專利名稱：利用臍帶血衍生的干細胞治療禿發癥的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用臍帶血衍生的干細胞治療禿發癥的技術。
背景技術：
禿發癥是一種以因毛發脫落造成的頭皮上的毛發部分或完全的缺失或變薄為特征的常見病變。目前仍然還沒有已知能夠完全逆轉并基本上治愈此病的方法。毛發生長性病變造成的毛發缺失在科學上被稱作禿發。禿發指的是其中所有的或幾乎所有的毛發都完全或部分的缺失的臨床病變。毛發生長性病變的確切機理仍然還不是非常清楚，但是推測禿發的發生是因為毛囊發育和毛發周期之間的關系或相互作用的功能不全或病變。
毛發周期被分成如下的三個階段生長期(毛發生長初期)、過渡期(毛發生長中期)和靜息期(毛發生長終期)。首先，新毛發的毛發生長初期開始于毛發開始活躍生長的時刻。此時，生長初期毛囊內的毛發基質細胞有著非常活躍的分化。其次，毛發生長中期是毛發生長周期的中間階段。在毛發生長中期期間，毛發間質細胞停止了毛發生成，毛發變成了特殊形狀，稱作類似棒杵的杵狀毛。最后一期即終期是靜息期，其中毛囊完全終止了其活性并出現萎縮。圖1是顯示毛發生長周期的示意圖。
如果在如圖1所示的毛發生長周期中出現或引入了異常狀態，那么禿發后將不能再生出新的毛發，因此這意味著參與毛發生長和生成的毛發干細胞不再能發揮功能。毛發干細胞在毛發生長過程中的無功能性將造成毛囊下毛乳頭的無功能性，因此毛發脫落的情況將進行性惡化，使得從此開始就難以實現新毛發的生長。
至今為止，大量的興趣都集中于與毛發相關的干細胞，對動物模型已經作了相當多的研究。可以引用大量已發表的科學文章和雜志。例如，最近報道了黑色素細胞干細胞的維持不完善可觸發毛發變灰(Sciencexpress，2004年12月23日)。另外，另一篇文章已經報道成體小鼠具有多能干細胞，其與參與多個毛囊形成的形態發生信號有關(Cell，Vol.104，233-245，Jan 26，2001)。圖2是顯示多能干細胞命運的示意圖。
其他文章也報道了在毛囊干細胞中存在有囊泡上皮干細胞，這些上皮干細胞的功能是調控毛發周期(JID Symposium Proceedings 828-38，2003)。另外，報道了上皮和間充質之間的相互關系是毛囊形成的關鍵因素。此外，某文章已經報道了關于通過在裸鼠中表達與真皮乳頭相關的特殊基因是否能觸發毛發生長的試驗(Proc.Natl，Acad.Sci.USA 96.1999)。圖3是一系列顯示在裸鼠中表達真皮乳頭相關的特殊基因的作用的照片。a表達特殊基因后4周。b沒有表達特殊基因時。c表達特殊基因后4個月。同時，圖4的照片顯示了表達與毛囊生長相關基因(Hox基因)的結果。左側正常小鼠。右側其中過度表達Hox基因的轉化小鼠(Naturwissenschaften 90193-211，2003)。
不過，還沒有能夠根本地預防或治療禿發的有效治療方法，現代醫學技術目前可以實現的可選擇的方法包括外科手術例如毛發移植和頭皮整形手術、以及藥物治療。毛發移植是解決禿發癥的永久方法之一，其中從沿著頭部的后部和側面的仍具有正常功能的供體區中取出發根，然后將其移植到發根已死亡的禿發區。外科手術例如頭皮整形手術包括例如頭皮縮減術(scalp reduction surgery)、頭皮皮瓣手術和組織延伸(tissue extension)或組織擴張(tissue expansion)。藥物治療的實例包括應用米諾地爾(降壓藥)和保法止(前列腺收縮藥)。保法止和米諾地爾是僅有的兩種經FDA批準用于毛發再生的藥物。但是，中斷施用藥物后對脫發基本上沒有治療作用。因此，上面所提及的治療僅僅是臨時的方法，而不是永久的方法。
也就是說，與正常毛發生長不同的是，禿發是一種其中喪失了再生和生成新毛發的能力的病變，因此再生毛囊的真皮乳頭似乎是不可能的。但是，考慮如果將臍帶血衍生的干細胞(其中遺傳合成及其相關表征的知識先前是已知的)用于治療禿發，將可能解決與免疫排斥相關的問題，并提供比應用患者自身的已經具有遺傳缺陷的細胞更好的治療療效和結果。
干細胞一般是指具有自我更新能力和分化能力的原始細胞通過自我更新能力，它們能進行不成熟的和未分化狀態下的連續增殖；通過分化能力，它們能分化成其他的特化細胞和組織。盡管容易從骨髓中分離并培養干細胞，但是獲取骨髓仍是困難的，另外現在已知仍難以解決將所由此得到的干細胞移植給另一個人時發生的與免疫排斥相關的問題。同時，與骨髓相比較，獲得臍帶(新生兒)血液是相對容易的，而且大量的臍帶血單位也是有保證的，因此能夠采用具有與患者的組織相容性基因相同的或最為相似的組織相容性基因的臍帶血干細胞，并由此能夠解決與免疫排斥相關的問題。
如上所討論的，迄今為止，全世界都還沒有利用干細胞治療禿發癥的嘗試，除了一些利用小鼠等的動物試驗外。具體地，就我們所知還沒有利用臍帶血衍生的干細胞治療禿發癥患者的病例。
發明內容
技術問題因此，本發明是針對于上述問題而作出的，本發明的一個目的是提供用于治療禿發癥的細胞培養和細胞移植的基礎，具體地提供了利用臍帶血衍生的干細胞治療禿發癥的治療性技術。
技術方案根據本發明的一個方面，通過提供用于治療禿發癥的組合物可以實現上面的和其他的目的，所述組合物包含從臍帶血中分離并培養到的干細胞，所述臍帶血中的6個HLA(人白細胞抗原)與患者的HLA相同，或者1個或2個HLA與患者的HLA不同。
具體地，用于治療禿發癥的組合物優選地是用于移植到患者的禿發區域內以治療禿發癥的組合物，其包含通過下面步驟獲得的臍帶血衍生的干細胞用α極限必需培養基(αMEM)稀釋臍帶血，隨后離心收集單核細胞；從單核細胞中分離出CD133陽性細胞；和將所分離到的CD133陽性細胞在含有抗生素、抗真菌劑、胎牛血清和谷氨酰胺的αMEM中進行懸浮培養。
根據本發明的另一個方面，提供了一種用于治療禿發癥的方法，包括選出其中6個HLA(人白細胞抗原)與患者的HLA相同的臍帶血或者1個或2個HLA與患者的HLA不同的臍帶血；從所選的臍帶血中分離并培養干細胞；和將所培養的干細胞移植到患者的禿發區域。
在本發明中，從按移植干細胞后在供體干細胞和所治療的患者之間不會發生免疫排斥的方式選出的臍帶血中分離并培養干細胞，將由此所獲得的干細胞移植到禿發區域，據此治療禿發癥患者。
為了實現這個目的，本發明的發明人已經開發出了患者特異的、免疫匹配的臍帶血衍生的細胞療法，其通過給因為遺傳缺陷而不能生成正常毛發的患禿發的患者移植臍帶血衍生的干細胞，造成已經喪失其正常功能的毛發干細胞的活化狀態，使得能夠生成正常的毛發。因此，向禿發區域內移植這些臍帶血衍生的干細胞造成毛發生成，這反過來在毛發維護和毛發顏色方面都起到了關鍵作用，其通過自我復制和增殖，使得毛發能始終保持其自身的功能。此外，當向頭皮移植臍帶血衍生的干細胞時，干細胞被植入到不同的皮膚附件以及毛囊的毛發膨出部，進行自我復制，然后經血管擴散到鄰近的毛囊，因此影響了整個頭皮的毛發。另外，與胎兒時期相似，臍帶血衍生的干細胞分化成了毛囊下的毛發基質細胞和黑色素細胞，因此造成了毛發的活躍生成。此外，因為延長了毛發的生長期，因此稀疏的毫毛變成了厚而長的終毛。
利用臍帶血衍生的干細胞可以實現用于治愈禿發的細胞療法的原因是因為毛發膨出部是健康的以及其功能方面是完整的，甚至在男性型禿發癥中由于雄激素作用已經造成毛囊下部萎縮時也是如此，因此，臍帶血衍生的干細胞可與之粘附并實現其功能。在應用臍帶血衍生的干細胞時，首先要考慮到的關鍵因素是干細胞的HLA與所治療的患者的HLA相同。也就是說，只有在應用具有與患者的HLA相同的HLA的臍帶血衍生的干細胞的情況下，才能解決免疫排斥。另外，臍帶血衍生的干細胞的應用使得能夠分泌毛發生長所必需的生長因子和細胞因子，因此造成了已有毛發生長期的激活，使得脫發速度降至最低，或者分化成毛發干細胞，這有助于形成毛囊，反過來也容許毛發生長。
在現有技術中，還沒有利用臍帶血衍生的干細胞治療禿發癥的方法。此外，盡管理論上討論了利用患者自身的骨髓治療禿發癥的方法，但是實際上獲得骨髓并不容易。因此，可以說應用新生兒臍帶血中所含的干細胞將提供比應用患者自身的可能已經具有遺傳缺陷的干細胞更為可靠的治療禿發癥的方法。
通過下面的結合附圖的詳細說明可以更清楚地了解本發明的上面的和其他的目的、特點和其他優點，其中圖1是顯示毛發生長周期的示意圖；圖2是顯示多能干細胞命運的示意圖；圖3是一組顯示在裸鼠中表達真皮乳頭相關的特殊基因的結果的照片。a表達特殊基因后4周。b當沒有表達特殊基因時。c表達特殊基因后4個月。
圖4是顯示表達與毛囊生長相關的基因(Hox基因)的結果的照片。左側正常結果。右側其中過表達Hox基因的轉化小鼠。
圖5是一系列在用本發明的臍帶血衍生的干細胞治療后拍攝的顯示頭部的前額發線的鏡下照片(scope photograph)。a正常成人的毛發。b治療后頭部的前額發線。
圖6是一系列分別在移植本發明獲得的臍帶血衍生的干細胞前、移植后17周和25周時拍攝的顯示頭皮的禿發區域狀態的照片。a移植前。b移植后17周。c移植后25周。
圖7是一系列分別在移植本發明獲得的臍帶血衍生的干細胞前和移植后17周時拍攝的顯示頭皮的禿發區域狀態的照片。a移植前。b移植后17周；和圖8是一系列分別在移植本發明獲得的臍帶血衍生的干細胞前和移植后3周時拍攝的顯示頭皮的禿發區域狀態的照片。a移植前。b移植后3周。
具體實施例方式
下文，參照下面的實施例將更為詳細地描述利用本發明的臍帶血衍生的干細胞治療禿發癥的技術。這些實施例僅僅用于舉例說明本發明，并不應當視為限制本發明的范圍和精神。
實施例實施例1臍帶血的選擇在確定出6個人白細胞抗原(HLA)是否與禿發癥患者的HLA相同之后，選出其中6個HLA都與患者的HLA相同的或者其中1個或兩個HLA與患者的HLA不同的冷凍臍帶血。
當非自體(自身)細胞的外來(非自身的)細胞被注射到肌體內時，人白細胞抗原(HLA)是決定接受或排斥被注射細胞的植入的重要因素。為了確定出供體和受體之間的組織相容性，對HLA進行了共6個抗原的檢查，每個檢查都完全依據于DNA分析。這種對6個抗原的DNA分析可以確定出I型(HLA-A、HLA-B)和II型(HLA-DR)HLA基因座是否與待移植的患者的基因座相同。
實施例2從臍帶血中分離并培養干細胞將冷凍于-196℃的臍帶血單位放置于37℃的水浴中，并立即解凍。為了從臍帶血中分離出單核細胞，用兩倍體積的αMEM(α-極限必需培養基，Jeil Biotech Services，韓國)稀釋臍帶血，并在室溫下300xg離心10分鐘。收集所分離到的棕黃層，再次用兩倍體積的αMEM稀釋，重疊于Ficoll-Hypaque上，并在室溫下300xg離心30分鐘。
對于血液單核細胞的分離，廣泛地使用Ficoll-Hypaque，這是一種Ficoll(蔗糖聚合物)和Hypaque(泛影酸鈉(sodium ditrizoate))的聚合物。Ficoll-Hypaque的比重為1.077g/ml，它比單核細胞的比重更重，但是比紅細胞的比重輕，這使得通過彼此之間的比重差異可以將細胞彼此分離開。也就是說，當血液被放置于Ficoll-Hypaque上并離心時，單核細胞聚集于Ficoll-Hypaque上。
用其中不包含添加劑的洗滌αMEM另外洗滌經密度梯度離心方法得到的單核細胞兩次。
利用分離試劑盒(Miltenyi Bioteck，德國)如下從所獲得的單核細胞中選擇性地分離出CD133陽性細胞向單核細胞中加入100μl封閉劑以便消除非特異性結合，然后與100μl CD133/微珠均勻混合，使得總體積為500μl。然后在4℃下培養所形成的混合物30分鐘。向培養物中加入10倍體積的PBS(D-磷酸緩沖鹽，Jeil Biotech Services，韓國)，300xg離心10分鐘，然后倒掉PBS，據此得到了粘附于試管的細胞。將所得到的細胞重懸于500μl PBS中。在用3ml PBS緩沖液預先洗滌分離試劑盒的柱之后，向柱中裝入重懸細胞并維持15分鐘以上。在用PBS洗脫柱4次之后，從試劑盒中取出柱，并與合適量的PBS一起加入到試管中，隨后用注射器沖洗柱，據此選擇出陽性細胞。
之后，將所選出的細胞在含有20％胎牛血清(FBS，Jeil BiotechServices，韓國)和抗真菌劑(0.25μg/ml兩性霉素B)和2mM谷胺酰胺(Sigma)的αMEM(1000U/ml青霉素G、1000μg/ml硫酸鏈霉素，Gibco-BRL)中培養5天。在培養5天之后，去除培養的細胞群中的懸浮細胞。當得到粘附細胞時，將它們培養于具有與培養基相同組成的αMEM中，每2天完全更換培養基一次。
實施例3臍帶血衍生的干細胞的移植將在實施例2中培養2周的干細胞(5×107細胞)放置于2mL 0.05％胰蛋白酶-EDTA中，并在室溫下反應5分鐘。然后，向其中加入3mLαMEM，將所形成的混合物轉移到15mL試管內，并在300xg離心10分鐘。在離心之后，倒掉上清液，并向試管的剩余物中加入15mL生理鹽水(Choong-Wae Pharmaceutical Corporation，首爾，韓國)，300xg離心10分鐘，倒掉上清液。重復該步驟3次。將所得到的細胞重懸于6mL生理鹽水中，用26G注射針頭沿著無毛發線分別將2mL懸浮細胞皮下移植到麻醉過的禿發區域的右/左側和后面。
這種臍帶血衍生的干細胞移植方法使得患者能在完成細胞移植之后馬上從醫院出院。可以確認能在移植后2周長出頭發，取決于禿發癥的程度和嚴重度。
實施例4給患者移植臍帶血衍生的干細胞及其結果18例禿發癥患者(16例男性和2例女性)參加了利用本發明的臍帶血衍生的干細胞治療禿發的治療方案。
(1)男性患者，51歲(2003年7月實施手術)在治療禿發癥之前，毛發僅僅殘留于頭部的側面和后面。在進行臍帶血衍生的干細胞移植手術之后，稀疏的頭發從2周時間點開始生長，6個月之后能夠梳理頭發。在整個頭皮毛發中都觀察到了所移植的干細胞的治療效應，包括開始出現前額發線的形成以及鄰近白發變成了黑發。在用數字放大鏡觀察之后，甚至在肉眼沒有明顯看到毛發的區域也確認出現了稀疏毛發的生長。圖5是一系列在用本發明的臍帶血衍生的干細胞治療之后拍攝的頭部前額發線的鏡下照片，其中a顯示了正常成人的毛發以及b顯示了治療后的前額發線。
(2)男性患者，48歲(在2003年10月底實施手術)在接受禿發癥的治療之前，患者患有頭部前額區域約5cm直徑的禿發。在用臍帶血衍生的干細胞治療之后，發現毛發狀態恢復到了接近于正常水平。
(3)男性患者，55歲(在2003年9月實施手術)在實施臍帶血衍生的干細胞的移植手術之前，患者患有頭頂約15cm直徑的禿發。在用干細胞治療之后，毛發從4周時間點開始生長，到了12月，發線向上移動了超過了約4cm。隨后，毛發密度變得更高，新的毛發活躍地生成并生長。
(4)男性患者，51歲(在2003年9月實施手術)
在接受禿發癥的治療之前，患者患有頭冠部的嚴重禿發。在用干細胞治療之后，毛發從3周時間點開始生長并增殖，最后已經達到了接近正常人的毛發狀態。
(5)男性患者，51歲(在2003年9月實施手術)在實施治療禿發癥的干細胞移植手術之前，患者患有頭頂部的部分禿發以及典型的“M”狀模式的前額毛發脫落的進展。在用干細胞治療之后，觀察到禿發區域恢復到了正常毛發狀態。
圖6是一系列分別在移植本發明獲得的臍帶血衍生的干細胞前、移植后17周和25周時拍攝的顯示頭皮的禿發區域狀態的照片，其中，a為移植前拍攝的照片，b為移植后17周拍攝的照片，c為移植后25周拍攝的照片。
圖7是一系列分別在移植本發明獲得的臍帶血衍生的干細胞前和移植后17周時拍攝的顯示頭皮的禿發區域狀態的照片，其中，a為移植前拍攝的照片，b為移植后17周拍攝的照片。
圖8是一系列分別在移植本發明獲得的臍帶血衍生的干細胞前和移植后3周時拍攝的顯示頭皮的禿發區域狀態的照片，其中，a為移植前拍攝的照片，b為移植后3周拍攝的照片。
如圖6到圖8所示，可以看到從移植臍帶血衍生的干細胞3周之后開始顯示出對禿發癥的顯著的治療作用。
產業實用性如上面所描述和證實的那樣，考慮到目前還沒有治愈禿發癥的其他可選擇的方法，根據本發明的方法，預計向禿發區域移植臍帶血衍生的干細胞將非常有助于治療禿發癥。
盡管為了舉例說明的目的已經闡述了本發明的優選實施方式，但本領域技術人員知道，在不脫離在所附權利要求書中所闡述的本發明的范圍和精神的情況下對本發明作出各種修飾、添加和取代都是有可能的。
權利要求
1.治療禿發癥的組合物，包含從臍帶血中分離并培養的干細胞，所述臍帶血中的6個HLA(人白細胞抗原)與患者的HLA相同，或者其中1個或2個HLA與患者的HLA不同。
2.用于移植到患者的禿發區域以治療禿發癥的組合物，包含經下面步驟獲得的臍帶血衍生的干細胞用α-極限必需培養基(αMEM)稀釋臍帶血，隨后離心收集單核細胞；從單核細胞中分離出CD133陽性細胞；和將所分離到的CD133陽性細胞在含有抗生素、抗真菌劑、胎牛血清和谷胺酰胺的αMEM中進行懸浮培養。
3.治療禿發癥的方法，包括選出其中6個HLA(人白細胞抗原)與患者的HLA相同的或者1個或2個HLA與患者的HLA不同的臍帶血；從所選的臍帶血中分離并培養干細胞；和將所培養的干細胞移植到患者的禿發區域。
全文摘要
本發明提供了一種利用臍帶血衍生的干細胞治療禿發癥的治療性技術。向患者的禿發區域移植用于治療禿發癥的組合物非常有助于治療禿發癥，其中組合物包含從臍帶血中分離并培養到的干細胞，所述臍帶血中的6個HLA(人白細胞抗原)與患者相同或者1個或2個HLA與患者不同。
文檔編號A61K35/44GK101094914SQ200580045373
公開日2007年12月26日 申請日期2005年12月13日 優先權日2004年12月30日
發明者韓薰 申請人:韓薰