專利名稱：人細胞纖連蛋白凍干粉制劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及藥物制劑領域，具體而言，本發明涉及一種人細胞纖連蛋白的凍干粉制劑。更具體地說，本發明涉及一種人細胞纖連蛋白和/或其片斷為活性成分，與可藥用輔料配制成的凍干粉制劑。本發明還涉及制備這種人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的方法。
背景技術：
人細胞纖連蛋白(Human Cellular Fibronectin)是人體細胞外基質的主要成分之一，為高分子量糖蛋白，由二聚體或多聚體組成，主要為微纖維和無定型的結構，廣泛分布于細胞表面、基膜、疏松結締組織和血管平滑肌周圍。人細胞纖連蛋白具有粘附能力，維持細胞的正常結構及生理，維護胞壁的完整性、通透性及組織修復有重要作用，并參與細胞運動，對細胞有趨化性，促進細胞分裂，因此，在胚胎生長發育、腫瘤的發生和轉移以及創傷的修復等病理生理過程中具有重要作用。
通過細胞工程技術，進行人工細胞培養，經過提取、純化可以制備人細胞纖連蛋白。在這一制備過程中通常獲得人細胞纖連蛋白的濃縮液，進一步開展理論研究和應用研究。
人細胞纖連蛋白作為一種活性蛋白在常溫下是不穩定的，特別是在含水的介質中更容易變性或降解，使其生物活性喪失。在目前的研究中，將人細胞纖連蛋白制成濃縮液，放在4℃低溫環境中，其活性只能保持2周左右。因此，人細胞纖連蛋白水溶液不能長期保存，更無法制成水溶液劑供臨床使用。然而，在許多場合人細胞纖連蛋白只有在溶液狀態下才適合于研究和應用，特別是臨床應用，更需要以水溶液的劑型給藥。為此，我們將濃縮液進一步制成凍干粉劑，并以凍干粉劑型在低溫下長期保存，臨用之前再配制成水溶液。這樣就能在維持其生物活性的同時，延長人細胞纖連蛋白的保存期。通過研究，我們達到了這一目標，制備出可以長期保存的凍干粉劑。
發明目的本發明的目的是提供了一種人細胞纖連蛋白凍干粉制劑；本發明的另一目的是提供了一種制備人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的方法；本發明的另一目的是提供了一種人細胞纖連蛋白凍干粉制劑，不僅可以作為人細胞纖連蛋白的原料進行存貯、運輸以及進一步制備成外用或口服制劑的應用；而且可以直接作為注射劑使用。
發明內容
本發明人進行了大量的研究，篩選出人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的配方和制備工藝，不僅滿足了穩定性好、能長期貯藏、使用方便，并顯示出良好的生物活性。由此，完成了本發明。
本發明的人細胞纖連蛋白的凍干粉制劑，含有作為活性成分的人細胞纖連蛋白和/或片斷與可藥用輔料制成，其中，人細胞纖連蛋白和/或片斷在凍干粉制劑中的重量百分比可以是0.1～50％，優選0.5～30％，更優選1～15％，其在制劑中的含量范圍是0.1～10mg，優選0.2～2mg；可藥用輔料可以是選自氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、磷酸、鹽酸或氫氧化鈉中的一種或多種，可藥用輔料在凍干粉制劑中的含量可以是制劑重量的50～99.9％，優選70～99.5％，更優選85～99％。
本發明的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑可以通過下列步驟制備a.配制輔料溶液用注射用水溶解占制劑重量50～99.9％的可藥用輔料配制成輔料溶液。
b.配制藥物溶液取占制劑重量的0.1～50％的人細胞纖連蛋白和/或片斷，用上述輔料溶液定容到一定的體積。
c.除菌將藥物溶液用除菌濾器過濾除菌。
d.灌裝將除菌的藥物溶液無菌灌裝到西林瓶中一定的體積。
e.凍干在低溫真空下進行冷凍干燥，抽真空，加塞，扎蓋，即得人細胞纖連蛋白凍干粉制劑。
本發明的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的制備方法，其配制輔料溶液所用的可藥用輔料可以選自氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、磷酸、鹽酸或氫氧化鈉中的一種或多種。
本發明的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的制備方法，其制成的凍干粉制劑再溶解后的水溶液具有的pH值范圍是6～8，并且具有注射劑適宜的滲透壓。
本發明的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑為其理論和應用的研究提供了一種穩定性好、能長期保存、使用方便的新劑型。本發明的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑不僅可以作為人細胞纖連蛋白的原料進行存貯、運輸以及進一步制備成外用或口服制劑應用于臨床；而且可以直接作為注射劑使用，用于治療各種纖連蛋白缺失癥，如彌漫性血管內凝(DIC)，大手術后，嚴重創傷，燒傷或伴重癥感染，休克等疾病。
具體實施例方式
以制備每瓶含量為1mg的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑為例，說明本發明的具體過程和步驟。制備人細胞纖連蛋白凍干粉制劑使用的物料在凍干粉制劑中的重量范圍是人細胞纖連蛋白1.0mg氯化鈉2.0～10.0mg磷酸二氫鉀2.0～10.0mg氫氧化鈉 適量配制輔料溶液取注射用水適量，溶解2～10g的磷酸二氫鉀，再用0.1mol/L的氫氧化鈉調pH值至6～8，加入并溶解2～10g的氯化鈉，用注射用水稀釋到一定體積，使磷酸鹽的含量為0.05M，氯化鈉的含量為0.1M。
配制藥物溶液取含量為1000mg的人細胞纖連蛋白和/或片斷的濃縮液，用上述輔料溶液稀釋至1000ml，制成1mg/ml的藥物溶液。
除菌將配制的藥物溶液以無菌操作法進行微孔濾膜濾器除菌，使用0.22μm微孔濾膜，在壓力0.1Mpa以下正壓濾過。濾前應先進行起泡點試驗，濾后取樣進行半成品質量檢查，應符合規定。
灌裝在潔凈度100級環境中，將合格的除菌藥液罐裝于清洗干凈并滅菌的西林瓶中，每瓶裝量1ml，灌裝1000支，半加膠塞。
凍干將灌裝的西林瓶放在凍干箱內，在-40℃以下預凍2小時，然后升溫至瓶內制品變全白，同時保持一定的真空度，直至凍干結束，最后真空全加塞，軋蓋，包裝，即得到每瓶含量為1mg的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑。
以下實施實例進一步說明本發明。但是，應當理解本發明不以任何方式限于這些實例。
實施例1人細胞纖連蛋白0.1～10.0mg氯化鈉2.0～10.0mg磷酸二氫鉀2.0～10.0mg氫氧化鈉 適量實施例2人細胞纖連蛋白0.1～10.0mg氯化鈉2.0～10.0mg氯化鉀0.1～1.0mg磷酸氫二鈉1.0～10.0mg磷酸二氫鉀0.1～1.0mg實施例3人細胞纖連蛋白0.1～10.0mg氯化鈉2.0～10.0mg磷酸氫二鈉1.0～10.0mg磷酸 適量實施例4人細胞纖連蛋白0.1～10.0mg氯化鈉2.0～10.0mg三羥甲基氨基甲烷 1.0～10.0mg鹽酸 適量實施例5人細胞纖連蛋白0.1～10.0mg氯化鈉2.0～10.0mg磷酸氫二鈉1.0～10.0mg磷酸二氫鈉1.0～10.0mg
試驗7、不同藥物聯合的體外增效作用取2×105個結核桿菌培養24小時后用同濃度(5ug/ml)不同藥物處理24小時，檢測細胞生長抑制率(％)，結果見表5表5 不同藥物聯合的增效作用(抑制率％)
在實驗7中，A氧氟沙星；B卷曲霉素；C牛黃去氧膽酸鈉。結果表明，所用抗結核病藥單獨應用均有明顯的抑菌作用，但聯合應用的效果為好(P＜0.01)。就同樣劑量而言，三種藥物的聯合較兩種的更好。
總之，局部放置及局部注射單一抗結核藥物緩釋劑對結核菌生長均有明顯的抑制作用，兩種或兩種以上藥物的聯合會明顯增效，所表現出的治療作用和增效作用均與其局部獲得的有效藥物濃度有關。因此，本發明所述的緩釋劑的有效成分為兩種或兩種以上藥物的組合。
含有以上有效成分的藥物可制成緩釋微球，進而制成緩釋注射劑和植入劑，其中以與含助懸劑的特殊溶媒組合形成的混懸注射劑為優選。
緩釋注射劑或緩釋植入劑還可通過以下實施方式得以進一步說明。上述實施例及以下實施例只是對本發明作進一步說明，并非對其內容和使用作任何限制。
具體實施方式
實施例1.
將90、90和80mg聚苯丙生(對羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)為20∶80)共聚物分別放入(甲)、(乙)及(丙)三個容器中，然后每個中加100毫升二氯甲烷，溶解混勻后，分別加入10mg氧氟沙星、10mg卷曲霉素、10mg氧氟沙星和10mg卷曲霉素，重新搖勻后用噴霧干燥法制備含10％氧氟沙星、10％卷曲霉素及10％氧氟沙星和10％卷曲霉素的注射用微球。然后將微球懸浮于含15％甘露醇的生理鹽水中，制得相應的混懸型緩釋注射劑。注射劑的黏度為300cp-600cp(20℃-30℃時)。該緩釋注射劑在體外生理鹽水中的釋藥時間為20-30天，在小鼠皮下的釋藥時間為40-50天左右。
實施例2.
加工成緩釋注射劑的方法步驟與實施例1相同，但所不同的是所含抗結核有效成分及其重量百分比為(a)2-50％的氧氟沙星、環丙沙星或司帕沙星與2-50％的卷曲霉素的組合；(b)2-50％的氧氟沙星、環丙沙星或司帕沙星與2-50％的牛黃膽酸鈉或牛黃去氧膽酸鈉<p>實施例17化合物g 10-(3，5-二甲氧基芐基)-10-(3-甲氧基芐基)蒽酮的合成在氮氣保護下，將1mmol 10-(3，5-二甲氧基芐基蒽酮(式(5)化合物)和1.0mmol 3-甲氧基芐基氯(通式(2)化合物)加入一個25ml的三口燒瓶中，并加入微量的18冠6(25mg，0.09mmol)，碘化鉀(50mg，0.30mmol)，氫氧化鉀(137mg，2mmol，82％)，丙酮(干燥)(8ml，0.11mol)，65℃攪拌1.5小時，冷卻至室溫(20℃)，常壓過濾，并用二氯甲烷洗掉吸附在生成鹽(如氯化鉀)上的有機物，將濾液旋干，柱色譜分析，得到10-(3，5-二甲氧基芐基)-10-(3-甲氧基芐基)蒽酮。
實施例18化合物g 10-(3，5-二甲氧基芐基)-10-(3-甲氧基芐基)蒽酮的合成在氮氣保護下，將1mmol 10-(3，5-二甲氧基芐基蒽酮(式(5)化合物)和1.2mmol 3-甲氧基芐基氯(通式(2)化合物)加入一個25ml的三口燒瓶中，并加入微量的18冠6(25mg，0.09mmol)，碘化鉀(50mg，0.30mmol)，氫氧化鉀(137mg，2mmol，82％)，丙酮(干燥)(8ml，0.11mol)，70℃攪拌1小時，冷卻至室溫(20℃)，常壓過濾，并用二氯甲烷洗掉吸附在生成鹽(如氯化鉀)上的有機物，將濾液旋干，柱色譜分析，得到10-(3，5-二甲氧基芐基)-10-(3-甲氧基芐基)蒽酮(式(6)化合物)。
表4
實驗結果，試驗組和對照組動物注射部位的肌肉均未出現紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應，表明人細胞纖連蛋白凍干粉制劑作為注射劑使用時無刺激性。
實驗4熱源檢查依照中國藥典2005年版的熱源檢查法進行檢查，結果表明人細胞纖連蛋白凍干粉制劑所含熱源的限度符合規定。
實驗5異常毒性檢查依照中國藥典2005年版的異常毒性檢查法進行檢查，結果表明人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的異常毒性檢查符合規定。
實驗6人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的外用劑制備配制外用劑的基質溶液取注射用水配制pH 6～8、磷酸鹽含量為0.05mol/L、氯化鈉含量為0.1mol/L的溶液，滅菌，分裝血清瓶中備用。
使用時將外用劑的基質溶液2ml注入含量為1mg的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑小瓶中，輕輕振搖使溶解，即得到濃度為0.5mg/ml的溶液劑。依據臨床需要將上述溶液的一定量噴霧或滴涂到使用部位。該溶液可一次性用完，也可在低溫下冷藏一個月內使用。
權利要求
1.一種人細胞纖連蛋白的凍干粉制劑，其含有作為活性成分的人細胞纖連蛋白和/或片斷與可藥用輔料制成，其中，人細胞纖連蛋白和/或片斷在凍干粉制劑中的重量百分比可以是0.1～50％，其在制劑中的含量范圍是0.1～10mg；可藥用輔料可以是選自氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、磷酸、鹽酸或氫氧化鈉中的一種或多種，可藥用輔料在凍干粉制劑中的含量可以是制劑重量的50～99.9％。
2.根據權利要求1的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑，其中，人細胞纖連蛋白和/或片斷在凍干粉制劑中的重量百分比可以是0.5～30％，可藥用輔料在凍干粉制劑中的含量可以是制劑重量的70～99.5％。
3.根據權利要求2的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑，其中，人細胞纖連蛋白和/或片斷在凍干粉制劑中的重量百分比可以是1～15％，可藥用輔料在凍干粉制劑中的含量可以是制劑重量的85～99％。
4.根據權利要求1～3之一的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑，其中，人細胞纖連蛋白和/或片斷在凍干粉制劑中的含量范圍是0.2～2mg。
5.一種制備權力要求1～4之一的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的方法，包括下列步驟a.配制輔料溶液用注射用水溶解占制劑重量50～99.9％的可藥用輔料配制成輔料溶液。b.配制藥物溶液取占制劑重量的0.1～50％的人細胞纖連蛋白和/或片斷，用上述輔料溶液定容到一定的體積。c.除菌將藥物溶液用除菌濾器過濾除菌。d.灌裝將除菌的藥物溶液無菌灌裝到西林瓶中一定的體積。e.凍干在低溫真空下進行冷凍干燥，抽真空，加塞，扎蓋，即得人細胞纖連蛋白凍干粉制劑。
6.根據權利要求5的方法，其中，配制輔料溶液所用的可藥用輔料可以選自氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、磷酸、鹽酸或氫氧化鈉中的一種或多種。
7.根據權利要求5和6的方法，其中，人細胞纖連蛋白凍干粉制劑再溶解后的水溶液具有的pH值范圍是6～8。
8.根據權利要求5～7的方法，其中，人細胞纖連蛋白凍干粉制劑再溶解后的水溶液具有注射劑適宜的滲透壓。
全文摘要
本發明涉及一種人細胞纖連蛋白凍干粉制劑，其含有作為活性成分的人細胞纖連蛋白和/或片斷與可藥用的輔料制成。本發明還涉及制備這種人細胞纖連蛋白凍干粉制劑的方法。本發明的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑為其理論和應用的研究提供了一種穩定性好、能長期保存、使用方便的新劑型。本發明的人細胞纖連蛋白凍干粉制劑不僅可以作為人細胞纖連蛋白的原料進行存貯、運輸以及進一步制備成外用或口服制劑應用于臨床；而且可以直接作為注射劑使用，用于治療各種纖連蛋白缺失癥等疾病。
文檔編號A61P17/00GK1857720SQ20061001752
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月16日 優先權日2006年3月16日
發明者張怡, 于 玲, 陳小蘭, 金城, 張若飛 申請人:張怡