用二乙烯基砜交聯透明質酸的方法

專利名稱：：用二乙烯基砜交聯透明質酸的方法
背景技術：
：本發明涉及一種制備用于化妝品、生物醫學和制藥應用的改性透明質酸(HA)、特別是交聯的HA的方法。透明質酸(HA)是屬于非硫酸化糖胺聚糖類別的天然和線性碳水化合物高分子。其由β-1，3-N-乙酰基葡糖胺和β-1，4-葡糖醛酸重復的二糖單元組成，分子量(MW)高達6MDa。HA存在于透明軟骨、滑液關節流體、和皮膚組織(真皮和表皮二者)中。HA可以從天然組織包括脊椎動物的結締組織中、從人臍帶中和從雞冠中提取。但是，目前優選通過微生物方法制備HA，以使傳播傳染物的潛在風險最小化，和增加產品均勻性、質量和可用性(WO03/0175902、Novozymes)。已確認了體內HA的許多功能。其在生物有機體中起到重要的功能，作為用于許多組織如皮膚、腱、肌肉和軟骨的細胞的機械載體。HA參予到關鍵的生物過程中，如組織的潤濕，和潤滑過程。也懷疑其在大量生理機能中起作用，如粘附、成長、細胞運動性、癌癥、血管發生、和創傷愈合。由于HA的獨特物理與生物性能(包括粘彈性、生物相容性、生物降解性)，在化妝品、眼科學、風濕病學、給藥、創傷愈合和組織工程之內的寬范圍現有與發展中的應用中使用了HA。HA在一些這些應用中的用途受限于這樣的事實，HA在室溫、即約20℃下溶于水，其被體內的透明質酸酶快速降解，且其難以加工成生物材料。由此，已提出了HA的交聯，由此改進HA的物理與機械系能和其體內停留時間。US4,582,865(BiomatrixInc.)描述了HA的交聯凝膠的制備，單獨地或者與其它親水性聚合物混合地，使用二乙烯基砜(DVS)作為交聯劑。利用多官能環氧化物制備交聯的HA或其鹽公開于EP0161887B1。用于通過共價鍵交聯HA的其它二-或多-官能試劑包括甲醛(U.S.4,713,448、BiomatrixInc.)，聚氮丙啶(WO03/089476A1、GenzymeCorp.)，L-氨基酸或L-氨基酯(WO2004/067575、BiosphereS.P.A.)。也已報道了碳二亞胺來交聯HA(US5,017,229、GenzymeCorp.；US6,013,679、AnikaResearch，Inc)。US4,957,744中公開了用脂肪醇全部或部分交聯的HA的酯，和這種偏酯與無機或有機堿的鹽。發明概述本發明所要解決的問題是如何制備具有改進的性質的基于透明質酸的水凝膠，如更高的均質性、增強的柔軟性、和/或更容易的可注射性。通過本發明的方法制得的交聯的凝膠，相對于標準DVS交聯的HA-水凝膠，顯示增強的均質性和增強的柔軟性。如實施例中所示，由本發明方法獲得的凝膠也更容易通過注射器注射。由此，一方面，本發明涉及一種制備包含由二乙烯基砜(DVS)交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供透明質酸或其鹽的堿性溶液；(b)將DVS加到步驟(a)的溶液中，由此用DVS交聯透明質酸或其鹽以形成凝膠；(c)用緩沖劑處理步驟(b)的凝膠，其中凝膠溶脹且形成包含由DVS交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠。第二方面，本發明涉及一種包含由二乙烯基砜(DVS)交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠，其均質性足以用穩定注射力以12.5mm/min的速度在55mm的距離之上通過27G1/2針從1mL注射器中注射，該注射力在注射的最初40秒鐘之后、和直到注射器清空，變化不超過約5牛頓(N)，優選地不超過約4N，更優選3N、2N，或者最優選地不超過約1N。第三方面，本發明涉及一種組合物，其包含第二方面中所定義的水凝膠和活性成分，優選地該活性成分是藥理學活性劑。本發明的第四方面涉及藥物組合物，其包含有效量的第二方面中所定義的水凝膠，以及可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。第五方面涉及藥物組合物，其包含有效量的第二方面中所定義的水凝膠作為媒介物(vehicle)，以及藥理學活性劑。第六方面涉及化妝用品(cosmeticarticle)，其包含作為活性成分的有效量的第二方面中所定義的水凝膠，或者第三、第四、或第五方面任一項中所定義的組合物。第七方面，本發明涉及衛生、醫療或外科用品，其包含第二方面中所定義的水凝膠，或者第三、第四、或第五方面任一項中所定義的組合物；優選地該用品為尿布、衛生巾、外科紗布(surgicalsponge)、創傷愈合紗布(woundhealingsponge)、或者繃帶(bandaid)或其它創傷敷料(wounddressingmaterial)中所含的一部分。重要的方面涉及藥物膠囊或微膠囊，其包含第二方面中所定義的水凝膠，或者第三、第四、或第五方面任一項中所定義的組合物。許多方面涉及第二方面中所定義的水凝膠或者第三、第四、或第五方面任一項中所定義的組合物的用途，用于制備治療骨關節炎、癌癥的藥物，制備眼科治療(ophtalmologicaltreatment)用藥物，制備治療創傷的藥物，制備血管發生用藥物，制備治療脫發(hairloss)或禿頂(baldness)的藥物，制備保濕劑或化妝品(cosmetic)，或者用于美容處理(cosmetictreatment)。定義本文中所使用的術語“透明質酸”含義為由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的殘基構成的具有不同分子量的酸性多糖，其天然地存在于細胞表面中，脊椎動物的結締組織的堿性細胞外物質中，關節的滑液中，眼睛的內延髓流體中，人臍帶組織中和雞冠中。術語“透明質酸”實際上經常用于表示全系列的多糖，其具有交替的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的殘基，以及變化的分子量或者甚至其降解部分，且其由此似乎使用復數形式的“透明質酸”更準確。但是，該說明書中仍然使用單數形式；另外，經常使用“HA”代替該集合術語。“透明質酸”在本文中定義為由交替的β-1，4和β-1，3糖苷鍵連接在一起的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重復二糖單元組成的非硫酸化糖胺聚糖。透明質酸也稱為乙酰透明質酸(hyaluronan)、透明質酸鹽、或HA。術語乙酰透明質酸和透明質酸在本文中也可交換地使用。公雞冠是乙酰透明質酸的重要商用原料。微生物是替換的原料。US4,801,539公開了用于制備透明質酸的發酵方法，包括獸瘟鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)的菌株，所報道的產量為約3.6g透明質酸/升。歐洲專利EP0694616公開了利用改進的獸瘟鏈球菌菌株的發酵方法，所報道的產量為約3.5g透明質酸/升。如WO03/054163(Novozymes)中所公開的那樣，其全部內容引入本文，可以在例如格蘭氏陽性(Gram-positive)芽孢桿菌宿主中重組地制得透明質酸或其鹽。已描述了來自眷椎動物、細菌病原體和海藻病毒的乙酰透明質酸合酶(DeAngelis、P.L.、1999、Cell.MoI.LifeSci.56670-682)。WO99/23227公開了似馬鏈球菌中的GroupI透明質酸鹽合酶。WO99/51265和WO00/27437描述了Pasturellamultocida中的GroupII透明質酸合酶。Ferretti等公開了釀膿鏈球菌的透明質酸合酶，其由三種基因hasA、hasB、和hasC組成，其分別編碼透明質酸合酶、UDP葡萄糖脫氫酶、和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，4658-4663，2001)。WO99/51265描述了具有似馬鏈球菌乙酰透明質酸合酶的編碼區域的核酸片段。由于重組的芽孢桿菌屬細胞的乙酰透明質酸直接表達到培養基，可以采用簡單的方法將乙酰透明質酸從培養基中分離出來。首先，將芽孢桿菌屬細胞和細胞碎片從培養基中物理去除。如果需要的話，可以首先將培養基稀釋以降低介質的粘度。用于從培養基中除去細胞的許多方法是本領域技術人員已知的，如離心或微濾。如果需要的話，隨后可以將剩余的上清液過濾，例如通過超濾進行過濾，以將小分子污染物從乙酰透明質酸中濃縮和除去。除去細胞和細胞碎片之后，可以通過已知的機理從介質中進行簡單地沉淀乙酰透明質酸。可以采用鹽、醇、或鹽與醇的組合將乙酰透明質酸從濾液中沉淀。一旦變為沉淀物之后，可以通過物理方法容易地將乙酰透明質酸從溶液中分離。可以采用本領域已知的蒸發技術將乙酰透明質酸干燥或從濾液中濃縮，如凍干法或噴霧干燥法。宿主細胞優選實施方式涉及第一方面的方法，其中重組地制得透明質酸或其鹽，優選地通過格蘭氏陽性細菌或宿主細胞，更優選地通過芽孢桿菌屬的細菌。該宿主細胞可以是適合于透明質酸的重組制備的芽孢桿菌屬細胞。該芽孢桿菌屬宿主細胞可以是野生型的芽孢桿菌屬細胞或其突變體。用于實施本發明的芽孢桿菌屬細胞包括、但并非限定于，Bacillusagaraderhens、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、Bacillusclausii、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)細胞。特別地適合于重組表達的突變枯草芽孢桿菌細胞描述于WO98/22598。非封裝的(non-encapsulating)芽孢桿菌屬細胞特別適用于本發明。優選實施方式中，該芽孢桿菌屬宿主細胞為解淀粉芽孢桿菌、Bacillusclausii、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。更優選的實施方式中，芽孢桿菌屬細胞為解淀粉芽孢桿菌細胞。另一更優選的實施方式中，芽孢桿菌屬細胞為Bacillusclausii細胞。另一更優選的實施方式中，芽孢桿菌屬細胞為遲緩芽孢桿菌細胞。另一更優選的實施方式中，芽孢桿菌屬細胞為地衣芽孢桿菌細胞。另一更優選的實施方式中，芽孢桿菌屬細胞為枯草芽孢桿菌細胞。最優選的實施方式中，芽孢桿菌屬宿主細胞為枯草芽孢桿菌A164Δ5(參見U.S.5,891,701)或枯草芽孢桿菌168Δ4。分子量可以依據改進的咔唑方法(Bitter和Muir，1962，AnalBiochem.4330-334)測量透明質酸的含量。另外，可以采用本領域中的標準方法測量透明質酸的平均分子量，如Ueno等，1988，Chem.Pharm.Bull.36，4971-4975；Wyatt，1993，Anal.Chim.Acta2721-40；和WyattTechnologies，1999，″LightScatteringUniversityDAWNCourseManual″與″DAWNEOSManual″WyattTechnologyCorporation，SantaBarbara，California描述的那些方法。優選實施方式中，本發明的透明質酸或其鹽的分子量為約10,000～約10,000,000Da。更優選的實施方式中，其分子量為約25,000～約5,000,000Da。最優選的實施方式中，透明質酸的分子量為約50,000～約3,000,000Da。優選實施方式中，本發明的透明質酸或其鹽的分子量范圍為300,000～3,000,000，優選地為400,000～2,500,000，更優選地為500,000～2,000,000，且最優選地為600,000～1,800,000。仍另一優選實施方式中，透明質酸或其鹽的低平均分子量(lowaveragemolecularweight)范圍為10,000～800,000Da，優選地為20,000～600,000Da，更優選地為30,000～500,000Da，甚至更優選地為40,000～400,000Da，且最優選地為50,000～300,000Da。鹽和交聯的HA優選的實施方式涉及第一方面的方法，其包括透明質酸的無機鹽，優選透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸銨、透明質酸鈣、透明質酸鎂、透明質酸鋅、或透明質酸鈷。其它成分優選實施方式中，通過本發明方法制得的產品也可以包含其它成分，優選一種或多種活性成分，優選一種或多種藥理學活性的物質，且也優選水溶性賦形劑，如乳糖或非生物學衍生的糖。可以用于本發明的活性成分或藥理學活性的物質的非限定性實例包括維生素，蛋白質和/或肽藥物，如人生長激素、牛生長激素、豬生長激素、促生長激素釋放激素/肽(growthhomronereleasinghormone/peptide)、粒細胞-集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子、巨噬細胞-集落刺激因子、促紅細胞生成素、骨形態發生蛋白、干擾素或其衍生物、胰島素或其衍生物、心房肽激素-III、單克隆抗體、腫瘤壞死因子、巨噬細胞活化因子、白介素、腫瘤退化因子(tumordegeneratingfactor)、胰島素-樣生長因子、表皮生長因子、組織纖溶酶原激活物、因子IIV、因子IIIV、和尿激酶。出于穩定活性成分的目的，可以包括水溶性賦形劑，該賦形劑可以包括蛋白質，例如白蛋白或明膠；氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸及其鹽；碳水化合物如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨糖醇、海藻糖和硫酸軟骨素；無機鹽如磷酸鹽；表面活性劑如TWEEN(ICI)、聚乙二醇，及其混合物。該賦形劑或穩定劑的用量范圍可以為該產品的0.001～99wt％。本發明的幾個方面涉及各種組合物和藥物，其包括，除其它成分之外，有效量的交聯的HA產品，和活性成分，優選地該活性成分為藥理學活性劑；可藥用載體、賦形劑或稀釋劑，優選水溶性賦形劑，且最優選乳糖。本發明的優選實施方式涉及泡騰片(effervescenttablet)中所包含的本發明的產品或組合物，其可以如本領域中所述以其它方式配制。例如，泡騰片可以包括檸檬酸、碳酸氫鈉、和寡糖或其它糖。泡騰片容易儲存，且采用本發明的快速溶解的產品，它們快速溶解且由此提供了口服給藥的理想方式。另外，本發明的方法涉及包含第一方面中所定義的產品或者上述方面和實施方式中定義的組合物的用品，例如化妝用品、衛生用品、醫療或外科用品。最后的方面中，本發明涉及藥物膠囊或微膠囊，其包含第一方面中所定義的產品或者本發明其它方面和實施方式中所定義的組合物。圖1闡述了由透明質酸酶降解獲得的DVS-HA水凝膠的重量損失隨時間的變化。將如實施例2中所述，通過加熱步驟(“加熱的”)制得的DVS-HA水凝膠與未進行熱處理(“未加熱的”)的DVS-HA水凝膠比較。圖2顯示了一組具有不同交聯比例或者程度的DVS交聯的HA水凝膠在磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.0)中溶脹期間的PH值的時間過程，如以下實施例6中詳細地描述。圖3顯示了依據本發明制得的兩種HA水凝膠的彈性模量(G’)，其用圓形標注，和剪切損失(shearloss)或粘性模量(viscousmodulus)(G”)，其用正方形標注，一種采用10∶1的HA/DVS比例和6％HA制備，另一種采用15∶1的HA/DVS比例和6％HA制備，如下實施例7中詳細地描述。HA/DVS10∶1水凝膠的彈性模量(G’圓形)在全部頻率(x-軸)為上面的線(y-軸)，且HA/DVS10∶1水凝膠的剪切損失模量(G”正方形)是下面的線，除了在x-軸的最左手側，其為上面的線。圖4顯示了采用本文實施例2中所述的方法制得的(“新的，加熱的”)DVS交聯的HA水凝膠(HA/DVS10∶1，wt)、和如下面實施例9中所述的那樣依據現有技術(參見US4,582,865，實施例1)不加熱制得的水凝膠的可注射性(syringeability)。y-軸顯示以牛頓為單位的注射力，開始于0.0，增量為2.5，且結束于35.0。圖5顯示了采用本文實施例2中所述的方法制得的(“新的，加熱的”)DVS交聯的HA水凝膠(HA/DVS15∶1，wt)、和如下面實施例9中所述的那樣依據現有技術(參見US4,582,865，實施例1)不加熱制得的水凝膠的可注射性(syringeability)。y-軸顯示以牛頓為單位的注射力，開始于0.0，增量為2.5，且結束于30.0。發明詳述本發明的第一方面涉及一種制備包含由二乙烯基砜(DVS)交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供透明質酸或其鹽的堿性溶液；(b)將DVS加到步驟(a)的溶液中，由此用DVS交聯透明質酸或其鹽以形成凝膠；(c)用緩沖劑處理步驟(b)的凝膠，其中凝膠溶脹且形成包含由DVS交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠。先前已描述了如何在芽孢桿菌屬宿主細胞中重組地制備透明質酸，參見WO2003/054163，NovozymesA/S，其全部引入本文中。由此，在優選的實施方式中，本發明涉及第一方面的方法，其中在芽孢桿菌屬宿主細胞中重組地制備透明質酸或其鹽。有益地出于具體目的，已描述了各種分子量分數的透明質酸。本發明的優選實施方式涉及第一方面的方法，其中該透明質酸或其鹽的平均分子量為100～3,000kDa，優選地為500～2,000kDa，且最優選地為700～1,800kDa。本發明的方法中，透明質酸或其鹽的初始濃度影響獲得的交聯凝膠和溶脹的水凝膠的性質。由此，本發明的優選實施方式涉及第一方面的方法，其中堿性溶液包含濃度為0.1％～40％(w/v)的溶解的透明質酸或其鹽。交聯反應期間的pH值也影響結果，由此在優選實施方式中本發明涉及第一方面的方法，其中該堿性溶液包含濃度為0.001～2.0M的溶解的氫氧化鈉。也值得注意的是，交聯劑的濃度顯著影響獲得的凝膠。由此，本發明的優選實施方式涉及第一方面的方法，其中以HA/DVS(干重)為1∶1～100∶1、優選HA/DVS(干重)為2∶1～50∶1的重量比將DVS加到步驟(a)的溶液中。發明者發現，在將DVS加到HA-溶液期間和/或之后緊接著，初始階段的攪拌是期望的，由此獲得滿意的凝膠化。由此，本發明的優選實施方式涉及第一方面的方法，其中在攪拌下將DVS加到步驟(a)的溶液中，且其中將溶液溫度保持在5℃～50℃、優選15℃～40℃、更優選20℃～30℃；優選地，該攪拌持續1～180分鐘。在第一方面的方法的另一優選實施方式中，將DVS加到步驟(a)的溶液中，而不攪拌。本發明者證實，在將DVS加到溶液中之后加熱步驟是有益的。由此，本發明的優選實施方式涉及第一方面的方法，其中將步驟(b)中溶液溫度加熱到20℃～100℃，優選為25℃～80℃，更優選為30℃～60℃，和最優選為35℃～55℃，且其中將溫度保持在該范圍下至少5分鐘，優選至少10分鐘，20分鐘，30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170，或者最優選地至少180分鐘；優選不攪拌。有利的是在進行交聯反應之后使凝膠在室溫下放置短暫的時間。在第一方面的方法的優選實施方式中，將凝膠保持在0℃～40℃、優選10℃～30℃的溫度范圍下至少5分鐘，優選至少10分鐘、20分鐘、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170，或者最優選地至少180分鐘。預想本領域技術人員眾所周知的多種類型的緩沖劑適用于溶脹和中和本發明的交聯的凝膠。在優選的實施方式中，該緩沖劑包含pH值范圍為2.0～8.0、優選為5.0～7.5的緩沖劑。最佳地，選擇適宜的緩沖劑，其pH值導致溶脹的水凝膠的pH盡可能地接近中性。優選的實施方式中，該緩沖劑包含其pH值使水凝膠的pH值在5.0～7.5之間的緩沖劑。優選地，在第一方面的方法中，該緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑和/或鹽緩沖劑(salinebuffer)。在溶脹步驟中，緩沖劑的體積必須足以容納溶脹的凝膠直到該凝膠完全溶脹。由此，在第一方面的方法的優選實施方式中，步驟(c)中的緩沖劑的體積是步驟(b)的凝膠的體積的至少3倍。在第一方面的方法的優選實施方式中，在20℃～50℃溫度下進行步驟(c)的溶脹至少5分鐘，優選至少10分鐘、20分鐘、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170，或者最優選地至少180分鐘。也優選用pH值為2.0～8.0、優選為5.0～7.5的水，水與磷酸鹽緩沖劑、水與鹽緩沖劑、或水和磷酸鹽緩沖劑與鹽緩沖劑，洗滌步驟(c)中形成的水凝膠至少一次。實施例實施例1-DVS-交聯的HA水凝膠的制備該實施例闡述了采用伴隨有溶脹和pH調節制備DVS-交聯的HA水凝膠。將透明質酸鈉(HA，770kDa，1g)溶解到0.2MNaOH中獲得4％(w/v)的溶液，將其在室溫、即約20℃下攪拌1h。制得三個復制品。隨后以足量將二乙烯基砜(DVS)加到HA溶液中，由此分別使HA/DVS重量比為10∶1、7∶1、和5∶1。將混合物在室溫下攪拌5分鐘并且隨后使其在室溫下靜置1h。隨后將凝膠在160mL磷酸鹽緩沖劑(pH4.5或6.5)中溶脹24h，如表1中所示。表1DVS-HA水凝膠制備的條件在溶脹步驟期間使凝膠的pH穩定。溶脹后，通過過濾除去任何過量的緩沖劑，并且用IKAULTRA-TURRAXT25均化器(IkaLabortechnik，DE)將水凝膠簡單地均化。測量凝膠的體積和pH(參見表2)。表2DVS-HA水凝膠的特征水凝膠的pH范圍為7.1～7.6(表2)，其證實了可以利用溶脹步驟在該方法中調節pH。全部凝膠占據的體積為70mL，其對應于約1.4％(w/v)的HA濃度。它們是透明的、粘性的和均質的。柔軟性隨著交聯度降低而增加(表2)。實施例2-均質DVS-交聯的HA水凝膠的制備該實施例闡述了高均質的DVS-交聯的HA水凝膠的制備。將透明質酸鈉(770kDa，2g)溶解到0.2MNaOH中，在室溫下攪拌約1h，由此獲得8％(w/v)的溶液。隨后加入DVS使HA/DVS重量比為7∶1。在室溫下攪拌5分鐘之后，將一個樣品在50℃下熱處理2h而不攪拌，并隨后使其在室溫下靜置過夜。將獲得的交聯凝膠在37℃下溶脹到200mL磷酸鹽緩沖劑(pH5.5)中42或55h，最后用100mL水洗滌兩次，將其拋棄。測量體積和pH，以及將凝膠從27G*1/2注射針頭中推過必須的壓力(參見表3)。表3DVS-交聯的HA水凝膠的特征相對于未進行熱處理的對照水凝膠(表3)，依據該實施例制得的交聯的HA水凝膠顯示更高的溶脹比例和增強的柔軟性。通過27G*1/2針頭注射期間施加的壓力相對于后一樣品的情況更穩定，表明交聯的HA水凝膠更均質。實施例3-DVS-交聯的HA水凝膠的生物穩定性該實施例采用酶降解闡述了DVS-交聯的HA水凝膠的體外生物穩定性。在30mM檸檬酸、150mMNa2HPO4、和150mMNaCl(pH6.3)中制得牛睪丸透明質酸酶(HA酶)溶液(100U/mL)。將DVS-HA交聯的水凝膠樣品(約1mL)置于完全封閉的(safelock)玻璃瓶中，凍干，和稱重(Wo；式1)。隨后將酶溶液(4mL，400U)加到每個樣品中，并且將瓶子在37℃下在溫和振蕩(100-200rpm)下溫育。在預定的時間間隔，除去上清液并且將樣品用蒸餾水徹底清洗以除去殘留的鹽，隨后將它們凍干，和最終稱重(Wt；式1)。生物降解表述為相對于樣品初始重量的重量損失比例(式1)。由酶降解測試前后每個樣品的重量減少計算重量損失。每個生物降解試驗重復三次。式1結果示于表4、以及圖1中，其闡述了由HA酶降解獲得的DVS-HA水凝膠的重量損失隨時間的變化。將如實施例2中所述制得的(“加熱的”)DVS-HA水凝膠與未進行熱處理(“未加熱的”)的DVS-HA水凝膠比較。對于兩種類型的凝膠，在開始4個小時內降解是快速的，且隨后進程減慢直到在24h時結束。重要地，與如實施例2中所述采用加熱步驟制得的水凝膠比較時，未加熱的樣品的重量損失值存在顯著的變化。這清楚地顯示，通過使用實施例2中所述的方法獲得了高均質的DVS-交聯的HA水凝膠。實施例4-用于化妝品的油包水乳液的制備在本實施例和隨后的實施例中，將DVS-交聯的HA水凝膠配制成乳膏(cream)和漿液(serum)，其在施用到皮膚上時增加皮膚濕潤性和彈性，并且提供直接的(immediate)抗老化效應，以及成膜效應。通常的油包水(w/o)乳液配制物含有2％的DVS-交聯的HA。通過混合所定義的成分(參見表4)，單獨地制備每個相(A～E)。隨后在采用機械推進攪拌裝置攪拌的條件下和在小于40℃的溫度下將相B加到相A中。隨后在攪拌下加入相C，隨后是相D，并且最后是相E。也制備配制物，其中相D中HA水凝膠濃度分別為4％、6％、和8％，由此獲得多種w/o配制物。表4表5中顯示了另一通常的含有2％DVS交聯的HA的W/O-乳劑配制物。通過混合所定義的成分(參見表5)，單獨地制得每個相(A～F)。將相B與相A混合，并且將獲得的油相在75℃下加熱。將相C也加熱到75℃。在75℃下在采用機械推進攪拌裝置攪拌下將油相加到相C中。隨后將乳劑冷卻到低于40℃，之后在攪拌下加入相D，隨后是相E和最后是相F。也制備配制物，其中相E中HA水凝膠濃度分別為4％、6％和8％，由此獲得多種w/o配制物。表5實施例5-硅氧烷漿液的制備如表6中所示，制得了含有2％DVS交聯的HA的通常的硅氧烷漿液配制物。在極高攪拌和小于40℃下將全部成分同時混合(參見表6)。也制備配制物，其中HA水凝膠濃度分別為4％、6％和8％，由此獲得多種漿液。表6實施例6-溶脹期間的pH平衡；動力學研究動力學研究顯示，依據交聯度，在磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)中溶脹8～14小時之后，獲得了具有中性pH的DVS交聯的HA水凝膠。如上所述制得一組DVS交聯的HA水凝膠，利用4～8％的HA溶液，且利用各種量的DVS交聯劑，如表7中所示。表7在定期的間隔(每2小時)，在熱處理期間取出水凝膠并傾析，并且測量pH值(參見圖2)。每次測量之后使用新的溶脹緩沖劑。結果顯示，對于所有水凝膠，2小時的溶脹之后pH范圍為11～12。隨后pH逐漸降低到7.2-7.5。對于較少交聯的水凝膠，即其中HA/DVS比例較高的水凝膠，降低較快。圖2中顯示了對于HA6％溶液和兩種不同比例的HA/DVS的pH降低，其中10∶1的HA/DVS比例用三角形標注，15∶1用正方形標注。在這兩種情形中，在8小時之內使pH中和。相反，對于具有更高HA濃度(例如8％)或者更高程度交聯(例如HA/DVS比例為2.5)的水凝膠，在14小時溶脹之后達到中性pH。這些觀察與低交聯水凝膠中HA分子顯示更高自由度和靈活性的事實相一致，其容許良好的水合作用和由此更快的pH平衡。實施例7-基于DVS-交聯的HA的水凝膠的粘彈性采用板-板幾何形狀和在25℃的控制溫度下，在PhysicaMCR301流變儀(AntonPaar，Ostfildern，Germany)上進行流變學測量。通過動態振幅剪切擺動測試考察樣品的粘彈性行為，其中使材料經受正弦剪切應變。首先，進行應變/振幅掃描試驗以評價其中線性粘彈性有效的變形區域。應變通常范圍為0.01～200％，且頻率設定為1Hz。隨后，在線性粘彈性區域中，在恒定剪切應變(10％)和0.1～10Hz的頻率下，從頻率掃描試驗中記錄剪切儲存模量(或彈性模量G’)和剪切損失模量(或粘性模量，G”)值。幾何形狀、NF和間隙分別為PP25、2和1mm。G’給出了關于變形期間材料中儲存的彈性或能量的信息，而G”描述了加熱時消散的粘性特征或能量。特別地，彈性模量給出了關于樣品支撐負荷和強加應力或變形之后恢復初始結構的能力的信息。全部試驗中，每個樣品測試至少三次。結果(圖3)顯示，對于兩種水凝膠·G’＞G”和·G’幾乎獨立于頻率。在具有較高程度的交聯(即，較低的HA/DVS比例10/1)的水凝膠情形中，G’比G”高一個數量級，表明該樣品變現為強的凝膠材料。簡要地，整體流變學響應歸因于物理與化學交聯的貢獻，和HA大分子之間的拓撲相互作用。鏈之間的相互作用帶來了它們的本征運動性(intrinsicmobility)的降低，其不能夠釋放應力，并且由此該材料表現為三維網絡，其中所施加應力的主要調整模式是通過網絡變形。另外，該水凝膠的彈性高于具有較低程度交聯(即，較高比例的HA/DVS15∶1)的水凝膠彈性。實際上，永久共價交聯的數目越高，纏結數目越大，且由此水凝膠的彈性響應更高。實施例8-網絡結構參數該試驗中，使用平行板幾何形狀(PP30單元)在旋轉流變儀(Gemini，BohlinInstruments，UK)上評價粘彈性。使用恒溫浴在25℃的控制溫度下進行測試。為了避免水蒸發，通過濕度控制附件控制含有該樣品的室的濕度。使水凝膠在動態試驗(小振幅頻率掃描測試)中經受周期性擺動，由此評價彈性和粘性模量G’和G”的依賴性。頻率范圍為0.01Hz～10Hz。為了確定材料的線性粘彈性響應范圍，以1Hz的擺動頻率在樣品上進行初步的應變掃描測試。每個樣品上的測試重復至少三次。可以利用彈性模量值來評估網絡結構的參數。由于G與纏結數目成比例(Ferry，1980)，所以彈性模量可以通過下式來表示式2其中，RT為熱能，且z為纏結點或交聯點的數目，以mol/體積表示。參數z可以通過下式來計算式3其中，c為聚合物濃度，且Me為兩個纏結之間聚合物鏈段的平均分子量。帶入式2，Me可以通過下列等式來估算式4為了通過式4計算G，假定橡膠彈性理論有效，且假設凝膠狀材料的臨時網絡，在短于纏結網絡的壽命的時間尺度的刺激下表現如同硫化橡膠(Flory，1953)。“懸垂端”，其為僅通過一個纏結點連接于網絡的聚合物鏈鏈段，不會貢獻于G值，因為它們不能儲存彈性能量。由此，在式4中需要修正(Flory，1953)式5其中，Mn為數均分子量。利用“等價網絡模型”(Schurz，1981)，能夠估算DN，其為理想化的“等價網絡”中纏結點之間的平均距離式6其中，A為阿伏加德羅數(Avogadro′snumber)。DN和Md的結果在表8中給出。可以注意到的是，對于樣品1獲得了更高的Md(248120g/mol)和更高的DN(46nm)。樣品2具有最低的Md(204000)和43.5nm的DN值。樣品3和4具有相同的彈性模量，其特征為在于，Md為240000g/mol和DN為42nm。表8對于DVS-HA水凝膠的網絡參數。(a)溶脹期間；(b)0.1Hz下的彈性模量值。實施例9-DVS-交聯的HA水凝膠的可注射性將依據本發明制得的DVS-交聯的HA水凝膠的可注射性與依據現有技術(例如US4,582,865實施例1)制得的水凝膠的可注射性進行比較。在Texture分析儀(StableMicroSystems，TA.XTPlus)上測量注射性，其為以12.5mm/min的速度在55mm的距離之上將水凝膠通過27G1/2針頭注射所需的力(以N表示)。將水凝膠樣品轉移到裝有27G1/2針頭的1mL-注射器中，并且將該注射器置于固定器中。每個樣品測量三次。圖4和5闡述了HA/DVS重量比分別為10∶1和15∶1的DVS-交聯的HA水凝膠的可注射性。圖4和5中記錄的注射曲線是樣品均質性特征。實際上，施加的注射力越穩定，水凝膠均質性越高。而且，低的力對應于操作者容易注射該水凝膠。該結果清楚地表明，依據本文中所述方法制得的DVSHA水凝膠的均質性遠遠大于由現有技術方法獲得的那些。值得注意的是，現有技術的樣品必須用機械方法均質化，由此使它們完全可注射。這種均質化產生了小顆粒，其存在導致非常不規則的注射曲線。另外，依據本發明制得的交聯的水凝膠更容易通過細針頭注射，這點由需要更低的力而得到證實。值得注意的是，由于形成更強的網絡，注射力隨著交聯度的增加而增加。實施例10-用于局部眼科學的交聯的DVS-HA水凝膠的配制物表9中顯示了含有1％(w/v)DVS交聯的HA的通常的500mL滴眼劑溶液配制物。稱量所有成分并轉移到500mL容量瓶中。加入水(300mL)并且將混合物在室溫下攪拌5h。用2MNaOH將pH調節到7.2，用Milli-Q水將體積調節到準確的500mL。表9實施例11-具有防腐劑的交聯的HA/DVS水凝膠采用0.2MNaOH中的1.5gHA鈉以獲得6％(w/v)溶液，制得DVS交聯的HA水凝膠。HA/DVS重量比為10∶1。依據實施例2中所述的工序制備水凝膠的三個復制品，直到溶脹步驟，之后如下處理在50℃的爐中溫育2小時之后，將水凝膠浸入Na2HPO4/NaH2PO4緩沖劑(1L，50mM，pH7.0)中，該緩沖劑含有防腐劑(2-苯氧基乙醇/3[(2-乙基己基)氧基]1，2-丙二醇)。防腐劑的濃度為10mL/mL以達到溶脹的水凝膠中最終濃度為1％(v/v)。預期防腐劑將在孵化期間擴散到水凝膠中，且同時，將防止緩沖劑中的微生物污染。將容器用parafilm覆蓋并且置于37℃的爐中。1h后，移除溶脹浴并且將水凝膠在含有10mL/mL防腐劑的新鮮磷酸鹽緩沖劑中溶脹6-7h。重復該步驟直到溶脹時間為12h，隨后測量pH。再繼續溶脹2.5h以達到中性pH。通過UV-分光光度法(ThermoE1ectron，Nicolet，Evolution900，equipmentnr.246-90)測量結合到水凝膠中的防腐劑的量。首先分析防腐劑在磷酸鹽緩沖劑中的1％(v/v)溶液以選擇波長。利用吸液管收集大約5mL的水凝膠。通常，在溶脹的圓形水凝膠的中間，和在該圓形凝膠的北、東、南和西“側面”中收集樣品。隨后將樣品轉移到比色皿中并且在292nm處讀出吸光度。每個樣品讀取三次，且相對于不含防腐劑的空白的DVS交聯的HA水凝膠，吸光度為零。結果顯示，結合到DVS-HA水凝膠中的防腐劑的量的范圍為0.91～1.02％(參見表10)。復用品之間存在極佳的再現性。重要地，并未觀察到來自相同水凝膠中的樣品之間的顯著差別，表明防腐劑均勻地擴散到水凝膠中。表10在摻加1％防腐劑的磷酸鹽緩沖劑中溶脹14.5h后結合到DVS-HA水凝膠中的防腐劑的量。(*)吸光度為在相同樣品上進行的三次測量的平均值。權利要求1.一種制備包含由二乙烯基砜(DVS)交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供透明質酸或其鹽的堿性溶液；(b)將DVS加到步驟(a)的溶液中，由此用DVS交聯透明質酸或其鹽以形成凝膠；(c)用緩沖劑處理步驟(b)的凝膠，其中凝膠溶脹且形成包含由DVS交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠。2.權利要求1的方法，其中透明質酸或其鹽是在芽孢桿菌屬宿主細胞中重組制備的。3.權利要求1或2的方法，其中透明質酸或其鹽的平均分子量為100～3,000kDa，優選地為500～2,000kDa，且最優選地為700～1,800kDa。4.權利要求1～3中任一項的方法，其中該堿性溶液包含濃度為0.1％～40％(w/v)的溶解的透明質酸或其鹽。5.權利要求1～4中任一項的方法，其中該堿性溶液包含濃度為0.001～2.0M的溶解的氫氧化鈉。6.權利要求1～5中任一項的方法，其中以HA/DVS(干重)為1∶1～100∶1，優選HA/DVS(干重)為2∶1～50∶1的重量比將DVS加到步驟(a)的溶液中。7.權利要求1～6中任一項的方法，其中在攪拌下將DVS加到步驟(a)的溶液中，且其中將溶液溫度保持在5℃～50℃，優選15℃～40℃，更優選20℃～30℃。8.權利要求7的方法，其中該攪拌持續1～180分鐘的時間。9.權利要求1～8中任一項的方法，其中將DVS加到步驟(a)的溶液中而不攪拌。10.權利要求1～9中任一項的方法，其中將步驟(b)中溶液溫度加熱到20℃～100℃，優選為25℃～80℃，更優選為30℃～60℃，和最優選為35℃～55℃，且其中將溫度在該范圍保持至少5分鐘的時間。11.權利要求10的方法，其中在步驟(b)之后且在步驟(c)之前，將凝膠在0℃～40℃、優選在10℃～30℃的溫度保持至少5分鐘的時間。12.權利要求1～11中任一項的方法，其中該緩沖劑包含pH值范圍為2.0～8.0、優選為5.0～7.5的緩沖劑。13.權利要求1～11中任一項的方法，其中該緩沖劑包含其pH值使水凝膠的pH值在5.0～7.5之間的緩沖劑。14.權利要求12或13的方法，其中該緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑和/或鹽緩沖劑。15.權利要求1～14中任一項的方法，其中步驟(c)中的緩沖劑的體積是步驟(b)的凝膠的體積的至少3倍。16.權利要求1～15中任一項的方法，其中在20℃～50℃溫度下進行步驟(c)至少5分鐘。17.權利要求1～16中任一項的方法，其中用水，和/或pH值為2.0～8.0，優選為5.0～7.5的磷酸鹽和/或鹽緩沖劑，洗滌步驟(c)中形成的水凝膠至少一次。18.權利要求1～17中任一項的方法，其中將防腐劑作為組分加到水凝膠中，優選地將防腐劑加到步驟(c)的緩沖劑中。19.一種包含由二乙烯基砜(DVS)交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠，其均質性足以用穩定注射力以12.5mm/min的速度在55mm的距離之上通過27G1/2針從1mL注射器中注射，該注射力在注射的最初40秒鐘之后、和直到注射器清空，變化不超過約5牛頓(N)，優選地不超過約4N，更優選3N、2N，或者最優選地不超過約1N。20.權利要求19的水凝膠，其中透明質酸或其鹽的分子量為300,000～3,000,000，優選地為400,000～2,500,000，更優選地為500,000～2,000,000，且最優選地為600,000～1,800,000。21.權利要求19的水凝膠，其中透明質酸或其鹽的低平均分子量范圍為10,000～800,000Da，優選地為20,000～600,000Da，更優選地為30,000～500,000Da，甚至更優選地為40,000～400,000Da，且最優選地為50,000～300,000Da。22.權利要求19～21中任一項的水凝膠，其包含透明質酸的無機鹽，優選透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸銨、透明質酸鈣、透明質酸鎂、透明質酸鋅、或透明質酸鈷。23.權利要求19～22中任一項的水凝膠，其還包含活性成分。24.權利要求23的水凝膠，其中該活性成分是藥理學活性物質。25.權利要求19～24中任一項的水凝膠，其還包含水溶性賦形劑，優選乳糖。26.權利要求19～25中任一項的水凝膠，其還包含防腐劑。27.一種組合物，其包含權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠和活性成分，優選地該活性成分是藥理學活性劑。28.權利要求27的組合物，其還包含水溶性賦形劑，優選乳糖。29.一種藥物組合物，其包含有效量的權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠，以及可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。30.一種藥物組合物，其包含有效量的權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠作為媒介物，以及藥理學活性劑。31.一種化妝用品或組合物，其包含權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物。32.一種衛生、醫療或外科用品，其包含權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠、或權利要求27～30中任一項所定義的組合物；優選地該用品為尿布、衛生巾、外科紗布、創傷愈合紗布、或者繃帶(bandaid)或其它創傷敷料中所含的一部分。33.一種藥物膠囊或微膠囊，其包含權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物。34.權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物用于制備治療骨關節炎的藥物的用途。35.權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物用于制備眼科治療用藥物的用途。36.權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物用于制備治療癌癥的藥物的用途。37.權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物用于制備治療創傷的藥物的用途。38.權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物用于制備血管發生用藥物的用途。39.權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物用于制備保濕劑或化妝品組合物的用途。40.權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物用于制備治療脫發或禿頂的藥物的用途。41.權利要求19～26中任一項所定義的水凝膠或權利要求27～30中任一項所定義的組合物在美容處理中的用途。全文摘要本發明涉及一種制備包含由二乙烯基砜(DVS)交聯的透明質酸或其鹽的均質水凝膠的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供透明質酸或其鹽的堿性溶液；(b)將DVS加到步驟(a)的溶液中，由此用DVS交聯透明質酸或其鹽以形成凝膠；(c)用緩沖劑處理步驟(b)的凝膠，其中凝膠溶脹且形成包含由DVS交聯的透明質酸或其鹽的水凝膠。文檔編號A61K9/48GK101107270SQ200580047101公開日2008年1月16日申請日期2005年11月24日優先權日2004年11月24日發明者范妮·朗金,卡迪賈·施瓦科-阿布戴爾拉奧尤申請人:諾維信生物聚合物公司