病毒體的冷凍干燥的制作方法

專利名稱：病毒體的冷凍干燥的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于病毒體的高效冷凍干燥和重建的組合物和方法。
背景技術：
冷凍干燥或"凍干"是用于去除水分的技術方法。其中，含水溶 液在其共晶點以下被冷卻，直至其完全被冷凍。之后，將大氣壓力降 至真空，使得水升華并從溶液中脫出。被溶解的因子保持為多孔固體， 之后其可再次溶于水。凍干產生具有巨大表面積的固體，導致高的水 溶性。
冷凍干燥在制藥學應用中得到廣泛使用，因為絕大多數醫藥品在 溶液中具有有限的儲存期。通過凍干劑的生產可顯著提高其儲存期， 所述凍干劑在使用前在適當的溶劑中快速溶解。盡管已證明冷凍干燥 是當前普遍使用的優良的保藏技術，但是其也具有本質的缺點。這些 缺點主要與冷凍和重建過程相關聯，其經常對生物活性因子或組合物 有害。為保持功能性和活性，發展了不同的技術，特別是包括例如糖 如蔗糖和海藻糖的防凍劑的使用。
脂質體和病毒體作為藥物遞送載體具有突出的特點。但是脂質體
是球形脂質嚢，病毒體是不含有原始病毒感染遺傳物質的病毒包膜。 脂質體和病毒體的區別在于病毒體在其表面含有使其成為融合活性 顆粒的額外蛋白，而脂質體是非活性載體。
因此，病毒體是現代疫苗接種中高度有效的佐劑/載體系統，具有 作為抗原遞送載體的優良特性和強大的免疫原性潛能，同時伴隨著最 小化的副作用危險。
當前，病毒體已被有效應用于許多疫苗。例如，可商業化獲得的 抗甲肝病毒和流感病毒疫苗使用病毒體作為佐劑和安全的抗原遞送 載體。由接種重建在病毒體內的抗原所引發的抗體顯示出對其賴 發的抗原的高親合性。
脂質體的凍干可以防止儲存期間磷脂的水解和嚢泡的物理降解。 另外，其可幫助穩定整合在脂質體中的物質。脂質體制劑的凍干形成 干塊，其可在數分鐘內重建以獲得最初的分散體，即，如果使用合適 的賦形劑，以及如果應用合適的凍千條件。另一方面，凍干方法本身 可以引起脂質體的物理變化，例如被灌嚢因子的丟失及嚢泡大小的改 變。這種損傷的出現并不驚奇，因為親水的磷脂頭部基團和水分子之 間的相互作用在脂質體雙層形成中扮演關鍵的角色。因此，通過凍干 從脂質體中去除水是令人激動的挑戰。另外，凍干是耗時和耗能的方 法，其確實需要一些專門技術以防止具體的缺陷。有幸的是，賦形劑， 例如雙糖，在冷凍(冷凍干燥)過程中保護脂質體已得到確定，并且
凍干技術在文獻中已得到廣泛描述(Pikal等人.，1990， Int. J. Pharm. Sci. (國際制藥科學雜志)60,203;Pikal， 1990,Biopharm(生物制藥)10, 18; Essig等人.，1993， "Lyophilization (冷凍干燥)"，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart ; Jenning, 1999， "Lyophilization: Introduction and basic principles (〗令凍、干燥入門及基本原、J里)", Interpharm Press (國際制藥學出版社)，Englewood， CO )。
冷凍干燥保護劑通過以下保護脂質體(1)阻止脂質體的融合， (2)阻止冰晶對雙分子層的破壞，以及(3)在無水時保持雙分子層 的完整性。為此，冷凍干燥保護劑必須在脂質體內和周圍形成無定形 的玻璃狀基質。冷凍千燥保護劑和磷脂頭部基團之間的相互作用被認 為對阻止脂質體在重水合過程中的漏出特別重要，所述脂質體具有在 室溫下呈水合狀態的液-晶雙分子層。
可以鑒別出有關冷凍的不同類型的脂質體制劑(1)空脂質體， 用要被灌嚢的化合物的溶液重建該脂質體，(2)承載與雙分子層有力 相聯的化合物的脂質體，以及(3)含有不與雙層相互作用的水溶性 化合物的脂質體。第三種代表了最大的挑戰，因為需要既阻止被灌嚢 溶質的漏出又保持脂質體大小。當確定脂質體對凍干壓力的抗力時， 雙分子層的組分是極為重要的因素，但是目前難于從文獻中總結出一 般原則，因為涉及了許多的其它參數，包括冷凍干燥方法的條件，冷
凍干燥保護劑的選擇，和嚢泡的大小。
如上文所描述，已證實脂質體的冷凍干燥至多是條件苛刻，但是 病毒體的冷凍干燥面對更大的問題。與脂質體相比，是由于包膜內承 擔病毒體融合活性的額外的蛋白。因為蛋白對凍干帶來的引起活性顯 著丟失的壓力極為易感。
因此，存在著對克服與融合活性分子即病毒體的高效冷凍千燥及 重建相關的問題的組合物和方法的需求。

發明內容
本發明提供了用于制備高度冷凍干燥壓力抗性的、可水合的病毒 體冷凍干燥制劑的生物活性組合物和方法，及其重建的方法。根據本 發明，生物活性組合物是指含有病毒體和用于高效冷凍干燥和重建病 毒體的陽離子脂質的免疫原性組合物或藥物組合物，并且特別是指免 疫原性組合物或藥物組合物，其中用于高效冷凍干燥和重建病毒體的 陽離子脂質存在于病毒體的膜中。
使用本發明的教導，可以獲得具有突出冷凍干燥和重建特性并且
特別有助于遞送抗原、藥物和包括DNA、 RNA、 siRNA在內的其它 藥物活性物質進入細胞的病毒體。冷凍干燥后，其仍可以通過靶向系 統遞送所述物質到特定的細胞，其識別特定細胞類型的表面標記，并 且因此特別優越于其它已知的遞送系統。
在一優選實施方案中，使用的陽離子脂質體為陽離子膽固醇書亍生物。
在本發明的另 一實施方案中，所述膽固醇衍生物由以下通式表
示
(I)其中R選自R'; R'- (OO)-; R'-O- (OO)-; R'畫NH- (OO) -; R'畫O-(C=0) -R"- (C=0) -; R'- NH-(C=0)-R"-(C=0)-，其中R'為被至少一個陽性荷電基團取代的d-CV烷基，優選地是 通式1^112113:^+-的含1^基團，并且各自的反離子是x-;其中Ri， R2和R3相互獨立地選自氫和d-CV烷基；其中x-選自卣素、硫酸氫根、磺酸根、磷酸二氬根、醋酸根、三 鹵醋酸根和碳酸氫根；以及其中R"是d-CV亞烴基。根據本發明，為d-CV亞烴基的R"代表飽和的CrQ-亞烴基部分， 其可為-CH2-， -(CH2)2-等，也可以代表支鏈例如-CH(CH3)-(CH2)2-等。在一個進一步的實施方案中，所述膽固醇衍生物由通式n表示(I工)其中，RhR2和R3可相互獨立地選自氬和d-CV烷基，并且其中X—是鹵素陰離子。在另一個實施方案中，所述陽離子脂質由通式II表示，其中R4和R2是甲基，R3是氫，并且X-是卣素陰離子，優選地是氯離子，即 3 (3 [N-(N',N'-二甲氨基乙基)-氨甲酰基]膽固醇氯化物(DC-Chol )。在 另一個最優選的實施方案中，所述陽離子脂質由式II表示，R4、 R2 和R3是甲基，并且X-是卣素陰離子，優選地是氯離子，即3(3[N-(N', N', N'-三甲氨基乙基)-氨甲酰基]膽固醇氯化物(TC-Chol)。本發明的病毒體是向細胞遞送生物活性物質的融合活性載體，所 述生物活性物質選自藥物因子和細胞的抗原分子。特別是，本發明的 病毒體是抗原遞送載體，可以引發對靶抗原的免疫應答，或者是藥物 遞送載體，將藥物遞送至細胞，并且，由于其膜組分適于冷凍干燥。 在一個高度優選的實施方案中，病毒體是免疫增強的重建的流感病毒 體(IRIVs )。本發明的病毒體膜組合物優選地包括相對病毒體膜的總脂含量 的1.9和37mol。/。之間的DC-Chol或TC-Chol。在一個高度優選的實 施方案中，膜中的DC-Chol或TC-Chol含量在病毒體膜的總脂含量的 1.9和16mol。/。之間。膜的其余脂含量優選地由磷脂組成，最優選地， 以比例4: 1的磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。另外，病毒體膜可以含 有足以保證病毒體的融合活性的一定量的血細胞凝集素。在本發明的一個實施方案中，組合物可以另外包括所需要的生物 活性物質，所述生物活性物質選自冷凍干燥前的溶液中的藥物因子和 抗原分子。在另一個實施方案中，所選擇的藥物因子或抗原可在重建 步驟前加至凍千劑中，或者在冷凍干燥后在重建步驟中與流體溶劑一 起加入，即溶解于其中。在一個進一步的實施方案中，本發明的組合物可以進一步包括冷 凍干燥保護劑，例如蔗糖，或佐劑，或佐劑系統。本發明也包括上述提及的病毒體組合物的冷凍干燥和重建方法 和由其獲得的凍干劑。另外，本發明組合物在制造用于接種和免疫受試對象的藥物中的 應用也將成為本發明的一部分。最優選的受試對象是人。另外，本發明還包括試劑盒。所述試劑盒包括使用本發明的冷凍 千燥方法獲得的凍干劑。進一步而言，所述試劑盒可進一步包括重建 溶劑和選自藥物因子和抗原分子的所述生物活性物質，只要所述生物 活性物質并沒有成為凍干劑組合物的一部分。在一個實施方案中，在 重建病毒體凍干劑之前，藥物因子或抗原分子將在重建溶劑中溶解。所述試劑盒提供易于制備例如用于疫苗接種的，帶所選靶抗原的 免疫原性組合物的裝置，并且同時提供了延長的儲存期和優良的儲存 和操作性能。另外，如上所述陽離子脂質在促進病毒體的免疫原性上的應用也 是本發明的一部分。


圖l顯示了 FRET分析測量的具有不同的膜組合物的IRIVs在冷 凍干燥之前和之后的融合活性(見實施例9)。被比較的是不含脂質的 IRIVs (A )，含DC畫Chol的IRIVs (B )，含DOTAP的IRIVs ( C )和 含DHAB的IRIVs (D )。圖2顯示了用在病毒體表面含AMA49-CPE肽的IRIV DC-Choi免 疫的小鼠血清ELISA (見實施例21)。被比較的是冷凍干燥前的 AMA49- IRIV- DC-Choi,冷凍干燥后用水重建的AMA49- IRIV-DC-Chol,冷凍干燥后用AMA49-CPE肽重建的IRIV-DC-Chol和 AMA49-IRIV對照血清。圖3顯示了用在病毒體內含HLA結合肽的IRIV- DC-Chol免疫的 小鼠的CTL實驗(見實施例20)。被比較的是用水，200|ig/ml和650 嗎/ml的HLA結合肽重建的DC-Choi- IRIV。
具體實施方式
本發明公開了用于冷凍干燥和重建病毒體的生物活性組合物和 方法。為達到對本發明病毒體融合活性的保持，本文公開了具體的膜
組合物。這些組合物是本發明的一部分，并且同時包括磷脂和病毒蛋 白紅細胞凝集素陽離子脂質，以給本發明病毒體提供優良的凍干壓抗 性。陽離子脂質本發明涉及一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包括病毒 體和用于所述病毒體高效冷凍干燥和重建的陽離子脂質，并且，具體 地，涉及一種免疫原性組合物，其中用于病毒體高效冷凍干燥和重建 的陽離子脂質存在于所述病毒體的膜中。在本發明的一個優選實施例中，用作完整膜成分的陽離子脂質為DOTMA， DOTAP， DPPES, DOGS, DOSPA, DOSPER, THDOB， DOPA， DOTP， DOSC， DOTB, DOPC， DOPE以及優選地為月旦固醇衍生物。優選的膽固醇衍生物由下式表示H(工)其中，R選自R'; R'- (C=0)-; R'-O畫(OO)-; R'-NH國(OO) -; R'-O-(OO) -R"- (C=0) -; R'- NH-(C=0)-R"-(O0)-，其中R'為被至少一個陽性荷電基團取代的d-CV烷基，優選地是 通式1^112113>^-的含>^基團，并且各自的反離子是X;其中R4， R2和R3相互獨立地選自氬和C廣C6-烷基；其中x-選自面素、硫酸氫根、磺酸根、磷酸二氫根、醋g吏根、三 卣醋酸根和碳酸氬根；以及其中R"是CVC6-亞烴基。根據本發明，作為CrQ亞烴基的R"代表飽和的d-C6亞烴基部
分，該部分可以是-CH2-, -(012)2-等，也可以以支鏈例如-CH(CH3) -(CH2) 2-等出現。在一個更優選的實施方案中，所述膽固醇衍生物由通式II表示H3C//,,(II)其中，R" R2和Rs相互獨立地選自氫和Q-C6-烷基，并且其中 X—是鹵素陰離子。在一個最優選的實施方案中，陽離子脂質由通式II表示，&和 R2為曱基，R3為氫，并且X-為鹵素陰離子，優選地為氯離子，以產 生3(3[N-(N',N'-二曱氨基乙基)-氨甲酰基]膽固醇氯化物(DC-Chol)。在另 一個最優選的實施方案中，所述陽離子脂質由通式II表示，R2和R3為甲基，且X-為卣素陰離子，優選地為氯離子，以產生 3p[N-(N'，N', N'-三甲氨基乙基)-氨曱酰基]膽固醇氯化物(TC-Chol)。 發現DC-Chol和TC-Chol在保持冷凍干燥和重建后的病毒體融合活性 方面顯示了優良的性能。 病毒體病毒體是病毒的包膜，不包括原始病毒感染性的遺傳物質。如脂 質體一樣，病毒體可以用于遞送治療性物質給多種種類的細胞和組 織，但是與脂質體不同的是，病毒體提供了在高效進入細胞上的優勢， 進入細胞后緊接著是由病毒的融合蛋白激發的病毒體內容物的細胞 內釋放。更進一步，由于有活性的病毒融合蛋白整合入其膜中，病毒 體在被細胞攝入后立即釋;^文其內容物進入細胞質，因此阻止了治療性
物質在內涵體酸性環境中的降解。病毒體可以進一步^^同時加上幾種不同的B細胞和T細胞抗原決定簇(Poltl-Frank等人.，1999, Clin. Exp. Immunol (臨床實驗免疫學).117:496; Moreno等人.，1993, J. Immunol (免疫學雜志).151:489),包括通常的T輔助細胞抗原決定簇(Kumar 等人.，1992, J. Immunol (免疫學雜志).148: 1499-1505 )以及本領域 技術人員已知的其它抗原決定簇。因此，病毒體是現代疫苗的高效佐 劑，具有作為抗原遞送載體的優良性質和強烈的免疫潛能，同時還可 最小化副作用風險。在本發明中，^Hf了生物活性組合物，所述生物活性組合物包4舌 選自藥物因子和抗原分子的生物活性物質，所述生物活性物質被整合 入稱為免疫增強的重建流感病毒體(IRIVs)的合成球狀病毒體中。 IRIVs是具有150nm的平均直徑的球狀單層載體，并包括雙脂質膜， 其主要由磷脂，優選為磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)組 成。與脂質體相比，IRIVs含有插入磷脂雙分子膜中的功能性的病毒 包膜糖蛋白紅細胞凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)。生物活性HA 不僅僅帶來結構穩定性和病毒體制劑的均一性，還通過保持病毒的融 合活性而顯著有助于免疫特性。根據本發明，所述生物活性組合物能夠遞送生物活性物質至有機 體的細胞空間內。所述生物活性物質選自藥物因子和抗原分子，其優 選地選自DNA, RNA, siRNA,蛋白質，肽，氨基酸，藥物，藥物前體 和藥物活性物質或其衍生物。生物活性物質優選地是藥物，抗原或其 混合物。藥物因子的例子選自下列物質麻醉劑，血管生成抑制劑，抗痤 瘡制劑，抗過敏劑，局部使用的抗生素和化學治療物，抗組胺劑，抗 炎癥藥物/抗感染藥物，抗肺瘤藥物，抗原，抗原生動物藥物，抗風濕 藥物，抗病毒疫苗，抗病毒藥物，抗凋亡藥物，細菌疫苗，〗匕學治療 藥物，細胞生長抑制劑，免疫抑制劑，松弛劑和精神抑制藥物。藥物 或免疫活性物質的優選例子是阿霉素，長春堿，順鉑，甲氨蝶呤，環 孢素，布洛芬。術語"抗原分子"是指所需免疫應答所依賴的分子。該分子可以 選自但不限于肽，蛋白質，脂質，單、寡聚和多聚糖，糖肽，糖類， 脂肽，細菌或病毒病原和毒素，其它小免疫分子和編碼這些分子的DNA/RNA。"免疫原性"是指分子在接種該分子的有機體內引發免疫 應答的能力。抗原分子的例子是基于肽的T細胞抗原和B細胞抗原。 抗原分子的優選例子是基于HCV的T細胞抗原，肺瘤相關抗原，百 日咳毒素，霍亂毒素和癡疾，RSV,阿茲海默(Alzheimer)(特別是 P淀粉樣)肽抗原。對于本發明的腫瘤治療應用而言，任何化學治療藥物將適宜于通 過病毒體包嚢化。本發明的方法和組合物進一步適宜借助于將物質耙 向遞送至特定細胞和組織的任何治療相關的應用。這樣的應用可以包 括抗肺瘤藥物到肺瘤細胞，抗病毒藥物到感染細胞和組織，抗微生物 藥物和抗炎癥藥物到受侵襲組織的靶向遞送，以及治療劑向受特定疾 病侵襲的那些器官和組織的遞送，因此增加了治療藥物的治療指數， 并避免系統毒性。例如，在肺瘤治療中，阿霉素， 一種蒽環類的抗腫 瘤抗生素可以通過本發明方法和組合物進4亍遞送。蒽環類抗生素具有 廣譜的抗腫瘤活性，及對細胞施加多向性的影響。盡管它們是經典的 DNA插入劑，其細胞毒性的機制被認為是涉及到與拓樸異構酶II的 相互作用，雙鏈DNA突變的產生，及可能涉及到高細胞毒性的細胞 內自由基的產生，因此，結合的病毒體可以載有阿霉素以選擇性和有 效性地抑制所構建的過度表達的rNeu乳腺癌的腫瘤進程。目前病毒體已被有效用于各種疫苗。例如，可商業化獲取的抗曱 肝病毒和流感病毒的疫苗。病毒體,皮證明是優異和安全的佐劑/載體系 統。由在病毒體中重建的抗原接種引發的抗體顯示出對其賴以引發的 抗原的高度親合性。被單獨注射的大多數肽抗原顯示較低的免疫原性。但是采以與抗 原和病毒體結合的形式，可產生能夠測量得到的高度特異性的抗體對抗原的滴度。抗原肽可以經病毒體遞送，既可以位于病毒體表面上也 可以被包嚢入病毒體中。區別在于免疫應答的類型。當病毒體在內吞 作用后與內涵體融合時，它們的內容物，包括被包嚢的抗原被釋放入 細胞質。在細胞質中，所述內容物被加工并與MHC I型分子復合一皮遞呈在細胞表面，引發細胞的CD8+細胞介導的細胞毒性免疫應答。 與該機制相對照，表面抗原被B細胞識別和內吞，所述B細胞將其與 MHC II型分子復合遞呈，并且因此引發了體液免疫應答和特異性抗 體的產生。為增加生物活性物質混合入病毒體的效率，其處理及為獲得更長 的儲存期，本發明公開了用于本發明的病毒體高效冷凍干燥的方法和 組合物。當欲開發高效的病毒體凍干劑時，雙分子膜的組成是關4建因 素，應該予以仔細考慮。在上下文中，"凍干劑"是指在用所選溶劑 重建之前被冷凍干燥的組合物。"重建"是指用適當溶劑溶解凍干劑 的過程。因此，本發明用實驗指明了不同的膜組合物的效率，所述膜 組合物包括在冷凍干燥和重建后保持病毒體大小和功能性的陽性、中 性荷電或不荷電的脂質。因此，本發明提供了使病毒體冷凍干燥和重 建不損失功能的病毒體膜組合物。基于這些實驗結果，本發明提供了高凍干壓抗性的、可水合的 病毒體凍千劑，其包括陽離子膽固醇衍生物，特別是作為整體膜成分 的DC-Chol或TC-Chol。可選擇地，這種病毒體凍干劑另外包括選自藥物因子和/或抗原分 子的生物活性物質。這些生物活性物質在冷凍千燥前連接至病毒體表 面或被裝入其中。在另外一個實施方案中，藥物因子和/或抗原分子與重建溶劑一起 被加至病毒體凍干劑中。這些藥物因子和/或抗原分子被連接到新形成 的病毒體的表面。優選地，藥物因子和/或抗原分子與脂質結合以為了通過脂質與病毒體膜連接。在另一個實施方案中，本發明公開了將藥 物因子和/或抗原分子高效裝入新形成的病毒體的內腔中的方法和組 合物。在一個優選的實施方案中，本發明的一種組合物包括病毒體膜總 脂含量的1.9至39moP/。的DC-Chol或TC-Chol。
在一個最優選的實施方案中，DC-Chol或TC-Chol的濃度在病毒 體膜的總脂含量的1.9至16moP/。之間。病毒體膜的剩余脂質由磷脂，優選由磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺組成。在一個高度優選的實施方案中，包含在病毒體膜中的磷脂酰膽 堿和磷脂酰乙醇胺的比例為4: 1。所有上述的組合物包括起作用量的病毒紅細胞凝集素。在上下文 中"起作用量，，是指足以保護融合活性的病毒體微粒的量。所選的 一種抗原分子可以既是以足以引發免疫應答的量被直接 加至上述的一種組合物中，也可以是溶解在重建緩沖液中，在重建過 程中加至上述一種組合物的凍干劑中。因此本發明也包括適宜于冷凍 干燥的、另外包括經選擇的耙抗原的組合物。所選的藥物化合物可以足以顯示生物活性的量被直接加至上述 的一種組合物中，也可以是溶解在重建緩沖液中，在重建過程中加至 上述一種組合物的凍干劑中。因此本發明也包括適宜于冷凍千燥的、 另外包括經選擇的耙抗原的組合物。本發明的組合物可以進一步包括輔助成分，其有助于冷凍干燥 操作。這些輔助組分包括但不限于冷凍干燥保護劑例如蔗糖、海藻 糖、右旋糖、乳糖、甘露糖、木糖和甘露醇。這種糖類化合物在冷凍 干燥前在溶液中采以0.1到0.5%的比例特別有益。術語"冷凍干燥j呆 護劑"是指在冷凍干燥過程中用作輔助成分的一類化合物，其能夠減 少病毒體的凍干壓力。同樣，本發明的一部分是冷凍干燥本發明組合物的方法，所述 方法基本上基于如下步驟冷凍、初級干燥和二級干燥以及隨后的用 溶劑或緩沖液的重建步驟，所述溶劑或緩沖液可選擇地含所需要的靶 抗原。所公開的組合物在制造用于免疫或接種受試對象的藥物中的應 用也是本發明的一部分，所述受試對象優選為人。同樣，本發明的 一部分是含已經被凍干的本發明病毒體的試劑 盒。除了病毒體凍干劑外，所述試劑盒可以進一步包括重建溶劑。如 果抗原分子還不是被冷凍干燥的病毒體的一部分，所述試劑盒還可另 外包括耙抗原。在本發明的一個實施方案中，試劑盒包括一種抗原分 子，在使用重建溶劑溶解被凍干的病毒體之前，所述抗原分子要被溶 解在所述重建溶劑中。另外，本發明公開了上述陽離子脂質在進一步促進病毒體的免疫 原性中的應用。在此方面，本發明人發現可以通過使用陽離子脂質， 優選地使用上述膽固醇衍生物的一種作為病毒體膜組分，IRIV本身的 免疫原性特點被進一步加強。在上下文中，術語"免疫原性，，是指引 發免疫應答的能力。 佐劑通過將任意的上述化合物與另外的免疫應答增強化合物結合可 以對本發明的組合物進行進一步地補充。免疫應答增強化合物被歸類 于佐劑或細胞因子。額外的佐劑可以通過提供抗原庫(細胞外或巨噬 細胞內)，激活巨噬細胞并刺激特異的淋巴細胞系而進一步促進免疫應答。在本領域有許多眾所周知的佐劑；具體的例子包括弗氏佐劑(完 全和不完全)，分支桿菌例如卡介苗(BCG)，母牛分枝桿菌疫苗(M. Vaccae),或脂質A,或短棒菌苗，天然皂角苷(quil-saponin)混合物 例如QS-21 (SmithKlineBeecham公司)，MF59 ( Chiron公司)，以及 各種水包油乳液(例如IDEC-AF)。可以^吏用的其它佐劑包括^f旦不限 于礦物鹽或礦物膠，例如氫氧化鋁，磷酸鋁，和磷酸釣；LPS衍生物， 皂角苷，表面活性物質例如溶血卵磷脂，多羥基的聚丙二醇與環氧乙 烷的加聚物(pluronicpolyols)，聚陰離子，肽或蛋白質片段，鑰孔威 血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin),和二》肖基酚；免疫刺，敫分子， 例如皂角苷，胞壁酰二肽和三肽衍生物，CpG二核苷酸，CpG寡聚核 苷酸，單磷酰脂質A,和聚磷腈；顆粒或《鼓粒佐劑，例如乳液，脂質 體，病毒體，脂質雙層巻(Cochleates);或免疫刺激復合物粘膜佐劑。 細胞因子因為其的淋巴細胞刺激特性可以在疫苗方案中應用。用于該 用途的許多細胞因子對于本領域一個普通技術人員來說是已知的，包 括白細胞介素-2 (IL-2), IL-12, GM-CSF以及許多其它的細胞因子。
給藥當給藥時，本發明的治療性組合物以制藥學可接受的制劑給藥。 這種制劑可常規地包括在制藥學可接受的濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、 適合的載體、補充的免疫增強劑例如佐劑和細胞因子以及可選地其它 的治療因子。本發明的這種制劑可以以有效量給藥。通常認為免疫劑 量從1納克/千克到100毫克/千克是有效的，這取決于用藥模式。優選的范圍被認為是在每千克體重500納克到500微克之間。絕對量將 依賴各種因素，包括所選擇用藥的組合物，不論用藥是單獨或多重劑 量，及包括個體病人的參數包括年齡、身體狀況、身材、體重、以及 病程。這些因素對于本領域普通技術人員是充分公知的，并且僅通過 常規實驗就能夠說明。 實施例通過以下實施例對本發明進行說明，這些實施例不能禍:認為是對本發明的范圍加以任何形式的限定。相反，應當清楚地理解為可以訴 諸不同的其它實施方案，修改的實例方案和與其等價的實例方案，這 些本領域技術人員在閱讀過本文說明書后，都可以得出這些方案的啟 示，但是它們仍然落入本發明的范圍。 材料與方法化學藥品八乙烯乙二醇-單-(n-十二烷基)醚(Octaethylene glycol-mono- (n畫dodecyl) ether (OEG, C12E8)),三氟乙酸(TFA),雙十 六烷基二甲基溴化銨(DHAB),來自牛腦的L-A-磷脂酰-L-絲氨酸(PS), 1，2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DPPE), 1,2-二月桂 酰-sn-丙三基-3-磷酸膽堿(DLPC),來自羊毛脂的膽固醇，1-肉豆蔻酰 -sn-丙三基-3-磷酸膽堿(Lyso-PC),棕櫚酰-DL-肉堿氯化物(palmitoyl畫DL-carnitine chloride)和N畫(三甲氨基乙基)氨甲酸膽固 醇酯氯化物(TC-Chol),來自于Fluka或Sigma公司(布希，瑞士)。蛋 黃磷脂酰膽堿(PC)由類脂獲得(Cham公司，瑞士)。 1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷-rac-(l-甘油)鈉鹽(DPPG)), 3卩[N-(N'，N'-二曱氨基乙基)-氨曱酰基]膽固醇氫氯化物(DC-Chol), 1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-磷酸 單鈉鹽(DPPA)和1,2-二棕櫚酰乙烯基乙二醇(DPEG)購自Avanti Polar Lipids 7>司(Alabaster,阿一立巴馬州，美國)。l-棕櫚酰-3-油酰-sn-丙 三基-2-磷脂酰-乙醇胺(PE)從R. Berchtold (生化實驗室，伯爾尼大 學，瑞士)獲得。Bio-baeds SM2和Bio-Gel A-15m來自Bio-Rad Laboratories 7>司(Glattbrugg，瑞士 )。 LissamineTM若丹明Bl,2-雙十 六烷酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺，三乙胺鹽(Rh-DHPE), N-(4,4-二氟 一5,7-二苯基-4-硼雜-3a, 4a-二氮+引達省-3-丙酰)-l,2-雙十六酰-sn-丙 三基畫磷酸乙醇胺(N- (4,4- difluoro-5,7畫diphenyl國4-bora畫3a, 4a-diaza-s國indacene-3-propionyl)國l,2-dihexadecanoyl國sn-glycero-3-phosp hoethanolamine)( Bodipy 530/550-DHPE )來自Molecular Probes Europe 公司(萊頓,荷蘭)。N-[l-(2, 3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-三甲基銨氯化 物(DOTAP)購自Roche Applied Science 7〉司(Rotkreuz，瑞士)。鹽酸 阿霉素從Fluka公司獲得(布希，瑞士)。病毒流感病毒X-31抹和A/Sing (A/Singapore/6/86)抹，從Bema BiotechAG公司(伯爾尼，瑞士)獲得，在雞胚尿嚢腔中培養(Gerhard， J. Exp. Med (實驗醫學雜志).144:985-995, 1976 )。肽HLA-A2.1結合的丙肝病毒(HCV ) HLA結合肽 ((DLMGYIPLV， aa 132-140 )(Cerny等人.，J. Clin. Invest(臨床調查). 95 (2) : 521-30， 1995)，以及HLA-A2.1結合的對照肽和癡疾模擬肽 AMAM-CPE( (1, 3-二棕櫚酰-丙三基-2_磷酸乙醇胺)-蔗糖-GGCYKDEIKKE正RESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLK CG (二硫鍵))(Moreno等人.，Chembiochem(化學生化)2:838-43, 2001) 從BachemAG公司(Bubendorf,瑞士)獲得。小鼠在獨立實驗室對轉HLA-A2.1 (A0201)單鏈組織相容性I類 分子基因的HDD小鼠和H-2Db和鼠(32-微球蛋白都缺失的HDD小鼠 進行兩次免疫實驗(Pascolo等人.，J. Exp. Med (實驗醫學雜志).185 (12) :2043-51, 1997)。小鼠被安置在適宜的動物飼養設備內并按國際 規則進行操作。實施例1
免疫增強的重建的流感病毒體(IRIV)的制備病毒體才艮據先前描述的方法進行制備(Bron等人.，Methods Enzymol (酶學方法). 220:313- 331, 1993; Zurbriggen等人.，Prog Lipid Res (脂質研究進展) 39(1) :3-18, 2000)。簡而言之，將32 mg (41.7 fimol)蛋黃磷脂酰膽堿 (egg PC )和8 mg (11.1 ,1) PE溶解在2 ml的PBS, 100 mM OEG (PBS/OEG)中。流感病毒的4 mg HA以畫，000xg在4°C離心1小時, 并且沉淀物溶解于2ml的PBS/OEG。將被去污劑溶解了的磷脂和病 毒混合并被超聲處理1分鐘。所述混合物在20。C以100,000xg離心1 小時，并且上清液被過濾除菌(0.22 pm )。之后使用180 mg的濕SM2 Bio-Beads在室溫下震蕩1小時，以及每次用90 mg的SM2 Bio- Beads 進行30分鐘，共3次，通過去污劑移除使病毒體形成。脂質的終濃 度為8 mg/ml (10.4 |iimol/ml) PC和2 mg/ml (2.7 pmol/ml) PE。通過B6ttcher (B6ttcher等人.，Anal. Chim. Acta (分析化學學報) 24:202-203, 1961)的磷脂定量和Ball (Ball, Anal. Biochem(分析生物化 學).155:23-27, 1986)的SDS-PAGE與考馬斯抽提方法之后的HA定 量來確定紅細胞凝集素/磷脂的比例。 實施例2含DC-Choi的免疫增強的重建的流感病毒體(DIRIV)的制備: 通過先前描述的方法制備病毒體(Bron等人.，Methods Enzymol (酶 學方法).220:313-331， 1993; Zurbriggen等人.，Prog. Lipid Res (脂質 研究進展).39(1) :3-18, 2000))。簡而言之，將32 mg (41.7 ,l)蛋黃 PC, 8 mg (11.1 pmol) PE和0.3畫5 mg (0.6-10 pmol) DC國Chol溶解在 2 ml的PBS, 100 mM OEG (OEG-PBS)中。流感病毒4 mg的HA以 100，000xg在4。C離心1小時，并且沉淀物溶解于1 ml的PBS/OEG。 將被去污劑溶解了的磷脂和病毒及1ml的20% (w/v)蔗糖混合至終 體積4ml,并被超聲處理1分鐘。所述混合物在20。C以100，000xg離心 1小時，并且上清液被過濾除菌(0.22 (im)。之后使用180 mg的濕 SM2 Bio-Beads在室溫下震蕩1小時，以及每次用90 mg的SM2 Bio-Beads 進行 30 分鐘， 共3次，通過去污劑移除使病毒體形成。脂質的
終濃度為8 mg/ml (10.4 pmol/ml) PC, 2 mg/ml (2.7 |imol/ml) PE和 0.075-1.25 mg/ml (0.12-2.5 pmol/ml) DC-Chol。通過B6ttcher (B6ttcher等人.，Anal. Chim. Acta (分析化學學報) 24:202-203, 1961)的磷脂定量和Ball (Ball, Anal. Biochem (分析生物化 學).155:23-27, 1986)的SDS-PAGE與考馬斯抽提方法之后的HA定 量來確定紅細胞凝集素/磷脂的比例。實施例3AMA49-DIRIV的制備構建帶脂質結合抗原的DIRIV的方法 病毒體的制備，其中，抗原結合至病毒體的表面。為制備PE-模擬IRIV, 將磷酸鹽緩沖液(PBS)中的純化曱型流感病毒/新加坡紅細胞凝集素 (4mg )的溶液以lOOOOOg離心30分鐘，并且沉淀物溶解于含100 mM 八乙烯乙二醇單十二烷基醚(PBS-OEG)的PBS(1.33ml)中。AMA49-PE 共軛物(4mg)，磷脂酰膽堿(32mg, Lipoid公司，路德維希港，德國) 和磷脂酰乙醇胺(6mg)溶解在總體積為2.66ml的PBS-OEG中。磷 脂和紅細胞凝集素溶液纟皮混合并,皮超聲處理1分鐘。之后所述溶液以 100,000g離心1小時，并且上清液在無菌條件下被過濾(0.22 (im)。 之后使用BioRad SM BioBeads (BioRad公司，Glattbrugg,瑞士 )通過 去污劑移除使病毒體形成。DIRIV在冷凍千燥前被等份儲存在-7(TC。 實施例4構建帶靶配體和間隔體(spacer)的DIRIV的方法本實施例描述 Fab'片段和柔韌的間隔臂的定點結合，用于使抗原結合位點能夠結合 靶細胞。為了將Fab'分子放置在可以保持其二價結合能力的位置，通 過定點結合將Fab'片段和柔韌的間隔臂結合。將100 mg含長的聚乙 二醇間隔臂(PEG)的NHS-PEG-MAL溶解在3ml含10 |il三乙苯的 無水甲醇中。之后，將45 mg溶解在4ml氯仿和甲醇(l:3;v/v)中的 二油酰磷脂酰乙醇胺加至溶液中。在有氮的情況下室溫(RT) 3小時 完成反應。降壓以去除曱醇/氯仿，并且產物被重新溶解在氯仿中。用 1%的NaCl抽提溶液以去除未反應的物質和水溶性的副產物。通過如 Martin等人(1982)描述的硅酸色語法純化PE-PEG-MAL,對所述方法進行一些改動硅膠柱具有1.5cm的直徑，并填裝14硅膠(Kieselgel 60， Fluka 60752)。用下列梯度進行洗脫氯仿甲醇29:1, 28:2, 27:3, 26:4(ml)等。收集6ml的流分。在流分13-31中獲得PEG-PEG-MAL。 流分和PE-PEG-MAL的純度以氯仿-甲醇-水65:25:4通過在珪膠上的 薄層層析(TLC )進行分析。將PE-PEG-MAL溶解在含10mg/150 pi八 乙烯乙二醇-單-十二烷基醚(C12E8>々Tris-HCl緩沖液(100mM，pH7.6) 中。以Fab'/PE-PEG-MAL的比為1:10的比例將Fab'片段加入所述溶 液。在氮氣中室溫下將該溶液攪拌2小時。再將d2Es加入以獲得1% -d2Es溶液，并且在4。C攪拌該反應混合物過夜。通過加入400jil洗 過的濕潤的硫代丙基瓊脂糖(Thiopropyl Sepharose) 6B去除未反應的 PE-PEG-MAL。孵育3小時后，通過離心去除凝月交。通過流過0.2pm 的濾器對PE-PEG-Fab'溶液(3.6 ml)除菌并以0.01 M (:12￡8去污劑溶液 儲存。實施例5制備FAB' DIRIV的方法本實施例說明了革巴向特異細胞的結合 病毒體的制備。根據Wadti和Glueck在Int. J. Cancer(國際癌癥雜志) 77: 728-733, 1998中描述的方法從流感病毒A/Singapore/6/86抹中分離 紅細胞凝集素(HA)。將含溶解在0.01M d2Es去污劑溶液中的HA三 聚物(2.5 mg/ml)的上清用于生產病毒體。將氯仿中的磷脂酰膽堿 (38mg)加入到圓底燒瓶中，并通過旋轉蒸發器蒸發氯仿以在玻璃壁 上獲得薄的PC (磷脂酰膽堿)膜。將上清液(4 ml,含10 mg HA) 和實施例3的3.6 ml PE-PEG-Fab'(含4 mg Fab'片段)加入至所述燒 瓶中。在輕柔的搖動下，覆蓋燒瓶玻璃壁的PC膜被含C12E8去污劑 的混合物溶解。通過以無菌Biobeads SM-2進行抽提去除所產生溶液 的去污劑。用REAX2震蕩器(Heidolph公司，科爾海姆，德國)震蕩容 器1小時。為完全去除去污劑，用0.58 mg的Biobeads重復三次，之 后獲得Fab'-病毒體輕微透明的溶液。定量分析顯示1 ml的Fab'-病毒 體含1.3 mg的HA, 5 mg的PC和0.53 mg的Fab'片段。才艮據 Antibodies, A Laboratory Manual (抗體，實驗室手冊)中的描述，通
過在高荷載Superdex 200柱(High Load Superdex 200 colmnn)上凝膠 過濾收集的流分的免疫分析確定Fab'的濃度。生產不含Fab'的病毒體 的步驟與此相同，例外之處在于不加入PE-PEG-Fab'。含DC-Choi ( DIRIV)和帶PE-PEG-Fab'的免疫增強重建流感病毒 體的制備病毒體通過先前描述的方法制備(Bron等人.，Methods Enzymol(酶學方法).220:313-331, 1993; Zurbriggen等人.，Prog. Lipid Res (脂質研究進展).39(1) :3-18, 2000))。簡而言之，將32mg(4L7 pmol)蛋黃PC， 8 mg (11.1 pmol) PE和0.3 - 5 mg (0.6-10 pmol) DC畫Chol 和先前形成的PE-PEG-Fab'溶解在2 ml的PBS, 100 mM OEG (OEG-PBS)中。流感病毒4mg的HA以100，000xg在4。C離心1小時， 并且沉淀物溶解于1 ml的PBS/OEG中。將被去污劑溶解了的磷脂和 病毒及1ml的20% (w/v)蔗糖混合至終體積4ml,并被超聲處理1 分鐘。所述混合物在20。C以100，000xg離心1小時，并且上清液^皮過 濾除菌(0.22 pm)。之后使用180 mg的濕SM2 Bio-Beads在室溫下 震蕩1小時，并每次用90 mg的SM2 Bio- Beads進行30分鐘，共3 次，通過移除去污劑形成病毒體。脂質的終濃度為8 mg/ml (10.4 pmol/ml)PC ， 2 mg/ml (2.7 pmol/ml)PE和0.075-1.25 mg/ml (0.12-2.5 (imol/mi;) DC-Chol。通過B6ttcher (B6ttcher等人.，Anal. Chim. Acta (分析化學學報) 24:202-203, 1961)的磷脂定量和Ball (Ball, Anal. Biochem(分析生物化 學).155:23-27, 1986)的SDS-PAGE與考馬斯抽提方法之后的HA定 量來確定紅細胞凝集素/磷脂的比例。實施例6使DIRIV負載有關藥物組合物如Gabizon等人.，在J. Natl.Cancer Inst (國家癌癥學會).81: 1484-1488, 1989所描述的方法,通 過病毒體捕獲的硫酸銨產生的質子梯度將阿霉素裝入病毒體。為了用硫酸銨裝填病毒體，將硫酸銨溶液(4.17 g/ml)加入到DIRIV溶液(7.5 ml)，超聲處理1分鐘，并用含5%葡萄糖的1升PBS在4。C透析1 小時(Spectra/Por 2.1, Biotech DispoDialyzers, MWCO: 15 '000,
Spectrum Medical Industries公司，休斯頓，德克薩斯州，美國)。24 小時后更換透析緩沖液，病毒體溶液被進一步透析24小時。為制備 阿霉素裝填溶液，將10 mg阿霉素溶解于3 ml水中，并通過0.2pm 濾器除菌，之后加入750 ^的5x濃度的無菌PBS和5%蔗糖。將病毒體溶液和阿霉素裝填溶液加熱至33。C,之后，將2體積的 病毒體溶液與1體積的阿霉素裝填溶液相混合。將混合物在33。C孵育 10小時并在28。C被進一步孵育過夜。通過在用無菌PBS， 5%蔗糖平 衡的High Load Superdex 200柱(Pharmacia，烏普薩拉，瑞典)上進行 凝膠過濾，從病毒體中分離未被灌嚢的阿霉素。含灌嚢的阿霉素的 Fab'-病毒體的空隙體積流分(void volume fractions)以含5%蔗糖的 PBS進行洗脫并收集。實施例7DIRIV的冷凍干燥DIRIV在冷凍干燥前于-70。C被等份儲存。 在薩文特公司AES1010快速真空冷凍干燥系統(Savant AES1010 speedvac)中根據供應商的說明書進行冷凍干燥。干燥后的樣品^皮立 即應用或儲存于-70。C。為重建被冷凍干燥的DIRIV,向干燥后的 DIRIV中加入與冷凍干燥前等量體積的水。重建的空DIRIV在4。C儲 存。實施例8HLA結合肽-DIRIV的制備DIRIV在冷凍干燥前在-70。C被等份 儲存。在薩文特公司AES1010快速真空冷凍干燥系統中根據供應商 的說明書進行冷凍干燥。干燥后的樣品被立即應用或儲存于-70。C。為 重建被冷凍干燥的DIRIV,向干燥后的DIRIV中加入與冷凍千燥前等 體積的溶解于水中的HLA結合肽。重建的HLA結合肽-DIRIV在4°C 儲存。通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)對被灌嚢肽的濃度進行定 量。實施例9DIRIV在冷凍千燥前在-70 °C被等份儲存。在薩文特公司AES1010 快速真空冷凍干燥系統中根據供應商的說明書進行冷凍干燥。干燥后
的樣本被立即應用或儲存于-7(TC。為重建#1冷凍干燥的DIRIV,向 干燥后的DIRIV中加入與冷凍干燥前等體積的溶解于水中的 AMA49-CPE。重建的AMA49-DIRIVs在4。C儲存。通過反相高效液 相色語對被整合的肽的濃度進行定量。 實施例10阿霉素-DIRIV (DOXRUBICINE -DIRIV)的制備DIRIV在冷 凍干燥前在-70。C被等份儲存。在薩文特公司AES1010快速真空冷凍 干燥系統中根據供應商的說明書進行冷凍干燥。干燥后的樣本被立即 應用或儲存于-7(TC。為制備阿霉素裝載溶液，將10 mg的阿霉素溶 解在3ml的水中并通過0.2卞m濾器過濾除菌。為重建被冷凍千燥的 DIRIV,向干燥后的DIRIV中加入與冷凍干燥前等體積的阿霉素。重 建的阿霉素-DIRIV在4"C儲存。實施例11被整合的阿霉素的定量被灌嚢藥物的量，在這里是阿霉素，由 在480nm的吸收定量。DIRIV制劑含平均150嗎/ml的阿霉素。由相 關光量子光語學(PCS)與庫爾特N4Plus亞微米離子大小分析儀 (Coulter N4Plus Sub-Micron-Particle Size Analyzer)(邁阿密，佛羅里 州，美國)確定病毒體的平均直徑。根據Hoekstra等人先前在 Biochemistry (生物化學)23: 5675-5681， 1984中描述的，通過基于十 八烷基若丹明(R18)熒光脫猝滅作用(dequenching)來檢測病毒體 的病毒融合基因活性的適當表達。 實施例12含有其它脂質的免疫增強的重建的流感病毒體的制備根據實施 例3的描述制備病毒體，僅有區別在于DC-Choi由下列物質代替 DHAB、 DOTAP、 PS、膽固醇、DPPE、 DLPC 、溶血磷脂酰膽石威 (Lyso-PC)、棕櫚酰-DL-肉堿、DPEG或TC-Chol。脂質的終濃度各 自為8 mg/ml (10.4 nmol/ml) PC, 2 mg/ml (2.7 jimol/ml) PE和0.125 mg/ml (0.22 ,ol/ml) DHAB,或0.125 mg/ml (0.18拜ol/ml) DOTAP， 或2-8 mg/ml (2.8-11.3 jimol/ml) PS,或0.125 mg/ml(0.32 (imol/ml)膽
固醇，或0.125 mg/ml (0.18 nmol/ml) DPPE，或0.125 mg/ml (0.19 jimol/ml) DLPC,或0.125 mg/ml (0.27 jimol/ml) Lyso畫PC,或0.125 mg/ml (0.29 (imol/ml)棕櫚酰-DL-肉堿，或0.135 mg/ml (0.25 pmol/ml) DPEG,或0.125 mg/ml (0.23 ,1/ml) TC-Chol。修飾的IRIV在冷凍干燥前在-7(TC被等份儲存。在薩文特公司 AES1010快速真空冷凍干燥系統中根據供應商的說明書進行冷凍干 燥。干燥后的樣品被立即應用或儲存于-7(TC。為重建被冷凍干燥的病 毒體，向干燥后的病毒體中加入與冷凍千燥前等量體積的水或在水中 的HLA結合肽PBS。重建的病毒體在4。C儲存。實施例13HLA結合肽的定量在Agilent 1100 Series (Agilent Technologies 公司，瑞士)上使用CC 125/4.6 Nucleosil 100-5 C8反相柱 (Macherey-Nagel公司，瑞士 )通過HPLC ( RP-HPLC )進行肽定量。 使用以下的洗脫劑緩沖液A, 10mMTEAP水溶液；緩沖液B, 100 %乙腈。HPLC程序流量1.3 ml/min;緩沖液和柱溫度25。C;緩沖 液啟動濃度25%B; 0-7分鐘將緩沖液B增至38。/。； 7-12.4務鐘 將緩沖液B增至100。/。； 12.4-16.4分鐘緩沖液B100。/。。為定量被灌 嚢的肽，將病毒體流分(5-30 pi )裝到新鮮制備的、PBS平衡的1ml的 Sephadex G50粗凝膠-過濾旋轉柱(Coarse gel- filtration spin columns ) 上。在以300xg,離心旋轉柱2分鐘后才收獲到裝有肽的嚢泡，未裝 入的肽纟皮阻留在柱里。 實施例14AMA49-CPE肽的定量在Agilent 1100 Series (Agilent Technologies公司，瑞士)上使用ZORBAX Eclipse XDB-C8反相柱 (Agilent Technologies公司，瑞士 )通過HPLC (RP-HPLC )進行肽 定量。^使用以下的洗脫劑緩沖液A, 0.P/。TFA水溶液；緩沖液B， 0.1Q/oTFA甲醇溶液。HPLC程序流量1.0 ml/min;緩沖液和柱溫度 60°C;緩沖液啟動濃度60。/。B; 0-15分鐘將緩沖液B增至100。/o; 15-20分鐘緩沖液B 100%。為定量被灌嚢的肽，將病毒體的流分(5-30pl)裝到新鮮制備的、PBS平衡的lml的SephadexG50粗凝膠-過濾 旋轉柱中。在以300xg,離心旋轉柱2分鐘后才收獲到裝有肽的嚢泡， 未裝入的肽被阻留在柱里。 實施例15FRET分析為通過熒光共振能量轉移(FRET)進行體外的融合 測定(Struck等人.,Biochemistry (生物化學)20 (14) :4093-99, 1981; Loyter等人.，Methods Biochem. Anal (生物化學分析方法).33:129-64, 1988 ),進行下列的分析將0.75mo1。/。的Bodipy 530/550-DHPE和 0.25 mol%的N-Rh-DHPE摻入由PC/DPPG(70:30)組成的脂質體中。 在4。C和42。C之間的離散溫度下，在5mM磷酸鈉緩沖液pH 7.5， 100 mM NaCl中，以2.5 ml PMMA微比色管(micro-cuvettes) (VWR公司， 瑞士)中的0.8ml終體積在持續攪拌下進行熒光測定。通常，lpl標記 的脂質體(0.3 nmol磷脂)與5-20 ^的病毒體(0.1-0.4 nmol的磷脂) 混合，并且通過加入3.75-7 pi的1 MHC1引發融合，最終pH為4.5。 在538 nm和558 nm的激發和發射波長下，激發狹縫為2.5 nm及發 射狹縫為15.0 nm，每5秒分別記錄一次焚光增量。用配有恒溫比色 架禾口》茲力4覺才半裝置的LS 55發光分光計(Luminescence spectrometer) (Perkin Elmer Instruments公司，美國)進行測量。在無限探針稀釋 (infinite probe dilution)下，加入Triton X國100 (0.5% v/v終濃度)后達 到最大熒光度。為校正熒光度的等級，脂質體的初始殘留的熒光度被 設置為零，并且在無限探針稀釋下的熒光度設為100%。 實施例16使用Zetasizer 1000HS儀器(Malvem Instruments公司，英國)在2 ml的PMMA比色皿(Sarstedt AG公司，瑞士)中通過光散射測定微粒大 小。5-20 的病毒體或脂質體分別被稀釋于過濾后(0.22 )的PBS 中，根據廠商的說明書在25。C和633nm測量3次每次300秒。實施例17含DC-Choi的脂質體(DC-脂質體)的制備將32 mg (41.7 pmol) PC， 8 mg (11.1 ,ol) PE和0.8-5 mg (1.6-10 ,ol) DC-Chol溶解于4 ml
的PBS, 100 mM OEG, 5%(w/v)蔗糖(OEG-PBS)中，之后混合并超 聲處理1分鐘。該混合物被過濾除菌(0.22 nm )，并且之后4吏用180 mg 的濕SM2 Bio-Beads在室溫下震蕩1小時，并每次用90 mg的SM2 Bio-Beads 進行30分鐘，共3次，通過去污劑移除使脂質體形成。脂質 的終濃度為8mg/ml PC (10.4 |imol/ml)， 2 mg/ml PE (2.7 (imol/ml)和0.2 -1.25 mg/ml DC-Chol(0.4-2.5 |imol/ml)。脂質體在冷凍干燥前被等份儲 存在-70。C。在薩文特公司AES1010快速真空冷凍干燥系統中根據供 應商的說明書進行冷凍干燥。干燥后的樣品被立即應用或儲存于-70 °C。為重建冷凍干燥的DC-脂質體，向干燥后的DC-Choi中加入水或 HLA結合肽水溶液。重建的HLA結合肽-DC-脂質體在4。C儲存。 實施例18脂質體的制備將78 mg (101.6 pmol)的PC(溶解于甲醇)和32.68 mg (43.56 ,l)的DPPG (溶解于甲醇/氯仿(1:1))(摩爾比70:30) 混合，通過使用旋轉蒸發器(Rotavapor R-205, Buchi Labortechnik公 司，瑞士)在4(TC和30-10kPa的漸進真空下去除溶劑。干燥后的脂質 膜用1.5ml5"/o(w/v)蔗糖水溶液被重新水合。脂質體在冷凍干燥前被 等份儲存在-70。C。在薩文特公司AES1010快速真空冷凍干燥系統中 根據供應商的說明書進行冷凍干燥。干燥后的樣品被立即應用或儲存 于-70。C。為重建被冷凍干燥的脂質體，向干燥后的脂質體中加入PBS 或HLA結合肽PBS溶液。重建的HLA結合肽-脂質體在4。C儲存。實施例19含DC-Chol的脂質體(DC-脂質體)的制備將66.8-75.2 mg (87.1-98pmol) PC(溶解在甲醇中)和32.68 mg (43.56 pmol) DPPG(溶解 在甲醇/氯仿(l:l))以及1.82-7.26 mg (3.6-14.5 pmol)DC-Chol (溶解在 曱醇中)(摩爾比60-67.5:30:2.5-10) 一起混合，并且通過使用旋轉蒸 發器(Rotavapor R-205, Buchi Labortechnik公司，瑞士 )在40。C和 30-10kPa的漸進真空下去除溶劑。干燥后的脂質膜用1.5 ml 5% (w/v) 蔗糖水溶液被重新水合。脂質體在冷凍干燥前被等份儲存在-7(TC。在 薩文特公司AES1010快速真空冷凍干燥系統中根據供應商的說明書
進行冷凍干燥。干燥后的樣品被立即應用或儲存于-70。C。為重建被冷 凍干燥的DC-脂質體，向干燥后的DC-脂質體中加入PBS或HCV HLA 結合肽PBS溶液。重建的HLA結合肽DC-脂質體在4。C儲存。 實施例20免疫和細胞毒性實驗在HLA-2.1轉基因小鼠尾基部用100 (J 的相應病毒體制劑皮下(sc.)免疫小鼠。小鼠以3周的間隔接受2次 注射，并且在最后一次注射2周后對應答進行分析。取自免疫小鼠的 脾細胞(4xl0V孔)和2xl()6被照射的(1500rad)的脾細胞在37。C和 2%C02下，在24-孔組織培養板，完全RPMI培養基(Sigma Aldrich公 司，圣路易斯，密蘇里州)中被重激活5天，所述被照射的脾細胞已與 10pg/ml肽進行脈沖，所述完全RPMI培養基含2mML-谷酰胺，100U 青霉素，100 jxg/ml鏈霉素(Sigma Aldrich公司)，5 mM鞋乙基哌溱 乙磺酸(Hepes), 10%胎牛血清(FCS ) (Gibco BRL公司，巴塞爾， 瑞士)和5xl(T5 M巰基乙醇。在第2天，加入5U/ml的白細胞介素-2 (IL-2) (EuroCetusB.V.公司，阿姆斯特丹，荷蘭)。在以EL-4S3:Rob HHD為耙細胞的標準的51Cr釋放分析中檢測特異性細胞溶解活性， 所述靶細胞已與10嗎/ml所選擇的肽或培養基對照一起脈沖。4小時 孵育后，通過使用Y計數器測量"Cr的釋放。分別對只含培養基的孔 或用1MHC1裂解后的孔進行自發和最大釋;^文的測量。裂解由下列公 式計算(在檢測中的釋放-自發釋放)/ (最大釋放-自發釋放)x100。 才艮據肽存在或肽不存在時獲得的裂解百分比來測定肽特異性的裂解。 自發裂解經常低于最大裂解的15%。 實施例21抗AMA49-CPE的酶聯免疫吸附實驗ELISA: ELISA微孔板 (PolySorb, Nunc, VWR International AG公司，瑞士 )與100 jiL /孔的 10 |ig/ml AMA49-CPE的PBS溶液一起在4。C孵育過夜。在被5%奶粉 的PBS溶液在37°C阻斷2小時之前，每孔用含0.05%吐溫-20的PBS 以300 pl/孔洗三次。用含0.05%吐溫-20的PBS以300 pl/孔將孔清洗 三次。之后將板與兩倍連續稀釋的含0.05%吐溫-20和5%奶粉(100 pl
/孔)的小鼠血清PBS溶液在37。C一起孵育2小時。清洗后，板與結 合了堿性磷酸酶的羊抗鼠IgG (Y-鏈特異性)抗體(Sigma公司，圣 路易斯，密蘇里州，美國)在37。C一起孵育1小時，之后清洗三次。 加入磷酸酶底物(存在于0.14% (w/v) Na2C03, 0.3% (w/v) NaHC03, 0.02% (w/v) MgCl2, pH 9.6中的1 mg/ml磷酸對硝基苯酯(Sigma公 司))并在室溫避光孵育。經適當時間后，通過加入100[iL/孔1M硫 酸終止反應。用微孔板讀板器(Spectra MAX plus, Molecular Devices, Bucher Biotech AG公司，瑞士 )在405nm記錄反應產物的光密度 (OD)。實施例22含DC-Chol的流感疫苗制劑的制備根據先前描述的方法(Bron 等人.，Methods Enzymol(酶學方法).220:313-331， 1993; Zurbriggen等 人.，Prog. Lipid Res (脂質研究進展) 39(1) :3-18, 2000 )制備三批流 感病毒體。簡而言之，將32 mg (41.7 jamol)蛋黃PC和0.3 - 5 mg (0.6-10 (imol) DC-Choi溶解在2 ml的PBS， 100 mM OEG (OEG-PBS)中。流感 病毒4 mg的HA (第1批A/New Caledonia/20/99 (H1N1);第2批 A/Fujian/411/2002(H3N2)，第3批B/Shanghai/361/2002)以100,000xg 在4。C離心1小時，并且沉淀物溶解于lml的PBS/OEG中。將被去 污劑溶解了的磷脂和病毒及1ml的20%( w/v )蔗糖混合至終體積4ml, 并被超聲處理1分鐘。所述混合物在20。C以100，000xg離心1小時， 并且上清液被過濾除菌(0.22 pm)。之后使用180 mg的濕SM2 Bio-Beads在室溫下震蕩1小時，并每次用90 mg的SM2 Bio- Beads 進行30分鐘，共3次，通過去污劑移除形成3批不同的病毒體。脂 質的纟冬濃度為8 mg/ml (10.4 pmol/ml) PC, 2 mg/ml (2.7 (xmol/ml) PE 和0.075-1.25 mg/ml (0.12-2.5 jimol/ml) DC畫Chol。在HA定量后，三個批次被混合并被冷凍干燥。在薩文特公司 AES1010快速真空冷凍干燥系統中根據供應商的說明書進行冷凍干 燥。干燥后的樣品被立即應用或儲存于-70。C。為重建被冷凍干燥的流 感疫苗制劑，向干燥后的DIRIV中加入與冷凍干燥前等量體積的水。 重建的空DIRIV在4。C儲存。
權利要求
1.一種生物活性組合物，所述組合物包括至少一種免疫增強的重建的流感病毒體(IRIV)和用于所述病毒體高效冷凍干燥和重建的陽離子膽固醇衍生物。
2. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述用于病毒體的 高效冷凍干燥和重建的陽離子膽固醇衍生物存在于病毒體的膜中。
3. 根據權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述膽固醇衍 生物在膽固醇的3-位置上具有陽性荷電的取代基，并且由下式表示<formula>formula see original document page 2</formula>(工)其中R選自R'; R'- (C=0)-; R'-O- (OO)-; R'畫NH- (OO)畫；R'-O- (OO) 國R"- (CO) -; R'- NH-(00)-R"-(C=0)-，其中R'為被至少一個陽性荷電基團取代的d-CV烷基，優選地是通 式R1R2R3N+-的含N基團，并且各自的反離子是X-;其中112和R3相互獨立地選自氫和d-CV烷基；其中X選自卣素、硫酸氫根、磺酸根、磷酸二氫根、醋酸根、三卣 醋酸根和碳酸氫根；以及其中R"是d-CV亞烴基。
4.根據權利要求3所述的組合物，其特征在于，所述膽固醇衍生物 由下式表示<formula>formula see original document page 3</formula>(II)其中，RhR2和R3相互獨立地選自氫和d-C6-烷基，并且其中X—是鹵素陰離子。
5. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，R4和R2是甲基，以及R3是氫。
6. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，&、 R2和R3是甲基。
7. 根據權利要求2-6中任一權利要求所述的組合物，其特征在于， 所述陽離子脂質的含量在膜總脂含量的1.9和37moP/。之間。
8. 根據權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述陽離子脂質的 含量在膜總脂含量的1.9和16mol。/。之間。
9. 根據權利要求7或8所述的組合物，其特征在于，所述病毒體膜 的其余脂含量由磷脂組成。
10. 根據權利要求9所述的組合物，其特征在于，所述磷脂是磷脂 酰膽堿和磷脂酰乙醇胺。
11. 根據權利要求IO所述的組合物，其特征在于，磷脂酰膽堿和磷 脂酰乙醇胺以3: l至5: 1,優選以4: 1的比例存在。
12. —種冷凍干燥組合物，所述組合物包括權利要求1到11中任一 所述的生物活性組合物，和另外的冷凍干燥保護劑。
13. 根據權利要求12所述的組合物，其特征在于，所述冷凍干燥保 護劑選自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、甘露糖、木糖和甘露醇。
14. 根據權利要求13所述的組合物，其特征在于，在冷凍干燥前， 所述冷凍干燥保護劑在溶液中以0.1到5% (W/V)的比例存在。
15. 根據權利要求12-14中任一權利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包括佐劑，或佐劑系統。
16. 根據權利要求1-11或12-15中任一權利要求所述的組合物，其 特征在于，所述組合物還包括選自藥物因子或抗原分子的生物活性物質。
17. 根據權利要求16所述的組合物，其特征在于，所述生物活性物 質或連接在病毒體的表面，和/或被包入病毒體之中。
18. —種應用權利要求12-15中任一權利要求所述的組合物用于病毒 體冷凍干燥的方法，所述方法包括下列步驟(a) 冷凍所述組合物，(b) 以第一降低的壓力初級干燥所述冷凍組合物，并且(c) 以第二降低的壓力二級干燥所述冷凍組合物，其中在高于所述第二降低的壓力的壓力下，進行所述初級干燥。
19. 一種應用權利要求16或17所述的組合物用于病毒體冷凍干燥 的方法，所述方法包括下列步驟(a) 冷凍所述組合物，所述組合物包括選自藥物因子和抗原分子的 所述生物活性物質，(b) 以第一降低的壓力初級干燥所述冷凍組合物，并且(c) 以第二降低的壓力二級干燥所述冷凍組合物，其中在高于所述第二降低的壓力的壓力下，進行所述初級干燥。
20. —種通過權利要求18所述方法獲得的病毒體凍干劑。
21. —種通過權利要求19所述方法獲得的病毒體凍干劑。
22. —種用于重建權利要求20所述的病毒體凍干劑的方法，所述方 法包括將病毒體凍干劑溶解于重建溶劑中的步驟。
23. 根據權利要求22所述的方法，其特征在于，所述重建溶劑包括 選自藥物因子和抗原分子的所述生物活性物質。
24. —種用于重建權利要求21所述的病毒體凍干劑的方法，所述方 法包括將病毒體凍干劑溶解于重建溶劑中的步驟。
25. 權利要求1到17中任一權利要求所述的組合物在生產用于將其 接種受試對象的藥物中的應用。
26. 根據權利要求25所述的應用，其特征在于所述受試對象是人。
27. —種試劑盒，所述試劑盒包括含有權利要求20所述凍干劑的容器。
28. 根據權利要求27所述的試劑盒，所述試劑盒進一步包括含重建 溶劑和選自藥物因子和抗原分子的所述生物活性物質的第二容器。
29. —種試劑盒，所述試劑盒包括含權利要求21所述凍干劑的容器。
30. 根據權利要求29所述的試劑盒，所述試劑盒進一步包括含重建 溶劑的第二容器。
31. 陽離子膽固醇衍生物在促進冷凍干燥后的病毒體可重建性中的 應用，所述病毒體包括，在其^C重建狀態，選自藥物因子或抗原分子的 生物活性物質。
32. 根據權利要求31所述的應用，其特征在于，所述膽固醇衍生物 在膽固醇的3-位置上具有陽性荷電的取代基，并且由下式表示<formula>formula see original document page 5</formula>(I)其中R選自R'; R'- (C=0)-; R'-O- (C=0)-; R'-NH畫(C=0)-; R'國O- (OO) 隱R"畫(C=0) -; R'- NH-(C=0)-R"-(C=0)-，其中R'為被至少一個陽性荷電基團取代的d-C6-烷基，優選地是通 式1^112113#-的含]^基團，并且各自的反離子是X-; 其中R1; R2和R3相互獨立地選自氫和C廣CV烷基； 其中x-選自由卣素、硫酸氫根、磺酸根、磷酸二氫根、醋酸根、三 囟醋酸根和碳酸氫根；以及 其中R"是d-CV亞烴基。
33.根據權利要求32所述的應用，其特征在于，所述膽固醇衍生物 由下式表示<formula>formula see original document page 6</formula> (I工)其中，R!，R2和R3相互獨立地選自氫和C廣C6-烷基，并且其中x—是鹵素陰離子。
34. 根據權利要求33所述的應用，其特征在于，R4和R2是甲基，以及R3是氫。
35. 根據權利要求33所述的應用，其特征在于，Rp R2和R3是甲基。
36. 根據權利要求31-35所述的應用，其特征在于，病毒體膜中的所 述陽離子脂質的含量在膜總脂含量的1.9和37moP/。之間。
37. 根據權利要求36所述的應用，其特征在于，病毒體膜中的所述 陽離子脂質的含量在膜總脂含量的1.9和16moP/。之間。
38. 根據權利要求36或37所述的應用，其特征在于，所述病毒體 膜的其余脂含量由磷脂組成。
39. 根據權利要求38所述的應用，其特征在于，所述磷脂是磷脂酰 膽堿和磷脂酰乙醇胺。
40. 根據權利要求39所述的組合物，其特征在于，所述磷脂酰膽堿 和磷脂酰乙醇胺以3: l到5: 1,優選以七1的比例存在。
41.根據權利要求32-40中任一權利要求所述的應用，其特征在于, 所述應用還包括佐劑，或佐劑系統。 '
全文摘要
本發明涉及用于病毒體的高效冷凍干燥和重建的組合物和方法。
文檔編號A61K9/127GK101119707SQ200580048279
公開日2008年2月6日 申請日期2005年12月21日 優先權日2004年12月30日
發明者西爾維婭·拉西, 里納爾多·楚爾布里根, 馬里奧·阿馬克 申請人:佩維恩生物技術有限公司