專利名稱：：臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法
技術領域：
：本發明涉及細胞培養擴增的方法，特別涉及臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法。
背景技術：
：造血干細胞的移植是血液學領域的重要技術，其己成為治愈某些惡性血液病、實體瘤、遺傳性及免疫性疾病的可靠選擇。人們早就認識到臍血中含有大量的造血干/祖細胞，但是單份臍血所含造血干/祖細胞的數量少,難以滿足成年人及較大體重患者的需要,而且臍血移植后造血細胞恢復時間遲，限制了其在臨床上的應用。為了提高臍血造血細胞在臨床上的利用率，對臍血造血細胞進行體外擴增成為了必然手段之一。目前國內外學者多采用含不同細胞因子組合的培養體系對臍血造血細胞進行體外擴增，但單利用細胞因子對臍血造血細胞進行體外擴增，在獲得大量造血早期細胞的同時，不可避免地造成造血干細胞的過度分化，使具歸巢和長期植入能力的干細胞數目減少。另有一些研究表明，造血細胞的生長發育離不開造血微環境的作用,其中骨髓基質細胞是造血微環境的重要組成部分。基質系統的存在可以改善擴增的效果，單用骨髓基質細胞支持能較好地維持造血干/祖細胞數目，但不能使造血細胞數量得到顯著性擴增，難以滿足動物實驗及臨床需要。
發明內容本發明的目的是提供一種臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其不僅能使臍血造血細胞數量得到顯著性擴增，而且可以避免在擴增過程中造血干細胞的過度分化，在大量擴增臍血造血早期細胞的同時維持一定量具長期植入能力的造血干細胞。為了實現上述目的，本發明提供一種臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其包括以下步驟(1)取骨髓液，分離出單個核細胞，用培養液培養出骨髓基質細胞；(2)步驟(1)培養的基質細胞層融合后，經15Gy60Co照射，洗滌；(3)將經步驟(2)后基質細胞加入無血清培養液中；(4)往上步驟后的培養體系中加入外源性細胞因子，建立造血細胞培養體系；(5)從臍血中分離出單個核細胞，種植到步驟(4)建立的造血細胞培養體系中進行培養擴增。本發明提供的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其結合了基質細胞及細胞因子，運用上述科學的方法及合理的步驟將兩者聯合到臍血單個核細胞的擴增中來，充分利用基質系統和細胞因子的優點。該方法不僅能使臍血造血細胞數量得到顯著性擴增，而且可以避免在擴增過程中造血干細胞的過度分化，在大量擴增臍血造血早期細胞的同時維持一定量具長期植入能力的造血干細胞。具體實施例方式本發明提供的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其包括以下步驟(1)取骨髓液，分離出單個核細胞，用培養液培養出骨髓基質細胞；(2)步驟(1)培養的基質細胞層融合后，經15Gy60Co照射，洗滌；(3)將經步驟(2)后基質細胞加入無血清培養液中；(4)往上步驟后的培養體系中加入外源性細胞因子，建立造血細胞培養體系；(5)從臍血中分離出單個核細胞，種植到步驟(4)建立的造血細胞培養體系中進行培養擴增。本發明的具體步驟為用IMDM培養液(培養體系含15%FBS)培養人骨髓基質細胞，培養7-14天基質細胞層融合(約80%)后，經15Gy"'Co照射后，洗滌3次后加入StemspanTm無血清培養液(Stemcell公司產品)，然后往培養體系中加入細胞因子SCF、FL及TP0(細胞因子濃度均為40ng/ml)，建立新的造血細胞培養體系備用。從臍血中分離出單個核細胞，種植到上述含人骨髓基質細胞支持的6ml無血清培養體系中，種入25cm2培養瓶，置37"C，體積分數為5%的0)2全濕培養箱中培養。本發明提供的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其結合了基質細胞及細胞因子，運用上述科學的方法及合理的步驟將兩者聯合到臍血單個核細胞的擴增中來，充分利用基質系統和細胞因子的優點。該方法不僅能使臍血造血細胞數量得到顯著性擴增，而且可以避免在擴增過程中造血干細胞的過度分化，在大量擴增臍血造血早期細胞的同時維持一定量具長期植入能力的造血干細胞。本發明方法的效果，可以通過以下三種測試和驗證手段進一步說明-1、臍血單個核細胞的體外擴增效果從臍血分離出MNC，然后按本擴增體系進行擴增，在第6天進行取樣，并進行細胞計數，用流式細胞儀對細胞表面CD34+，CD34+CD49d+，CD34+CXCR4+標志進行檢測，用PBS洗滌細胞2次后配成2X107ml濃度，以100ul細胞懸液20ul單克隆抗體的比例充分混勻后置于4"C避光孵育30分鐘，再用PBS洗滌3次后用流式細胞儀分別檢測CD34+細胞數，同時檢測CD34+細胞上VLA-4及CXCR4的表達情況。CD34+細胞、CD34+CD49d+細胞及CD34+CXCR4+細胞的擴增結果分別參見表1、表2和表3(A組為單用人骨髓基質細胞支持進行擴增組；B組為單用細胞因子支持擴增組；C組為本發明的人骨髓基質細胞聯合細胞因子支持擴增組)表l三種不同培養體系作用下臍血CD34+細胞的擴增情況(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2三種不同培養體系作用下臍血0034+CXCR4+細胞的擴增情況(X土s)組別起始CD34+CXCR4+細胞數(X擴增后細胞數(X擴增倍數107ml)107ml)A0.83±0.242.63±1.043.29±1.08B0.83±0.240.96±0.281.17±0.11C0.83±0.244.41±1.085.56±1.14表3三種不同培養體系作用下臍血0034+VLA-4+細胞的擴增情況(X土s)組別起始CD34+VLA-4+細胞數(X擴增后細胞數(X擴增倍數107ml)107ml)A0.97±0.523.13±1.873.20±0.82B0.97±0.522.42±1.182.62±0.38C0.97±0.526.02±1.786.36±0.942、造血干/祖細胞總集落擴增分析在第6天進行造血細胞集落培養，半固體培養基為MethoCUltTMGF(H4434)(Stemcell公司)，取出各組細胞用PBS洗滌2次后配成5X107ml的濃度備用。將0.9ml培養基小心加到35mm的培養板，再加入0.lml的上述細胞懸液，即配成5X107ml的濃度，充分振蕩，使細胞和培養基混勻，于上述培養條件中培養,第14天倒置顯微鏡下計數集落形成單位數(CFU)，顯微鏡下以含50個細胞以上的細胞團為一個集落。于第14天倒置顯微鏡下計數CFU。用人骨髓基質細胞聯合細胞因子的無血清共培養體系中，臍血單個核細胞集落形成單位數較單用細胞因子或人骨髓基質細胞組要多(P<0.05)(見表4)。表表4三種不同培養體系作用下臍血集落形成單位的擴增情況(X土s)組別起始CFU數(/1()5個麗C)擴增后CFU(/105個擴增倍數MNC)A196.20±79.741757.80±823.049.00±1.54B196.20±79.74830.10±277.454.64±1.26C196.20±79.742067.60±850.3410.81±1.373、人臍血細胞移植NOD/SCID小鼠體內N0D/SCID小鼠，雌雄不限，6-8周齡，無特定病原體條件下飼養。移植前250cGyX線加速器亞致死量照射(劑量率220cGy/min)，照射后4小時經尾靜脈注射進行移植實驗。實驗分組(1):新鮮臍血移植組(陽性對照組)每只N0D/SCID小鼠經尾靜脈輸注新鮮臍血200ul含MNCs5Xl(f個。(2):擴增臍血移植組(實驗組)每只NOD/SCID小鼠經尾靜脈輸注與新鮮臍血組相同細胞數的經人骨髓基質細胞聯合SCF+FL+TPO三因子組合懸浮培養擴增6天的臍血5X106個，200ul。(3):生理鹽水移植組(陰性對照組)每只NOD/SCID小鼠輸注200ul生理鹽水。每組5只，重復4次。移植后觀察小鼠存活情況，6周后處死存活小鼠，收集骨髓細胞用于人CD34+，CD45+細胞的檢測及抽提基因組DNA檢測人特異的ALU序列和Cart-1基因。PCR法檢測人特異的ALU序列和Cart-1基因以新鮮臍血基因組DNA為陽性對照，正常NOD/SCID小鼠骨髓基因組DNA為陰性對照，e-actin作為內參照.酚/氯仿法抽提移植NOD/SCID小鼠骨骨髓細胞基因組DNAPCR引物由上海博亞生物技術有限公司合成，{3-actin由英俊生物技術有限公司合成，Alu序列引物正義鏈5'-CTGGGCGACAGAACGAGATTCTAT-3'，反義鏈5'-CTCACTACTTGGTGACAGGTTCA-3',擴增片段為224bp，為位于人x染色體重復序列。Cart-1基因引物正義鏈5'-AAGGATACCACAATAAGCTGC-3'，反義鏈5'-GGTTTGTGGAGACTGGCAC-3'，擴增片段為156bp,僅位于Cart-1基因3，-端翻譯序列，二者皆與鼠無同源性。0-actin內參照正義鏈5'-AAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3'，反義鏈5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAG-3'，擴增片段為249bp，擴增Alu，Cart-1和P-actin的反應體系和條件相同。反應體系(25u1):IOX緩沖液2.5pl，TaqDNA聚合酶1.25U，dNTPO.2mol/L，引物各0.25umol/L,DNA3ul,反應參數95"C預變性5min，95。C變性30s，54。C退火45s，72°C延伸45s,循環30次，72"C補齊延伸5min,擴增產物以20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結果。空白對照組小鼠存活率為0，均在1周內死亡，新鮮臍血組20只小鼠中存活7只，存活率35%，擴增組20只小鼠存活IO只，存活率50%，其余均在移植后23周內死亡，擴增組6周存活率較新鮮組小鼠的要好(P<0.05)。NOD/SCID小鼠中人的造血細胞植入證據，在移植后存活6周的NOD/SCID小鼠骨髓細胞中我們檢出人CD45+細胞含量范圍為1.52%—5.2%，說明存活的小鼠均獲得臍血造血細胞的植入。移植后存活6周的小鼠外周血細胞與陽性對照相同，擴增出224bp和156bp的特異性條帶，表明存在人的造血細胞。存活的NOD/SCID小鼠均能檢測到人的Alu基因、Cart-I基因。陰性對照組小鼠未檢測到任何特異性條帶。以上數據表明，采用本發明的方法，可以達到提高臍血造血干/祖細胞體外擴增效率及增強或維持其植入NOD/SCID小鼠能力的目的，證明本采用本發明的方法進行的臍血單個核細胞的體外擴增，能夠大大提高擴增效率，并且使擴增的細胞保持較好造血細胞植入能力。權利要求1、臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取骨髓液，分離出單個核細胞，用培養液培養出骨髓基質細胞；(2)步驟(1)培養的基質細胞層融合后，經15Gy^Co照射，洗滌；(3)將經歩驟(2)后基質細胞加入無血清培養液中；(4)往步驟(3)的培養液中加入外源性細胞因子，建立造血細胞培養體系；(5)從臍血中分離出單個核細胞，種植到步驟(4)建立的造血細胞培養體系中進行培養擴增。2、根據權利要求1所述的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其特征在于，歩驟(3)所述的骨髓基質細胞為人骨髓基質細胞。3、根據權利要求1所述的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其特征在于，步驟(3)所述的無血清培養液為StemspanTm無血清培養液。4、根據權利要求1所述的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其特征在于，步驟(4)所述的外源性細胞因子包含SCF、FL和TPO。5、根據權利要求2所述的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其特征在于，所述的外源性細胞因子SCF、FL和TPO的濃度均為40ng/ml。6、根據權利要求1所述的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其特征在于，步驟(1)中培養人骨髓基質細胞的培養液為IMDM。7、根據權利要求1所述的臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其特征在于，步驟(5)所述的培養擴增的條件為37°C，體積分數為5%的0)2全濕培養箱中培養。全文摘要本發明提供了一種臍血單個核細胞體外擴增并保持造血細胞植入能力的方法，其是從人骨髓中培養出骨髓基質細胞，并作為培養體系中的支持細胞，在結合外源性生長因子的無血清培養體系中體外擴增臍血單個核細胞。采用本發明的方法進行的臍血單個核細胞的體外擴增，能夠大大提高擴增效率，并且能使擴增的細胞保持較好造血細胞植入能力。文檔編號C12N13/00GK101121927SQ20071002907公開日2008年2月13日申請日期2007年7月9日優先權日2007年7月9日發明者逸應,張玉平,彭盤俐,杜慶華,林秀梅,平毛,王彩霞,王漢平,莫文健,力許,許艷麗申請人:廣州市第一人民醫院