專利名稱：人sDR5蛋白作為乙型病毒性肝炎治療藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及人sDR5(可溶性死亡受體5，soluble DR5，簡稱sDR5)蛋白的用途，尤其涉及人sDR5蛋白作為乙型病毒性肝炎特別是急性重癥乙型病毒性肝炎治療藥物的應用。
背景技術：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病，特別是在中國最為常見，發病率高，且呈持續高流行態勢，其不僅直接影響人群的健康，甚至還危及人的生命安全，嚴重影響了人們的生產、生活、工作和學習，所造成的直接和間接的經濟損失難以估量。
在我國法定報告的傳染病中，多年來乙型病毒性肝炎的發病數和發病率一直高居前列，2005年國家將乙型病毒性肝炎列為四大重點防治的傳染病。2006年2月13日衛生部發布了“十一五”全國乙型病毒性肝炎防治規劃，該規劃分析了乙型病毒性肝炎在我國的流行現狀1992-1995年全國病毒性肝炎血清流行病學調查顯示，我國人群乙肝病毒感染率為57.6％，乙肝病毒攜帶率為9.75％，據此推算全國有6.9億人曾感染過乙肝病毒，其中1.2億人長期攜帶乙肝病毒。據專家估計，目前全國慢性乙肝病患者約有2,000萬人，每年有約35萬人死于慢性乙肝相關疾病。
乙型病毒性肝炎給病人、家庭、社會造成沉重的經濟負擔，給社會經濟發展帶來不容忽視的影響，是許多家庭因病致貧、因病返貧的重要原因，同時也引發出一系列社會問題，是我國現階段最為突出的公共衛生問題之一。
乙型病毒性肝炎的臨床表現多樣化，以重癥型肝炎和慢性肝炎最為突出。重癥型乙型肝炎包括急性重癥性肝炎(暴發性肝炎)、亞急性重癥性肝炎(亞急性肝壞死)和慢性重癥性肝炎，極易發展成壞死性肝硬化，預后極差，病死率高達60-70％以上。
乙型病毒性肝炎與普通肝炎不同，普通肝炎的種類很多，包括藥物或化學毒物引起的藥物性肝炎或中毒性肝炎；酗酒引起的酒精性肝炎；其他全身性疾病及傳染病引起的肝功能異常；自身免疫性肝炎。由于普通肝炎臨床表現與乙型病毒性肝炎極為相似，生活和治療中常與乙型病毒性肝炎混淆，但他們的發病機制迥然不同，因此，兩者的治療措施也明顯有別。
乙型病毒性肝炎的發病是乙型肝炎病毒與機體之間相互作用的結果。乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒，可選擇性地感染肝細胞，誘發肝炎。乙型肝炎病毒的量、毒力和侵入途徑與發病有一定關系。小量乙型肝炎病毒往往只引起隱性感染，而大量病毒則可導致嚴重的病變。肝炎的病變程度和類型與機體的免疫狀態也有密切關系。
乙型病毒性肝炎的肝損傷及發病機制簡述如下(1)肝細胞損傷的機制乙型肝炎病毒侵入機體后進入肝細胞內復制繁殖，然后以“發芽”形式從肝細胞釋出入血。在肝細胞表面則留下病毒抗原成分，此時并不引起明顯的肝細胞損傷。病毒入血后，刺激機體免疫系統產生細胞免疫和體液免疫。前者通過殺傷性T細胞及NK細胞等的直接作用和抗體依賴性的細胞毒作用，后者通過產生各種特異性抗體，均能對血中病毒進行反應并加以殺滅。但同時也能對受病毒感染的肝細胞(膜上含病毒抗原成分)進行攻擊，使肝細胞受到破壞發生壞死。一般認為，T細胞介導的細胞免疫反應致靶細胞殺傷及誘導凋亡是病毒感染后引起肝細胞損傷的主要因素。
(2)乙型病毒性肝炎的發病機制上述肝細胞免疫損傷機制可以導致不同類型的乙型病毒性肝炎①T細胞功能正常，感染病毒量多，毒力強時受感染及免疫損傷的肝細胞多而重，表現為急性重型肝炎；②T細胞功能正常，病毒量較少，毒力較弱則發生急性普通型肝炎；③T細胞功能正常，病毒量甚少，毒力很弱則表現為輕型或亞臨床型肝炎；④T細胞功能不足，免疫反應僅能清除部分病毒和損傷部分受感染的肝細胞，未清除的病毒可繼續繁殖并感染，反復發生部分肝細胞損傷，結果表現為慢性肝炎；⑤機體免疫功能缺陷，T細胞呈免疫耐受狀態，此時病毒與宿主共生。病毒在肝細胞內持續復制，感染的肝細胞也不受免疫損傷，此時則表現為無癥狀的病毒攜帶者。
乙型病毒性肝炎的治療主要包括抗病毒復制常用藥干擾素(Interferons，IFN)、無環鳥苷(Acyclovir，ACV，國產阿普洛韋)、阿糖腺苷(Ara-A)及單磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)、聚肌胞(PolyI:C)、提高機體免疫功能常用藥胸腺肽、白細胞介素2(IL-2)、保護肝細胞及促進肝細胞再生常用藥益肝靈、強力寧、齊墩果酸片等措施。但是，這些治療措施應用后，雖可抑制HBV復制，但停藥后這種抑制作用消失，使原被抑制的指標又恢復到原水平，其原因在于藥物沒能抑制HBV的超螺旋共價閉合環型DNA(ccc DNA)，故停藥后cccDNA重新成為病毒復制中轉錄的模板，使病毒又得以復制。治療中有些藥物作用較慢，需較長時間才能看到效果。有些藥物還伴隨著畏寒、發熱、頭痛、全身酸痛、乏力、白細胞減少、血小板減少等副作用。因此，開發治療效果好、特異性強、作用快、副作用少的乙型病毒性肝炎治療藥物迫在眉睫。
近來有報道死亡受體5(Death receptor，DR5)為腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的特異性、高親和力受體之一，與TRAIL結合后可有效激活胞內信號轉導途徑，誘導細胞發生凋亡反應。DR5主要分布于外周血淋巴細胞和骨骼肌細胞，與TRAIL結合后通過接頭分子FADD/MOTRl傳遞信息，并依賴于caspase家族的級聯反應誘導細胞凋亡。全長的DR5含有411個氨基酸，屬I型跨膜糖蛋白。可溶性死亡受體5(soluble DR5，sDR5)為DR5不含跨膜區域的可溶性形式，因缺乏跨膜區域不能在細胞膜上表達而被分泌至細胞外。sDR5在正常人外周血中有低水平表達。因其具有與TRAIL配體相結合的胞外段完整結構，可與膜型死亡受體競爭性結合TRAIL分子，從而阻斷TRAIL誘導的細胞凋亡反應。
小鼠體內的DR5與人類的DR5高度同源(79％)。
人sDR5蛋白在2000年首先由Song等利用基因工程的方法表達純化出來，并將其應用于自身免疫性關節炎的研究，發現攜載TRAIL基因的重組腺病毒(TRAIL-Ad)可減輕小鼠的實驗性關節炎，用人sDR5蛋白阻斷TRAIL則會加重關節炎的癥狀[參見SongK，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmune inflammation and cell cycle progression.JExp Med，2000；191(7)1095-1104.]。2002年6月，Zhang等以腺病毒載體介導的TRAIL基因轉染BALB/c小鼠，TRAIL在肝細胞內的過度表達可以誘導大量肝細胞的死亡，若給予腺病毒sDR5(AdsDR5)能夠有效減弱TRAIL誘導的肝細胞死亡效應[參見Zhang HG，Xie J，Xu L，et al.Hepatic DR5 induces apoptosis and limits adenovirus genetherapy product expression in the liver.J Virol，2002；76(11)5692-5700.]。同年11月，Mundt等發現HBV相關的急性肝衰竭的病人肝組織中過度表達DR5，以腺病毒Ad-LacZ誘導小鼠建立非特異性肝炎模型，結果發現腺病毒誘導的肝炎小鼠肝組織DR5的表達上調[參見Mundt B，Kuhnel F，Zender L，et al.Involvement of TRAIL andits receptors in viral hepatitis.FASEB J，2003；17(1)94-96.]。
在上述報道的諸項對sDR5的研究中，只是對sDR5參與自身免疫性關節炎和腺病毒介導的非特異性肝炎的情況進行了研究，雖然在腺病毒介導的小鼠肝炎研究中是利用AdsDR5基因中和TRAIL的作用，但僅只限于非特異性肝炎，腺病毒介導的非特異性肝炎與HBV介導的肝臟特異性乙型病毒性肝炎的發病機制及治療方案均有所不同，上述報道未見有人sDR5蛋白對HBV介導的肝臟特異性乙型病毒性肝炎作用的提示。
急性重癥性乙型肝炎(暴發性肝炎)的發生與肝細胞的過度凋亡密切相關，針對凋亡發生的信號傳導通路，利用sDR5與膜型DR5競爭結合TRAIL，使TRAIL不能啟動凋亡的發生，可減輕肝細胞損傷程度從而改善病人的預后。
經權威機構檢索查新，利用人sDR5蛋白作為乙型病毒性肝炎治療藥物，通過阻斷或封閉TRAIL的作用來降低肝細胞凋亡，減輕肝細胞損傷的研究，目前國內外尚未見報道。
發明內容本發明的目的在于提供人sDR5蛋白的新用途，即人sDR5作為乙型病毒性肝炎特別是急性重癥乙型病毒性肝炎保肝治療藥物的應用。
本發明涉及的人sDR5蛋白作為乙型病毒性肝炎治療藥物的應用。
其中所述人sDR5蛋白優選作為急性重癥乙型病毒性肝炎治療藥物的應用。
在上述的應用中減輕肝細胞損傷的人sDR5蛋白用量是2-64mg/kg。
其中明顯減輕肝細胞損傷的人sDR5蛋白用量是4-32mg/kg，最佳用量是16mg/kg。
本發明涉及的人sDR5蛋白在制備阻斷乙型病毒性肝炎肝細胞凋亡藥物中的應用。
其中所述人sDR5蛋白優選在制備阻斷急性重癥乙型病毒性肝炎肝細胞凋亡藥物中的應用。
在上述的應用中阻斷肝細胞凋亡的人sDR5蛋白用量是2-64mg/kg。
其中明顯阻斷肝細胞凋亡的人sDR5蛋白用量是4-32mg/kg，最佳用量是16mg/kg。
上述人sDR5蛋白通過阻斷或封閉TRAIL的作用來降低肝細胞凋亡，減輕肝細胞損傷，以達到抗炎保肝作用。
本發明的人sDR5蛋白的新用途為通過降低乙型病毒性肝炎的肝細胞凋亡、減輕肝細胞損傷，改善預后，又提供了一條應用前景誘人的治療急性重癥乙型病毒性肝炎的途徑，為新型藥物的開發提供了依據。
為了更好地理解本發明的實質及本發明所述人sDR5蛋白的作用效果，下面以人sDR5蛋白的動物實驗及結果，來進一步闡述其在阻斷肝細胞凋亡，減輕肝細胞損傷方面的作用。
人sDR5蛋白的制備常規方法活化含pGAPZαA-sDR5和空載體pGAPZαA的畢赤酵母菌株，并大量擴增含sDR5的畢赤酵母菌株GS115菌株(參見Song K，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmuneinflammation and cell cycle progression.J Exp Med，2000；191(7)1095-1104)，收集培養上清，利用ProBondTM親和層析柱純化重組sDR5蛋白。獲得純化的重組人sDR5蛋白，SDS-PAGE(見附圖1)、Western Blot(見附圖2)檢測純化產物的純度；Folin-酚比色法測定純化后人sDR5蛋白的濃度(見附圖3)；用MTT法檢測純化的人sDR5蛋白對TRAIL誘導人宮頸癌細胞系HeLa細胞凋亡作用的阻斷效應(見附圖4)。
轉化陽性的畢赤酵母GS115菌株可成功表達分子量大小為26kD的sDR5蛋白，純化后的sDR5蛋白經鑒定，結果顯示獲得了高純度的重組人sDR5蛋白，蛋白產量達20μg/ml；經體外活性檢測，結果顯示純化的人sDR5蛋白可部分阻斷TRAIL誘導的HeLa細胞凋亡，阻斷率最高達53.6％。經上述驗證后，純化的人sDR5蛋白-80℃保存，備用。
急性乙型病毒性肝炎小鼠動物模型的制備經QIAGEN質粒大量提取試劑盒純化重組質粒pcDNA3-HBV1.1(參見張秋，孫汶生，高立芬等.TRAIL誘導HBV轉染肝癌細胞BEL-7402凋亡的作用及機制研究.中華微生物學和免疫學雜志，2005；25(5)357-362.)，以生理鹽水調整濃度為20～50μg/ml。
實驗用小鼠為SPF級BALB/c小鼠，4～6周齡，雄性，體重18～22g，由山東大學實驗動物中心提供，飼養條件按照SPF級動物標準執行。
尾靜脈高壓注射先將所述小鼠置于高溫環境，使尾靜脈擴張；注射前用乙醚麻醉，觀察小鼠反射情況；5秒內將1.4～2.0ml重組質粒pcDNA3-HBV1.1液體經尾靜脈勻速注射入小鼠體內，小鼠置于25～28℃環境中觀察。
成功經尾靜脈高壓注射重組質粒pcDNA3-HBV1.1后；經血清谷丙轉氨酶(ALT)(見附圖5)、乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)測定(見附圖6)，實時定量PCR檢測HBV DNA(見附圖7)以及肝臟病理(見附圖8)等實驗，結果顯示尾靜脈高壓注射pcDNA3-HBV1.1后的小鼠血清ALT在8小時達到800u，24小時為350u；HBsAg、HBeAg第1天最高，主要表達HBsAg，可達1.5，以后逐漸下降，7天后消失；血清中檢測到HBV DNA；肝臟組織切片顯示病毒性肝炎病理改變。以上結果證實小鼠急性乙型病毒肝炎動物模型建立成功。
利用細胞生物學和分子生物學的方法，進行如下實驗研究人sDR5蛋白對乙型病毒性肝炎小鼠肝臟損傷的影響。
將人sDR5蛋白溶于生理鹽水中，參考該蛋白在小鼠實驗性關節炎中的使用劑量[參見Song K，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmune inflammationand cell cycle progression.J Exp Med，2000；191(7)1095-1104.]，本發明中設計了1-64mg/kg的系列梯度1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg，分別將人sDR5蛋白在上述動物模型制備之前24小時或模型制備的同時腹腔注射給小鼠，24小時后再重復注射一次，并設立乙型病毒性肝炎模型組及不同劑量的人sDR5蛋白提前治療組、不同劑量的人sDR5蛋白同時治療組、美能治療組[陽性藥物對照組，生產廠家日本米諾發源制藥有限公司(原日本美能發源制藥公司)MinophagenPharmaceutical Co.，Tokyo，Japan；批號90902B]、不同劑量的人sDR5對照組、不同劑量的人白蛋白對照組、空載體對照組、正常BALB/c小鼠對照組(生理鹽水對照組)等一系列實驗及對照組，于不同時間點采血并定期處死小鼠，分別檢測小鼠血清ALT、HBV表面抗原、e抗原及抗體、HBV DNA含量、肝組織HBV核心抗原、TRAIL及DR5的表達、脾臟TRAIL的表達及肝組織損傷情況。
結果顯示模型組的ALT于8小時達到最高(820±138u)，以后逐漸降低，10天后降至正常范圍；人sDR5蛋白提前治療組8小時為452±13.8u，24小時為178±9.2u，4天為151±7.8u，在以上時間點人sDR5蛋白治療組ALT顯著低于模型組，10天后即降至正常范圍；美能治療組8小時為389±15.2u，24小時為137±11.6u，4天為142±14.5u，在以上時間點美能治療組ALT顯著低于模型組，10天后即降至正常范圍，美能治療組在以上時間點ALT略低于人sDR5蛋白治療組，但兩組之間無顯著性差異，實驗中僅給藥兩次，在第二次給藥后第4天時仍可顯著降低ALT的水平，但第7天、10天時由于藥物在體內衰減導致ALT的變化趨勢與模型組相同；人sDR5蛋白同時治療組8小時測定ALT結果與模型組無顯著性差異(800±129u)，24小時明顯下降(345±58u)；人白蛋白對照組變化趨勢與模型組相同，而人sDR5蛋白對照組、空載體對照組、生理鹽水對照組與正常小鼠無顯著差異(見附圖9)。肝臟組織切片HE染色也顯示人sDR5蛋白治療組，特別是人sDR5蛋白提前治療組，可明顯減輕急性肝炎模型中肝細胞的損傷及炎癥反應模型組表現為肝組織彌漫性淋巴細胞浸潤，部分有中性粒細胞浸潤，肝細胞呈氣球樣變，部分細胞有壞死表現；人sDR5蛋白提前治療組和美能治療組僅見部分肝細胞呈嗜酸性變，無明顯肝組織炎性改變，兩組之間無顯著性差異(見附圖10)。但人sDR5蛋白對HBV抗原、抗體的表達及HBV DNA含量并無影響。通過免疫組化及流式細胞術檢測，顯示人sDR5蛋白治療組肝臟、脾臟TRAIL的表達低于模型組，而肝臟DR5的表達在治療組與模型組無顯著性差異。通過TUNEL染色，經流式細胞儀檢測顯示人sDR5蛋白提前治療組肝細胞的凋亡率顯著低于模型組(見附圖11)。本實驗選擇了1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)的人sDR5蛋白作為實驗劑量，實驗結果說明人sDR5蛋白經過兩次腹腔注射，在2-64mg/kg的實驗量時，尤其是4-64mg/kg的量時，人sDR5蛋白可阻斷TRAIL引起的肝細胞凋亡，從而減輕乙型病毒性肝炎中的肝臟損傷。實驗結果顯示，人sDR5蛋白在16-64mg/kg時可顯著減輕乙型病毒性肝炎中的肝臟損傷，但各組之間無顯著性差異，說明人sDR5蛋白的劑量在16-64mg/kg時已達到飽和狀態，再增加人sDR5蛋白的劑量也不會增加其效應，反而可能會由于劑量增加而引起副作用，根據以上實驗結果，4-32mg/kg的人sDR5蛋白的劑量濃度作為治療乙型病毒性肝炎優選的有效劑量較為合適。
由上述實驗及其結果，可以得出如下結論人sDR5蛋白可明顯減輕急性乙型病毒性肝炎小鼠的肝臟炎癥，具體表現在ALT降低，肝臟病理切片無明顯炎癥表現，而且提前注射治療組效果更好。通過機制研究發現，人sDR5蛋白治療組肝細胞凋亡率明顯低于模型組，并且免疫組化和流式細胞術結果顯示治療組肝組織和脾臟中TRAIL的表達較模型組減少。美能作為目前公認的乙型病毒性肝炎的最佳保肝藥物，人sDR5蛋白的治療效果與美能相比無顯著性差異。這一結果表明TRAIL誘導的肝細胞凋亡在HBV感染后引起的肝細胞損傷過程中起重要作用，人sDR5蛋白可通過封閉或阻斷TRAIL的效應而對肝細胞起保護作用，而且在治療劑量范圍內無任何毒副作用，因此，人sDR5蛋白將在制備治療乙型病毒性肝炎特別是急性重癥乙型病毒性肝炎的藥物中有很大的應用價值，具有極其誘人的開發應用前景。
圖1 各洗脫梯度產物SDS-PAGE電泳圖其中1為低分子量蛋白Marker，2為350mmol/L洗脫液，3為200mmol/L洗脫液，4為100mmol/L洗脫液，5為50mmol/L洗脫液圖2 各洗脫梯度Western Blot顯色結果其中1為50mmol/L洗脫液，2為100mmol/L洗脫液，3為200mmol/L洗脫液，4為350mmol/L洗脫液圖3 Folin-酚比色法繪制標準蛋白濃度曲線圖4 純化的人sDR5蛋白對TRAIL誘導Hela細胞凋亡的阻斷效應圖5 血清谷丙轉氨酶(ALT)測定結果圖6 ELISA檢測HBV抗原(HBsAg、HBeAg)圖7 實時定量PCR檢測HBV DNA含量圖8 肝臟組織切片HE染色觀察病理變化可見肝組織彌漫性淋巴細胞浸潤，部分有中性粒細胞浸潤；肝細胞呈氣球樣變，部分細胞有壞死表現圖9 各組小鼠ALT測定結果其中模型為模型組，白蛋白為16mg/kg白蛋白對照組，sDR5為16mg/kg人sDR5蛋白提前治療組，美能為10mg/kg美能治療組圖10 各組小鼠肝臟病理切片HE染色模型組表現為肝組織彌漫性淋巴細胞浸潤，部分有中性粒細胞浸潤，肝細胞呈氣球樣變，部分細胞有壞死表現；16mg/kg的人sDR5蛋白提前治療組僅見部分肝細胞呈嗜酸性變，無明顯肝組織炎性改變；10mg/kg美能治療組肝組織無明顯炎癥改變。
其中A1為空載體對照組，A2為模型組，A3為16mg/kg 人sDR5蛋白提前治療組，A4為10mg/kg美能治療組圖11 TUNEL染色檢測各組小鼠肝細胞的凋亡水平其中A1、A2為模型組，B1、B2為16mg/kg人sDR5蛋白提前治療組，C1、C2為正常BALB/c小鼠對照組具體實施方式
實施例1人sDR5蛋白的純化常規方法活化含pGAPZαA-sDR5和空載體pGAPZαA的畢赤酵母菌株，并大量擴增含sDR5的畢赤酵母菌株GS115菌株(參見Song K，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmuneinflammation and cell cycle progression.J Exp Med，2000；191(7)1095-1104)，分別取pGAPZαA-sDR5和空載體pGAPZαA轉化陽性的酵母菌，培養24小時，取上清3L，經Beckman離心機低溫高速離心(4℃，8000rpm，15min)后，上清經中空纖維超濾器(超濾膜截流量為3kDa)超濾濃縮20倍。
ProBondTM親和層析柱經20mmol/L Na3PO4，500mmol/L NaCl(pH 7.2～7.6)結合緩沖液平衡后，將已與7倍體積結合緩沖液混合的上述樣品過柱，清洗緩沖液(pH 6.0)洗柱去除未結合的雜蛋白成分，最后分別以50mmol/L，100mmol/L，200mmol/L，350mmol/L含咪唑的洗脫緩沖液梯度洗脫，收集各洗脫產物。
純化后人sDR5蛋白的濃度為4mg/ml，3L酵母菌培養上清共可獲得目的蛋白60mg，該酵母菌蛋白產量約為20μg/ml。
實施例2制備乙型病毒性肝炎小鼠動物模型，采用細胞生物學和分子生物學的方法，進行如下實驗研究人sDR5蛋白對乙型病毒性肝炎小鼠肝臟損傷的影響。
(1)分別設立正常BALB/c小鼠對照組(生理鹽水對照組)、七個劑量的人白蛋白對照組、七個劑量的人sDR5蛋白對照組、空載體對照組、乙型病毒性肝炎模型組、模型建立前24小時應用美能的治療組、模型建立前24小時應用七個劑量的人sDR5蛋白治療組、模型建立的同時應用七個劑量的人sDR5蛋白治療組，參考sDR5在小鼠實驗性關節炎中的使用劑量[參見Song K，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmuneinflammation and cell cycle progression.J Exp Med，2000；191(7)1095-1104.]，實驗設計了1-64mg/kg的系列梯度1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg。
每組小鼠數為15只，實驗均重復三次，具體實驗方法及結果詳見下列敘述。
正常BALB/c小鼠對照組是尾靜脈高壓注射生理鹽水1.4～2.0ml；人白蛋白對照組是腹腔注射人白蛋白1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)，24小時后重復一次；人sDR5蛋白對照組是腹腔注射人sDR5蛋白1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)，24小時后重復一次；空載體對照組是尾靜脈高壓注射20～50μg/ml的空載體質粒DNApcDNA3 1.4～2.0ml；乙型病毒性肝炎模型組是尾靜脈高壓注射20～50μg/ml的重組質粒DNA pcDNA3-HBV1.1 1.4～2.0ml；模型建立前24小時應用美能的治療組是首先腹腔注射美能10mg/kg[生產廠家日本米諾發源制藥有限公司(原日本美能發源制藥公司)Minophagen Pharmaceutical Co.，Tokyo，Japan；批號90902B]，24小時后重復注射相應劑量的美能并同時經尾靜脈高壓注射重組質粒DNA pcDNA3-HBV1.1；模型建立前24小時應用人sDR5蛋白七個劑量的治療組是首先分別腹腔注射人sDR5蛋白1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)，24小時后重復注射相應劑量的人sDR5蛋白并同時經尾靜脈高壓注射重組質粒DNApcDNA3-HBV1.1；模型建立的同時應用人sDR5蛋白七個劑量的治療組是首先分別腹腔注射人sDR5蛋白1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)，并同時經尾靜脈高壓注射重組質粒DNA pcDNA3-HBV1.1，24小時后再重復注射一次人sDR5蛋白。
在本發明中，對比實驗選用美能作為人sDR5蛋白的陽性對照治療藥物。美能是復方甘草甜素的商品名(英文名StrongerNeo-MinophagenC，SNMC)，美能是由甘草甜素一胺、半胱氨酸和甘氨酸等組成的復合物，具有抗炎、調節免疫、保護肝細胞膜、類固醇樣作用和抑制病毒增殖、滅活病毒的作用，可明顯降低轉氨酶，保護肝細胞，并無明顯毒副作用。美能是最先由日本于1948年開發的以甘草酸(甘草甜素)為主要成分的靜脈和口服制劑。由于SNMC具有抗變態反應、抗炎作用，當時主要用在皮膚科領域治療多種過敏性皮膚疾患。1958年，日本醫生山本夫將SNMC嘗試性地用于慢性肝炎患者的治療，結果肝功能指標BSP(溴磺酞)值得到了明顯改善(當時尚無轉氨酶測定)。此后，SNMC在日本作為肝病用藥受到重視，人們對其作了大量的基礎和臨床研究。1977年，日本肝病專家鈴木宏教授采用嚴格的隨機雙盲對照法驗證了SNMC對慢性肝炎的療效，證實SNMC能夠有效降低ALT、AST和γ-GTP。隨后于1986年，日野邦彥又從肝病理組織學上驗證了SNMC治療慢性肝炎的確切療效。2002年，熊田博光又報道了長期應用SNMC對500多例慢性丙型肝炎治療的遠期療效結果，發現用藥15年后SNMC可使慢性丙型肝炎的肝癌發生率減少50％以上。由于SNMC的療效得到肝病理學的驗證支持，而且有長達22年的遠期療效研究，可以說SNMC是所有保肝藥中療效最肯定、研究最深入的一種，在國內外作為慢性肝炎的有效藥物在臨床上已應用多年，取得良好療效。目前，美能在臨床上正作為乙型病毒性肝炎的最佳肝保護劑廣泛應用。美能的最大臨床用量是2mg/kg，靜脈注射，在本發明的預實驗中設立了1-20mg/kg的系列梯度，綜合評價發現最佳作用劑量為10mg/kg，經腹腔注射給藥。
(2)經內眥靜脈竇取血分別于模型建立的第1、4、7、10天將小鼠用乙醚麻醉，使用1ml注射器由內眥靜脈竇取血0.2～0.5ml，常規離心，分離血清，-20℃保存，用于各項指標的檢測。
(3)處死小鼠分別于模型建立的第1、4、7、10天將小鼠摘眼球取血、頸椎脫臼處死。分別取上述各組小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟及胸腺，-80℃保存，備用。
(4)血清谷丙轉氨酶(ALT)測定利用丙氨酸氨基轉移酶試劑盒(ALT/GPT，賴氏法，濰坊3V生物工程有限公司)建立標準曲線并進行樣品測定。樣品OD值超過標準曲線范圍則將樣品稀釋后再進行測定。
ALT檢測結果顯示模型組的ALT于8小時達到最高(820±138u)，以后逐漸降低，10天后降至正常范圍；模型建立前24小時應用人sDR5蛋白的治療組，人sDR5蛋白在1mg/kg時對ALT無明顯影響，人sDR5蛋白在2mg/kg時ALT水平略有降低，但與模型組相比無顯著性差異，人sDR5蛋白在4-64mg/kg時可顯著降低ALT的水平，并且隨著人sDR5蛋白實驗劑量增加，ALT水平有降低趨勢，但在16-64mg/kg的量時各組之間ALT水平無顯著性差異，提示人sDR5蛋白在16-64mg/kg的量時已達到飽和狀態，再增加人sDR5蛋白的作用劑量也不會提高其降低ALT的效應，因此，人sDR5蛋白在16mg/kg附近的量時應為最佳作用劑量，ALT 8小時為452±13.8u，24小時為178±9.2u，4天為151±7.8u，在以上時間點人sDR5蛋白治療組ALT顯著低于模型組，10天后即降至正常范圍；美能治療組8小時為389±15.2u，24小時為137±11.6u，4天為142±14.5u，在以上時間點美能治療組ALT顯著低于模型組，10天后即降至正常范圍，美能治療組在以上時間點ALT略低于人sDR5蛋白治療組，但兩組之間無顯著性差異，實驗中僅給藥兩次，在第二次給藥后第4天時仍可顯著降低ALT的水平，但第7天、10天時由于藥物在體內衰減導致ALT的變化趨勢與模型組相同；模型建立的同時應用人sDR5蛋白的治療組8小時測定ALT結果與模型組相比無顯著性差異(800±129u)，24小時明顯下降(345±58u)；人白蛋白對照組變化趨勢與模型組相同，說明人sDR5蛋白的作用是特異性的；空載體對照組、生理鹽水對照組與正常小鼠無顯著差異。各組小鼠ALT測定結果見圖9。
(5)肝臟HE染色觀察病理變化各組小鼠肝臟組織進行冰凍切片，常規HE染色，顯微鏡下觀察模型組可見肝組織彌漫性淋巴細胞浸潤，部分有中性粒細胞浸潤，肝細胞呈氣球樣變，部分細胞有壞死表現；人sDR5蛋白提前治療組在1mg/kg時對肝臟炎癥反應無明顯影響，人sDR5蛋白在2mg/kg時，肝臟炎癥反應與肝細胞損傷有所減輕，但與模型組相比無顯著性差異，人sDR5蛋白在4-64mg/kg時肝組織中炎性細胞浸潤及肝細胞損傷程度顯著減輕，人sDR5蛋白在16mg/kg的治療劑量時達最佳作用效果，表現為肝組織無明顯炎性改變，僅見部分肝細胞呈嗜酸性變，人sDR5蛋白在16-64mg/kg時各組之間肝組織病理變化無顯著性差異，該結果也提示人sDR5蛋白在16-64mg/kg的作用劑量時達到飽和狀態，使用64mg/kg以上的人sDR5蛋白不會達到更好的抗炎保肝作用，反而可能會引起對肝臟或全身的毒副作用，但在本實驗所用實驗劑量范圍內未見明顯的副作用；美能治療組未見明顯的炎癥反應，與人sDR5蛋白提前治療組相比無顯著性差異；而人sDR5蛋白同時治療組與模型組相比無明顯差異。各組小鼠病理切片結果見圖10。
(6)ELISA檢測HBV抗原、抗體表達水平利用HBsAg、HBeAg及相應抗體的ELISA試劑盒進行檢測，嚴格按照說明書操作，以酶標儀于450nm處測OD值。
ELISA結果顯示模型組小鼠血清HBsAg、HBeAg第1天最高，HBsAg可達1.5；以后逐漸下降，7天后消失，HBsAb的表達7天后測定陽性。模型組和人sDR5蛋白治療組小鼠血清HBV抗原、抗體的表達水平無顯著差異。
(7)肝臟免疫組化檢測HBV核心抗原、TRAIL表達情況上述各組小鼠肝臟組織常規進行冰凍切片，分別利用HBcAg及TRAIL的一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗進行染色，底物為OPD，陽性染色為棕黃色。
免疫組化結果顯示模型組第1-4天HBcAg陽性的細胞約(8±1)％，之后逐漸消失；模型組TRAIL染色陽性的細胞明顯多于對照組和人sDR5蛋白治療組。
(8)實時定量PCR檢測HBV DNA含量模型組及實驗組小鼠血清標本，利用乙型肝炎病毒(HBV)熒光定量PCR試劑盒(上海申友生物技術有限責任公司)檢測HBV DNA。
首先標本裂解(直接裂解法)取20μl裂解緩沖液加入0.5ml離心管后，再分別加入20μl血清標本、陰性對照、臨界對照、陽性對照，混勻。沸水浴10分鐘，14000rpm離心10分鐘，取上清2μl做PCR反應。
設定如下程序
55℃時收集熒光信號，以BIO-RAD iCycler檢測熒光(美國伯樂公司)。每次試驗均做標準曲線，將曲線相關系數控制在0.99以上。
實時定量PCR檢測結果顯示模型組小鼠于第1天HBV DNA的拷貝數高達2.67×105，第4天明顯下降至3.85×103，顯著高于HBV轉基因小鼠復制水平(P＜0.05)。模型組和治療組HBV DNA的復制水平無顯著差異。
(9)流式細胞術檢測脾細胞TRAIL和肝細胞DR5的表達水平上述各組小鼠肝臟和脾臟分別置于含10％小牛血清的RPMI-1640培養液中，利用200目銅網研磨，并以400目銅網過濾，計數1×106個細胞，以PBS洗兩次，分別采用間接標記法檢測肝細胞表面DR5的表達及脾臟細胞表面TRAIL的表達。
流式細胞術檢測結果顯示各組小鼠肝臟組織細胞DR5蛋白的表達無顯著性差異，而脾細胞表面TRAIL的表達在模型組(12.1％)明顯高于其他各組(1.8-5.5％)。
(10)TUNEL熒光染色原位檢測肝組織細胞凋亡情況，流式細胞術檢測肝細胞凋亡率利用TUNEL標記試劑盒，分別將各組小鼠肝組織石蠟包埋切片和新鮮肝細胞進行TUNEL染色，熒光顯微鏡觀察肝組織細胞凋亡情況，流式細胞儀測定肝細胞凋亡率。
凋亡檢測結果顯示人sDR5蛋白提前治療組在1mg/kg時對肝細胞凋亡無影響，人sDR5蛋白在2mg/kg時可降低肝細胞凋亡率，但與模型組相比無顯著性差異，人sDR5蛋白在4-64mg/kg時可顯著降低肝細胞凋亡，并且隨著人sDR5蛋白的劑量增加，肝細胞凋亡減輕，但人sDR5蛋白在16-64mg/kg時各組之間肝細胞凋亡率無顯著性差異，說明人sDR5蛋白在16-64mg/kg時達到飽和狀態，再增加作用劑量也不會增強人sDR5蛋白降低肝細胞凋亡的效果，因此，16mg/kg的治療劑量應為最佳作用劑量；模型組肝細胞的凋亡率為15.5±2.8％；16mg/kg人sDR5蛋白提前治療組為4.5±2.3％；正常對照組為1.2±0.6％。
TUNEL染色檢測各組小鼠肝細胞凋亡的結果見圖11。
(11)實驗數據統計學處理上述實驗數據以平均值±標準誤差表示，經t檢驗P＜0.05表示有明顯差異。
通過上述實驗及其結果，可以得出如下結論人sDR5蛋白用量在2-64mg/kg時，可減輕急性乙型病毒性肝炎小鼠的肝臟炎癥，人sDR5蛋白用量在4-64mg/kg時，特別是在16mg/kg用量時，可明顯減輕急性乙型病毒性肝炎小鼠的肝臟炎癥。具體表現在ALT水平降低，肝臟病理切片炎癥反應和肝細胞損傷減輕，肝細胞凋亡降低。而且提前注射治療組效果更好。人sDR5蛋白在有效劑量范圍內提前治療可顯著改善乙型病毒性肝炎小鼠的肝臟損傷和炎癥反應，其治療效果與最佳作用劑量的美能無顯著性差異，而且人sDR5蛋白在治療劑量范圍內未發現任何毒副作用。
通過機制研究發現，人sDR5蛋白治療組肝細胞凋亡率明顯低于模型組，并且免疫組化和流式細胞術結果顯示治療組肝組織和脾臟中TRAIL的表達較模型組減少，這一結果表明TRAIL誘導的肝細胞凋亡在HBV感染后引起的肝細胞損傷過程中起重要作用，人sDR5蛋白可通過封閉或阻斷TRAIL的效應而對肝細胞起保護作用，且在治療劑量范圍內無任何毒副作用。根據以上結果進行綜合評定，人sDR5蛋白在2-64mg/kg時，特別是4-64mg/kg時具有明顯的保肝作用，但在16-64mg/kg時保肝作用無顯著性差異，提示人sDR5蛋白在16-64mg/kg的量時已達到飽和狀態，再增加人sDR5蛋白的作用劑量也不會提高其保肝效應，因此選擇4-32mg/kg的人sDR5蛋白作為治療乙型病毒性肝炎的有效保護劑量較為經濟，其中，16mg/kg的人sDR5蛋白濃度量應為治療乙型病毒性肝炎的最佳劑量。通過與陽性對照藥物美能對比發現，人sDR5蛋白在治療劑量范圍內可顯著減輕肝臟損傷和炎癥反應，在16mg/kg時的保肝作用與最佳治療劑量的美能無顯著性差異。然而，美能作為目前公認的為數不多的安全、有效、最有價值的保肝藥物仍可引起如休克、過敏樣癥狀，增大藥量或長期連續使用，可出現重度低血鉀癥、增加低血鉀癥發生率，血壓上升、鈉及液體貯留、浮腫、體重增加等假性醛固酮增多癥狀等毒副作用，而人sDR5蛋白在本發明中所用的實驗劑量范圍內未發現任何毒副作用。并且美能是進口藥物，價格昂貴(20ml:40mg/支，市場零售價27元左右，慢性肝病建議用量40-60ml/日)，需要每天給藥，這必然會增加乙型病毒性肝炎患者家庭的經濟負擔，并可引起不同程度的并發癥，而人sDR5蛋白作為基因工程產品，生產工藝簡單，價格便宜，無毒副作用，可明顯減輕患者家庭和社會的經濟負擔，解決我國目前存在的嚴重公共衛生問題。
總之，本發明涉及的人sDR5蛋白將在制備治療乙型病毒性肝炎特別是急性重癥乙型病毒性肝炎的藥物中有很大的應用價值，具有極其誘人的開發應用前景。
權利要求
1.人sDR5蛋白作為乙型病毒性肝炎治療藥物的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征是所述人sDR5蛋白作為急性重癥乙型病毒性肝炎治療藥物的應用。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征是減輕肝細胞損傷的人sDR5蛋白用量是2-64mg/kg。
4.如權利要求3所述的應用，其特征是明顯減輕肝細胞損傷的人sDR5蛋白用量是4-32mg/kg。
5.人sDR5蛋白在制備阻斷乙型病毒性肝炎肝細胞凋亡藥物中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征是所述人sDR5蛋白在制備阻斷急性重癥乙型病毒性肝炎肝細胞凋亡藥物中的應用。
7.如權利要求5或6所述的應用，其特征是阻斷肝細胞凋亡的人sDR5蛋白用量是2-64mg/kg。
8.如權利要求7所述的應用，其特征是明顯阻斷肝細胞凋亡的人sDR5蛋白用量是4-32mg/kg。
9.如權利要求5或6所述的應用，其特征是所述人sDR5蛋白通過阻斷或封閉TRAIL的作用來降低肝細胞凋亡，減輕肝細胞損傷，以達到抗炎保肝作用。
全文摘要
本發明公開了一種人sDR5蛋白的新用途，尤其公開了人sDR5蛋白作為乙型病毒性肝炎特別是急性重癥乙型病毒性肝炎保肝治療藥物的應用和人sDR5蛋白在制備阻斷乙型病毒性肝炎特別是急性重癥乙型病毒性肝炎肝細胞凋亡藥物中的應用。其中，所述人sDR5蛋白的有效用量是2－64mg/kg，通過阻斷或封閉TRAIL的作用來降低肝細胞凋亡，減輕肝細胞損傷，以達到抗炎保肝作用。本發明的人sDR5蛋白的新用途為通過降低乙肝的肝細胞凋亡、減輕肝細胞損傷，改善預后，又提供了一條應用前景誘人的治療急性重癥乙型病毒性肝炎的途徑，為新型藥物的開發提供了依據。
文檔編號A61P31/00GK1861191SQ20061004467
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月9日 優先權日2006年6月9日
發明者孫汶生, 陳有海, 高立芬, 劉玉剛, 梁曉紅 申請人:山東大學