺癌(15)、口咽鱗狀細胞癌(16)、早期宮頸癌(17)、頭頸癌(18)、突變p53卵巢癌(19)、少突神經膠質細胞瘤(20)和BCL-2陽性食道癌(21)。
在文獻中已經描述了抑制HIF-1活性的各種方法。它們中的一些提示使用Hif-1α的反義寡核苷酸或Hif-1α的顯性陰性形式。
在藥理學方法中，已經描述了通過間接機制發揮作用的Hif-1α活性抑制劑，如PI3K-mTOR抑制劑(22-23)和MEKK(24)抑制劑，其作用于控制Hif-1α活性的信號轉導；HSP90侶伴蛋白質抑制劑(25)；硫氧還蛋白還原酶抑制劑，其修飾細胞的氧化還原狀態發揮作用(26)；使微管去穩定化的分子，如2-甲氧基雌二醇(27)和埃坡霉素(28)。近期，裸鼠中移植的人腫瘤中PX-478(美法侖N-氧化物)對Hif-1α水平的組成型和低氧誘導型抑制已有報道。該化合物顯示顯著的抗腫瘤效果。但是，該化合物的作用機制尚不完全清楚(29)。
最后，近期已報道毛殼菌素——毛殼菌屬(Chaetomium sp)真菌的二硫代二氧代哌嗪代謝物——干擾Hif-1α與p300的結合。該化合物改變p300CH1結構域的結構，從而防止其與Hif-1α相互作用。向荷有腫瘤的小鼠施用毛殼菌素可抑制腫瘤中低氧誘導型轉錄和腫瘤生長(30)。因此，提供能夠抑制HIF-1α與p300結合的進一步化合物將是有利的。
US 2004/002526 A1公開了用作磷酯酶D抑制劑的噻唑烷酮化合物，WO 98/53790公開了可用作抗腫瘤劑的噻唑烷酮類化合物。
發明內容
現已發現一些噻唑烷酮類化合物抑制Hif-1α和p300之間的相互作用并防止低氧條件下腫瘤細胞中VEGF的生成。所述化合物因此可用于控制血管生成和腫瘤生長。
相應地，本發明涉及通式(I)化合物在制備用于治療其中抑制HIF-1α和p300之間相互作用是有益的病變的藥物組合物中的用途， 其中R1是芳基或雜芳基；R2是烷基、鏈烯基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基；X是氧或硫。
對于本申請的目的“烷基”是包含1至10個碳原子、優選1至8個碳原子的直鏈或支鏈烴，任選被一個或多個獨立地選自以下的基團取代環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基和取代的氨基；“芳基”是包含6至14個碳原子的不飽和環狀芳族烴，任選被一個或多個獨立地選自以下的取代基取代烷基、芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基。
“雜芳基”是含有一個或多個優選選自氮、氧和硫的原子的5-至10-元單環或稠合芳族環，任選被一個或多個獨立地選自以下的基團取代烷基、芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“環烷基”表示含有3至8個碳原子的環狀烷基，任選被一個或多個選自以下的取代基取代烷基、芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“雜環烷基”是飽和或部分不飽和的單環或稠合環，含有一個或多個優選選自氮、氧和硫的原子，且任選被一個或多個獨立地選自以下的基團取代烷基、芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“鏈烯基”是直鏈、環狀或支鏈的單價烴基，包含至少一個碳碳雙鍵，任選被一個或多個獨立地選自以下的基團取代烷基、酰基、環烷基、雜環烷基、芳基、鹵代烷基、烷氧基和取代的氨基；“烷氧基”是直鏈或支鏈C1-C4烷氧基；“取代的氨基”是-NRR基團，其中每個R基團獨立地選自氫、酰基、烷基、環烷基、芳基，或R基團可與氮原子一起形成5-或6-元雜環；“鹵素”或前綴“鹵代”表示氟、氯、溴和碘；“酰基”表示-C(O)-R”基團，其中R”優選選自氫、羥基、烷基、鹵代烷基、環烷基；芳基，任選被一個或多個烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵素和取代的氨基取代；雜芳基，任選被一個或多個烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代和取代的氨基取代；以及任選被一個或多個烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代和取代的氨基取代的環。根據本發明的優選化合物為那些化合物，其中R1是取代或未取代的呋喃；R2是取代或未取代的苯基或芐基，或(2-噻吩基)-甲基、嗎啉基-丙基、苯基乙基和(3，4-二甲氧基苯基)乙基且X是硫。
“取代的呋喃”優選表示被苯基取代的呋喃基，苯基任選被一個或多個選自上述的基團取代，優選羧基、甲氧基羰基、氰基、磺酰氨基和羥基乙氧基。“取代的苯基或芐基”優選表示被一個或多個選自甲基、三氟甲基、甲氧基、亞甲二氧基的基團取代的苯基或芐基。
最優選以下化合物2-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸甲基酯(1)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(2)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(3)；4-{5-[3-(2-三氟甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(4)；4-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)呋喃-2-基]芐腈(5)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]呋喃-2-基-}芐腈(6)；4-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]苯磺酰胺(7)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(8)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(9)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(10)；4-{5-[3-(3，4-亞甲二氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(11)；4-{5-[3-(3，4-亞甲二氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(12)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(13)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(14)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(15)；4-{5-[3-(嗎啉-4-基-丙基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(16)；4-{5-[3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(17)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(18)；4-{5-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(19)；4-{5-[3-[2-(苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(20)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(21)；2-{5-[4-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基]苯氧基}乙醇(22)；3-芐基-5-[[5-(2-甲氧基苯基)呋喃-2-亞基甲基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷(23)；2-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸(24)。
在這些化合物中，最優選2-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯。
除了化合物1和16外，上述化合物是本發明的另一目的。
本發明的化合物可根據已知方法合成，例如US 2004/0002526 A1所述的方法，其包括縮合3位適當取代的2-硫代-噻唑烷-4-酮和適當取代的呋喃甲醛，或根據Tetrahedron Lett.，44，4257(2003)，Bioorg.Med. Chem.Lett.，12，2681(2002)，J.Med.Chem.，41，2390(1998)所述方法合成。
以下方案具體闡述了4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯的合成。
方案1 方案2 其中M是Li，Zn或Bu3Sn且DBA是二亞芐基丙酮作為替代選擇，化合物(III)可根據以下方案合成
方案3 方案4 方案5 方案1至5中所報告的所有試劑可利用已知方法合成且市售可得。
本發明的化合物抑制HIF-1α和p300之間的相互作用，IC50范圍為0.5至25μM，并抑制低氧條件下腫瘤細胞中VEGF的生成，IC50范圍為0.10至100μM。
所述化合物因此可用于制備用于治療其中抑制HIF-1α和p300之間相互作用是有益的病變的藥物組合物。所述組合物可以是固體、半固體或液體，優選為溶液、混懸液、粉末、顆粒、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、氣霧劑或控釋系統形式。所述組合物可以通過不同途徑施用，特別是通過口服、透皮、皮下、靜脈內、肌肉內、直腸和鼻內途徑。每劑量單位中活性成分的量取決于形式和施用途徑、化合物、所治療疾病，但通常為0.1至1000mg、優選1至600mg。制備藥物組合物的原則和方法對于本領域技術人員而言是已知的并且例如在Remington’s PharmaceuticalScience，Mack Publishing Company，Easton(PA)中述及。
適當配制的本發明化合物可用于治療其中血管生成作為致病因素參予的多種病變，例如不同形式的實體腫瘤、糖尿病性視網膜病、類風濕性關節炎、銀屑病、emangioma、硬皮病、新血管生成性青光眼。特別敏感于式(I)化合物的實體腫瘤包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、神經母細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤、黑素瘤、中樞神經系統癌癥、鱗狀細胞口咽癌、宮頸癌、卵巢、食道、腎、結腸、頭頸癌和少突神經膠質細胞瘤。
因此，本發明還涉及抑制細胞中VEGF生成的方法，該方法包括使所述細胞與有效量的式(I)化合物相接觸。
以下試驗部分將更為詳細地闡述本發明。
實驗部分化合物的合成通用工藝A實施例-4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯將5-溴呋喃甲醛(2.43g，13.9mmole)、4-(甲氧基羰基)苯基代硼酸(2.50g，13.9mmole)、三(二亞芐基丙酮)鈀(0)(192mg，0.2mmole)和氟化鉀(2.42g，41.7mmole)在1，4-二烷(100ml)中的溶液添加至三叔丁基膦在己烷中的溶液(以重量計10％，101mg，0.5mmole)。在65-70℃加熱4小時后，將混合物冷卻至室溫并用二氯甲烷(150ml)處理。攪拌10分鐘后，混合物經硅藻土過濾，在減壓下濃縮濾液。殘余物經快速硅膠色譜純化，用乙酸乙酯-己烷混合物(1∶1)洗脫，得到4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(2.6g，81％產率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.70(s，1H)，8.10(d，2H)，7.90(d，2H)，7.35(d，1H)，6.95(d，1H)，3.98(s，3H)。
通用工藝B實施例-3-(3-嗎啉代-4-基-丙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮將三硫代碳酸二(羧甲基)酯(498mg，2.2mmole)、碳酸鉀(138mg，1.0mmole)和4-(3-氨基丙基)嗎啉(288mg，2.0mmole)在水(20ml)中的懸液回流12小時。加入水(10ml)后，將混合物冷卻至室溫，用10％甲醇-二氯甲烷萃取(3×50ml)。合并萃取液，經無水硫酸鎂干燥，在減壓下濃縮。殘余物經快速硅膠色譜純化，用10％甲醇-二氯甲烷洗脫，得到3-(3-嗎啉代-4-基-丙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(252mg，48％產率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.10(dd，2H)，3.95(s，2H)，3.55-3.70(m，4H)，2.30-2.50(m，6H)，1.70-1.90(m，2H)。
通用工藝C實施例-4-{5-[3-(3-嗎啉代-4-基-丙基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}-苯甲酸甲基酯將4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(59mg，0.27mmole)和3-(3-嗎啉代-4-基-丙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(72mg，0.27mmole)在乙醇(10ml)中的溶液添加哌啶(1滴)。回流下加熱6小時后，在減壓下濃縮混合物。殘余物經快速硅膠色譜純化，用10％甲醇-二氯甲烷洗脫，得到標題化合物(32mg，25％產率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.15(d，2H)，7.75(d，2H)，7.50(s，1H)，6.95-7.05(m，2H)，4.20(t，2H)，3.95(s，3H)，3.90(t，2H)，3.58-3.75(m，2H)，2.30-2.60(m，6H)，1.80-2.00(m，2H)。
4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)苯磺酰基酰胺將4-(三丁基甲錫烷基)苯磺酰基酰胺(2.77g，6.21mmole)和二(三苯基膦)氯化鈀(II)(436mg，0.62mmole)在乙醇(65ml)中的混合物在氬氣氛下回流18小時。冷卻至室溫后，加入乙醚(200ml)，混合物經硅藻土真空過濾。在減壓下濃縮濾液，殘余物經快速硅膠色譜純化，用20％乙酸乙酯-己烷洗脫，得到標題化合物(450mg，29％產率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.70(s，1H)，7.90-8.10(m，4H)，7.40(d，1H)，7.00(d，1H)，4.90(br s，2H)。
3-芐基-2-硫代-噻唑烷-4-酮按照通用工藝B，使三硫代碳酸二(羧甲基)酯(2.50g，11.0mmole)與芐胺(1.07g，10.0mmole)反應。用70％二氯甲烷-己烷洗脫經快速硅膠色譜處理后，獲得標題化合物(960mg，43％產率)。
4-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]-苯磺酰胺將4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)苯磺酰基酰胺(50mg，0.2mmole)和3-芐基-2-硫代-噻唑烷-4-酮(44.6mg.0.2mmole)在乙醇(5ml)中的溶液添加哌啶(1滴)，將混合物回流30分鐘。冷卻至0-5℃后，過濾固體，用冷乙醇洗滌(2×5ml)，在真空下干燥，得到標題化合物(73mg，80％產率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)d7.95-8.25(m，4H)，7.75(s，1H)，7.20-7.55(m，10H)，5.25(s，2H)。
4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-芐腈按照通用工藝A，使5-溴呋喃甲醛(3.50g，0.2mole)與4-氰基代硼酸(2.94g，0.2mole)反應。常規處理混合物并經50％乙酸乙酯-己烷洗脫的硅膠柱色譜純化后，獲得標題化合物(2.60g，66％產率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.70(s，1H)，8.00(d，2H)，7.80(d，2H)，7.40(d，1H)，7.00(d，1H)。
2-硫代-3-(3，4-二甲氧基-苯基乙基)-噻唑烷-4-酮按照通用工藝B，使硫代碳酸二(羧甲基)酯(905mg，4.0mmole)與3，4-二甲氧基-芐基胺(363mg，2.0mmole)反應，經快速硅膠色譜、用70％二氯甲烷-己烷洗脫后，獲得標題化合物(420mg，71％產率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.70-6.90(m，3H)，4.20(t，2H)，4.00(s，2H)，3.90(s，3H)，3.85(s，3H)，2.95(t，2H)。
4-(5-{3-[2-(3，4-二甲氧基-苯基)-乙基]-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基}-呋喃-2-基)-芐腈按照通用工藝C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-芐腈(39.4mg，0.2mmole)與2-硫代-3-(3，4-二甲氧基-芐基)-噻唑烷-4-酮(59.4mg，0.2mmole)反應，得到標題化合物(58mg，61％產率)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.95-8.25(m，4H)，7.75(s，1H)，7.60(d，1H)，7.40(d，1H)，6.7-6.90(m，3H)，4.25(t，2H)，3.75(s，3H)，3.70(s，3H)，2.95(s，2H)。
3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮按照通用工藝B，使三硫代碳酸二(羧甲基)酯(905mg，4.0mmole)與2-苯基乙基胺(242.4mg，2.0mmole)反應。經70％二氯甲烷-己烷洗脫的快速硅膠色譜處理后，獲得標題化合物(246mg，52％產率)。
1HMR(300MHz，CDCl3)δ7.15-7.40(m，5H)，4.20(t，2H)，3.95(s，2H)，3.00(t，2H)。
4-[5-(4-氧代-3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]-芐腈按照通用工藝C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-芐腈(39.4mg，0.2mmole)與3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(47.4mg，0.2mmole)反應，得到標題化合物(64mg，76％產率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.95-8.25(m，4H)，7.75(s，1H)，7.55(d，1H)，7.40(d，1H)，7.10-7.35(m，5H)，4.24(t，2H)，3.00(t，2H)。
3-噻吩甲基-2-硫代-噻唑烷-4-酮按照通用工藝B，使三硫代碳酸二(羧甲基)酯(905mg，4.0mmole)與2-(氨基甲基)噻吩(226.4mg，2.0mmole)反應，得到標題化合物(320mg，70％產率)。
1HNMR(CDCl3)δ7.15-7.35(m，2H)，6.85-7.05(m，1H)，5.35(s，2H)，4.00(s，2H)。
4-[5-(4-氧代-3-噻吩-2-基-甲基-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]-苯甲酸甲基酯按照通用工藝C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(46.0mg，0.2mmole)與3-噻吩甲基-2-硫代-噻唑烷-4-酮(45.8mg，0.2mmole)反應，得到標題化合物(38.7mg，44％產率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.15(d，2H)，7.85(d，2H)，7.50(s，1H)，7.20-7.30(m，2H)，6.90-7.05(m，3H)，5.50(s，2H)，3.98(s，3H)。
4-[5-(4-氧代-3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]-苯甲酸甲基酯按照通用工藝C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(46.0mg，0.2mmole)與3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(47.4mg，0.2mmole)反應，得到標題化合物(39.2mg，44％產率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.00(d，2H)，7.65(d，2H)，6.70-7.15(m，8H)，4.15(t，2H)，3.88(s，3H)，2.85(t，2H)。
4-(5-{3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)-乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基}-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯按照通用工藝C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(46.0mg，0.2mmole)與2-硫代-3-[2-(3，4-二甲氧基-苯基乙基)]-噻唑烷-4-酮(59.4mg，0.2mmole)反應，得到標題化合物(46.7mg，46％產率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.20(d，2H)，7.85(d，2H)，7.50(s，1H)，6.85-7.05(m，5H)，4.45(t，2H)，4.00(s，3H)，3.88(s，3H)，3.85(s，3H)，2.95(t，2H)。
3-(4-甲基-芐基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮按照通用工藝B，使三硫代碳酸二(羧甲基)酯(905mg，4.0mmole)與4-甲基-芐基胺(242mg，2.0mmole)反應，得到標題化合物(250mg，53％產率)。
1HNMR(CDCl3)δ7.40(d，2H)，7.15(d，2H)，5.20(s，2H)，4.00(s，2H)，2.35(s，3H)。
4-{5-[3-(4-甲基-芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}-苯甲酸甲基酯按照通用工藝C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(46.0mg，0.2mmole)與3-(4-甲基-芐基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(47.4mg，0.2mmole)反應，得到標題化合物(46.7mg，46％產率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.20(d，2H)，7.85(d，2H)，7.50(s，1H)，7.40(d，1H)，7.15(d，1H)，6.90-7.05(m，4H)，5.30(s，2H)，3.95(s，2H)，2.30(s，3H)。
Biot-HIF-1α786-826/GST-p300323/423抑制的初步生物化學試驗利用熒光測定法(DELFIATM)評價了化合物抑制Hif-1α和p300之間相互作用的能力。對Freedman SJ等人，Nature Structural Biology 2003，10(7)，504-512所述方法進行適當改進。
對應于C-末端786-826氨基酸的人生物素化Hif-1α片段(生物素化Hif-1α786-826)得自AnaSpec Inc(San Josè，California，USA)并未經進一步純化使用。
將表達GST-p300323-423片段的構建體在E.coli的BL21株(DE3)中轉化。所述構建體通過在表達載體pGEX-4T-1(Amersham No.27-45-80-01)中克隆編碼氨基酸323至423的p300區域的DNA序列而獲得；所述DNA序列通過PCR(聚合酶鏈發應)獲得。用1mM異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)誘發蛋白表達。在適合的緩沖液(50mM Tris.HCl pH 8.00、100mM NaCl、0.1mM ZnSO4、1mM DTT、0.1mg/ml溶菌酶和一片完全無EDTA蛋白酶抑制劑合片(Roche，目錄號1 873 580))存在下通過超聲溶解細菌，將存在于可溶級分中的GST融合蛋白用谷胱干肽-瓊脂糖4B樹脂(Amersham Biosciences；no.27-4574-01)純化。按照Bradford的Biorad測定法(Bradford M.，Anal.Biochem.，72，248，(1976))測定蛋白最終濃度，通過SDS-PAGE評價樣品純度。將樣品貯存于-80℃的50％甘油中。
利用NUNC Maxisorp 96-孔板如下進行試驗。
將C96 NUNC Maxisorp板(得自Nunc，產品編號446612)與鏈酶抗生物素蛋白(Sigma；產品編號S 4762)孵育過夜，所述鏈酶抗生物素蛋白在PBS緩沖液(磷酸緩沖的鹽水10mM磷酸鈉、150mM氯化鈉pH 7.4)中的終濃度為1μg/ml。隨后將每孔用3×300μl TBST緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、0.05％(v/v)Tween 20)洗滌。然后每孔添加生物素化Hif-1α786-826在TBSB(50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、5％(w/v)BSA(Sigma，產品編號A 2153))中的100μl10nM溶液，并在25℃孵育1小時。在每張板的最后一排，僅加入TBSB緩沖液。隨后用3×300μl TBST緩沖液洗滌每孔。如此制備的板作為試驗板。
另外，制備每孔含有10μl濃度10μM的每種供試化合物的DMSO溶液的板(子板)。向該板添加100μl用孵育緩沖液(TBSB，添加有0.1％(v/v)Tween 20、0.5mM DTT、10μM ZnCl2)稀釋的111pM GST-p300323-423溶液，并混合全部物質。將100μl子板所含混合物立即轉移至試驗板。
用濃度為10μM的80種不同的化合物制備每張子板，最后兩排孔除外，其中每孔添加10μl DMSO。這兩排代表陽性(11排，+Hif-1)和陰性(12排，-Hif-1)對照。
在25℃孵育1小時后，將各孔用3×300μlTBST緩沖液(50mMTris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、0.05％(v/v)Tween 20)洗滌。然后向各孔添加溶于100μl含10μM ZnCl2的TBST緩沖液中的60.8ng銪-標記的抗-GST抗體(DELFIA Eu-N1標記的；Perkin Elmer；產品編號A D 0251)。在室溫孵育1小時后，用3×300μlTBST緩沖液洗滌各孔，然后加入100μl信號擴增溶液(增強溶液，Perkin Elmer產品編號1244-105)。
然后利用FUSION alpha-FP-HT讀數儀(Perkin Elmer)、以時間分辨的熒光模式對各板進行讀數。
如下計算化合物的活性從所有其他各孔的熒光值中減去平板試驗第12排陰性對照的熒光平均值。然后將所得每孔的熒光值除以第11排陽性對照的熒光平均值(其代表最大信號值100％)并表示為百分數值。抑制值表示為相對于所計算每孔的100信號百分值的差異。
利用化合物于每排中以90μM至0.178μM之間的10種不同濃度存在的子板可計算劑量-響應曲線，從中獲得IC50值(抑制信號50％所必須的化合物濃度)。僅含有載體的第11和12排是對照。
表1中報告了本發明某些化合物所獲得的IC50值。數據為兩次獨立試驗的平均值。
表1
對VEGF生成的抑制作用利用細胞試驗評價了在上述Hif-1α/p300試驗中具有抑制活性的化合物，所述細胞試驗使用基因修飾的人肝癌Hep3B細胞(Hep3B-VEGF熒光素酶)，以穩定表達其中螢火蟲熒光素酶的可讀框處于大鼠VEGF基因啟動子控制下的載體。
Hif-1經去鐵胺(導致低氧)誘導，通過活化VEGF啟動子而誘導熒光素酶轉錄，繼而增加熒光素酶活性，這可用市售可得的試劑盒測定。干擾Hif-1α/p300復合體的化合物可抑制Hif-依賴型熒光素酶活化，導致熒光素酶活性降低。因此，該試驗可以評價化合物對VEGF啟動子的活性，后者對于VEGF生成和隨后的腫瘤血管生成均是必不可少的。
Hep-3B-VEGF熒光素酶細胞系按照以下方法獲得。
將人肝癌細胞Hep-3B(ATCC參考號HB-8064)以2.5×105細胞/孔的濃度接種于6-孔板中的2ml DMEM/10％FCS中，次日用Fugene 6(RocheBiochemicals)轉染。在每孔中，轉染混合物含有6μl轉染試劑Fugene 6、1μg pxp2-VEGF-熒光素酶報道基因質粒(VEGF大鼠啟動子，NCBIGenBank編號U22373，Levy等人，J.Biol.Chem.270(22)，13333-13340，1995)和使細胞耐受新霉素的10ng pcDNA3.1(+)質粒(INVITROGEN)。按照制造商的說明進行轉染。
借助基于“稀釋限”方法的克隆法(Sambrook J.、Fritsch E.F.和Maniatis T.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratories)選擇適合的細胞群(表型耐新霉素)。用穩定轉染的所選細胞進行隨后的熒光素酶表達/活性試驗(熒光素酶試驗)和上清液中所分泌的VEGF的定量試驗(ELISA VEGF分泌試驗)。
使用以下試驗方案第1天將Hep-3B-VEGF熒光素酶細胞以1×104細胞/孔/125μl培養基的密度接種于“空白”96-孔板(Greiner)中，然后放置于恒溫器(37℃/5％CO2)中粘附過夜。
第2天將75μl化合物的“3.2x工作溶液”(預先用培養基制備，使DMSO濃度為1.6％v/v)加至各孔(部分體積/孔＝200μl，化合物部分濃度＝1.2x，DMSO部分濃度＝0.6％)。在恒溫器中孵育1小時后，通過添加40μl/孔的6x(600μM)去鐵胺儲備溶液(終體積/孔＝240μl，化合物終濃度＝1x，DMSO終濃度＝0.5％，去鐵胺終濃度＝1x≈100μM)化學誘導低氧。然后將各板恒溫另外18-20小時。
第3天如下進行熒光素酶試驗和VEGF分泌的ELISA試驗。
VEGF分泌的ELISA試驗使用“DuoSet Elisa Development System人VEGF”試劑盒(R&DSystems)定量所分泌的VEGF。將來自含有Hep3B/VEGF熒光素酶克隆細胞的“空白”96-孔板的100μl/孔上清液轉移至透明的96-孔板(Maxisorp)中并按照試劑盒制造商的指示進行試驗。
熒光素酶試驗借助Bright Glo試劑(Promega)對熒光素酶報道基因的表達進行定量。除去上清液并用PBS洗滌一次后，將40μl/孔Bright Glo試劑加至含有Hep3B/VEGF-熒光素酶細胞的空白96-孔板。用發光計閱讀各板，測定報道基因的表達水平。
一些本發明化合物的IC50值(引起熒光素酶信號抑制50％或VEGF分泌減少50％必需的化合物濃度)報告于表2。
表2
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權利要求
1.通式(I)化合物在制備用于治療其中抑制HIF-1α和p300之間相互作用是有益的病變的藥物組合物中的用途， 其中R1是芳基或雜芳基；R2是烷基、鏈烯基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基；X是氧或硫，且其中“烷基”是含有1至10個碳原子、優選1至8個碳原子的直鏈或支鏈烴，任選被一個或多個獨立地選自以下的基團取代環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基和取代的氨基；“芳基”是6至14個碳原子的不飽和環狀芳族烴，任選被一個或多個獨立地選自以下的取代基取代烷基、芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“雜芳基”是含有一個或多個優選選自氮、氧和硫的原子的單環或稠合5-至10-元芳族環，任選被一個或多個獨立地選自以下的基團取代烷基、芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“環烷基”表示含有3至8個碳原子的環狀烷基，任選被一個或多個選自以下的取代基取代烷基、芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“雜環烷基”是飽和或部分不飽和的單環或稠合環，含有一個或多個優選選自氮、氧和硫的原子，且任選被一個或多個獨立地選自以下的基團取代烷基、芳基、鹵代烷基、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“鏈烯基”是直鏈、環狀或支鏈的單價烴基，包含至少一個碳碳雙鍵，任選被一個或多個獨立地選自以下的基團取代烷基、酰基、環烷基、雜環烷基、芳基、鹵代烷基、烷氧基和取代的氨基；“烷氧基”是直鏈或支鏈C1-C4烷氧基；“取代的氨基”是-NRR基團，其中每個R基團獨立地選自氫、酰基、烷基、環烷基、芳基，或R基團可與氮原子一起形成5-或6-元雜環；“鹵素”或“鹵代”前綴表示氟、氯、溴和碘；“酰基”是-C(O)-R”基團，其中R”優選選自氫、羥基、烷基、鹵代烷基、環烷基；芳基，任選被一個或多個烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵素和取代的氨基取代；雜芳基，任選被一個或多個烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代和取代的氨基取代；以及任選被一個或多個烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代和取代的氨基取代的環。
2.權利要求1所述的用途，其中在式(I)化合物中，R1是呋喃，任選被苯基或取代的苯基取代，所述苯基取代基是一個或多個選自羧基、甲氧基羰基、氰基、磺酰氨基和羥基乙氧基的基團；R2是苯基或芐基，任選被一個或多個選自以下的基團取代甲基、三氟甲基、甲氧基、亞甲二氧基，或為(2-噻吩基)-甲基、嗎啉基-丙基、苯基乙基和(3，4-二甲氧基苯基)乙基，且X是硫。
3.權利要求2所述的用途，其中式(I)化合物選自2-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸甲基酯(1)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(2)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(3)；4-{5-[3-(2-三氟甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(4)；4-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)呋喃-2-基-]芐腈(5)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]呋喃-2-基-}芐腈(6)；4-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]苯磺酰胺(7)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(8)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(9)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(10)；4-{5-[3-(3，4-亞甲二氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(11)；4-{5-[3-(3，4-亞甲二氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(12)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(13)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(14)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(15)；4-{5-[3-(嗎啉-4-基-丙基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(16)；4-{5-[3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(17)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(18)；4-{5-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(19)；4-{5-[3-[2-(苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(20)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(21)；2-{5-[4-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞-基甲基]-呋喃-2-基]苯氧基}乙醇(22)；3-芐基-5-[[5-(2-甲氧基苯基)呋喃-2-亞基甲基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷(23)；2-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸(24)。
4.根據權利要求1至3任一項的用途，用于制備抗血管生成藥物。
5.根據權利要求1至4任一項的用途，用于制備用于治療實體腫瘤的藥物。
6.權利要求5所述的用途，其中所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、神經母細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤、黑素瘤、中樞神經系統癌癥、鱗狀細胞口咽癌、宮頸癌、卵巢、食道、腎、結腸、頭頸癌癥和少突神經膠質細胞瘤。
7.抑制細胞中VEGF生成的方法，包括使所述細胞與有效量的式(I)化合物接觸。
8.化合物，選自4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(2)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(3)；4-{5-[3-(2-三氟甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(4)；4-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)呋喃-2-基]芐腈(5)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]呋喃-2-基}芐腈(6)；4-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]苯磺酰胺(7)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(8)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(9)；4-{5-[3-(4-甲基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(10)；4-{5-[3-(3，4-亞甲二氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(11)；4-{5-[3-(3，4-亞甲二氧基芐基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(12)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(13)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(14)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(15)；4-{5-[3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(17)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(18)；4-{5-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}芐腈(19)；4-{5-[3-[2-(苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(20)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(21)；2-{5-[4-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基]-呋喃-2-基]苯氧基}乙醇(22)；3-芐基-5-[[5-(2-甲氧基苯基)呋喃-2-亞基甲基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷(23)；2-[5-(3-芐基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亞基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸(24)。
全文摘要
本發明涉及通式(I)化合物在制備用于治療其中抑制HIF－1α和p300之間相互作用是有益的病變的藥物組合物中的用途，所述藥物組合物尤其是作為抗血管生成藥物用于治療實體腫瘤，其中R
文檔編號A61P17/06GK101083989SQ200580044005
公開日2007年12月5日 申請日期2005年12月19日 優先權日2004年12月23日
發明者M·卡辛, G·科萊拉, S·德穆納里, M·格魯尼 申請人:歐洲細胞治療責任有限公司