用于生產白喉毒素的發酵方法

專利名稱：：用于生產白喉毒素的發酵方法用于生產白喉毒素的發酵方法
技術領域：
：本發明涉及白喉抗原尤其是毒素(包括白喉毒素的突變形式，例如CRM197)領域和制備大批這樣的抗原培養物的發酵方法。白喉毒素是白喉才奉桿菌(Co^y"e6a"en'MWczj^Aen'a)產生的蛋白質外毒素。其以單一多肽的形式產生，該多肽易于被剪接，在190、192或193殘基處裂解，結果形成由二硫鍵連接的兩個亞基A片段和B片段(Moskaug等Biol.Chem.264:15709-15713，1989)。A片段為催化活性部分，是依賴NAD的ADP-核糖基轉移酶，其特異性耙向蛋白質合成因子EF-2,藉此使EF-2失活，使細胞中的蛋白質合成停止。在感染期間可自然獲得對細菌毒素例如白喉毒素的免疫力，或可通過注射去毒形式的毒素(類毒素)人工獲得免疫力(Germanier,er，BacterialVaccines,AcademicPress,Orlando,Fl.，1984)。傳統上一直通過化學修飾天然毒素來制備類毒素(Lingood等Brit.J.Exp.Path.44;177，1963)，化學修飾使得天然毒素無毒，同時保留抗原性，保護接種的動物可抵抗后來的天然毒素攻擊。作為選擇，業已闡述了幾種已減毒的突變型白喉毒素(US4709017，US495074t))。CRM197為白喉毒素的無毒形式，但其在免疫上與白喉毒素沒有區別。CRM197由不產毒噬菌體(3197tox感染的白喉棒桿菌產生，而卩197tox是通過對產毒棒狀噬菌體進行亞硝基胍誘突創造的(Uchida等NatureNewBiology(1971)233;8-11)。CRM197蛋白具有與白喉毒素相同的分子量，但其結構基因不同，其中有單義烕基變化。這導致52位的氨基酸從甘氨酸變為谷胺酰胺，使A片段不能結合NAD,因此無毒(Pappenheimer1977,AnnRev,Biochem.46;69-94,RappuoliAppliedandEnvironmentalMicrobiologySept1983p560-564)。白喉類毒素和減毒突變形式CRM197是很多提供抗白喉棒桿菌免疫力的疫苗中的組分。已知幾種聯合疫苗可預防百日咳博德特氏菌(Borafefe〃a;eWw^z》、石皮傷風4炎菌(C7osW^wwfetom')、白喉棒桿菌和任選的乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus)和/或B型流感嗜血桿菌(i7ae淤o//n7wz'"ywe"zae)(例如參見WO93/24148和WO97/00697、WO02/055105)。白喉毒素和包括CRM197在內的突變形式作為安全有效的糖類T細胞依賴性載體也已用于疫苗。目前CRM197用于B型流感嗜血桿菌寡糖CRM197綴合疫苗(HibTitre;LederlePraxisBiologicals、Rochester,N.Y.)。本領域已熟知制備白喉類毒素(DT)的方法。例如，通過從白喉棒桿菌培養物純化毒素，接著通過化學去毒，可生產DT，或可通過純化重組或遺傳上去毒的毒素類似物來制備DT(例如US4，709，017、US5，843，711、US5,601,827和US5,917,017闡述的CRM197或其它突變體)。白喉棒桿菌在有氧條件下培養。Rappuoli等(BiotechnologyFebruary1985，pl61-163)建議，通過充入空氣和氧氣的混合物，將p02調節到25%，空氣和氧氣可自動調節以維持所需p02。由于蛋白質豐度低，妨礙了用于疫苗的大量白喉毒素例如CRM197的生產。這一問題先前通過將更多拷貝的編碼白喉毒素或突變形式的基因引入白喉棒桿菌業已得到解決(US4，925，792;US5,614,382)。這樣的方法導致產率增加至約3倍。為了可高水平生產這些有價值的抗原，以可再現的方式進一步改進白喉毒素產率的方法將是有益的。因此，本申請提供改進的發酵方法，其包括在發酵罐中的培養基里培養白喉棒桿菌菌抹的發酵步驟，其在足以維持均質培養物的攪動和限量通氣以便培養物中的p02在發酵步驟的大部分時間內降低到低于4%的條件下進行。在有氧但限量通氣條件下進行發酵，以便在發酵的大部分時間內(即在其中白喉棒桿菌密度相對低而p02水平可以較高的初始期之后)氧氣一進入培養物就被利用。發明人業已發現，與在較高p02時實施的發酵方法相比，在這樣的條件下培養導致白喉毒素或突變體更有效和/或更一致地表達。本發明方法比高水平氧氣下的發酵更旺盛，使得即使在培養基中含有添加的鐵或在使用質量不定的復合原料時，也保持白喉毒素高產率。本發明第二方面提供制備白喉毒素或其突變體制劑的方法，其包括實施本發明發酵方法和從培養物分離白喉毒素或其突變體。盡管本文闡述的是白喉毒素和突變體，但應該想象用本發明方法可分離任何白喉棒桿菌抗原。與保持5%p02或更高例如20%p02比較，〗吏用這樣的方法導致白喉毒素或突變體(例如CRM197)產率更高。本發明第三方面提供通過本發明方法分離的白喉毒素或其突變體。本發明第四方面提供包含本發明白喉毒素或其突變體和藥學可接受栽體的藥物組合物。本發明另一方面提供用于治療的白喉毒素或其突變體，尤其是用于細菌性疾病例如白喉棒桿菌病的預防治療。本發明另一方面提供本發明白喉毒素或其突變體在制備用于治療或預防細菌性疾病尤其是白喉棒桿菌病的藥物中的用途。本發明另一方面提供治療或預防細菌感染尤其是白喉棒桿菌感染的方法，其包括將本發明藥物組合物給予患者。附圖簡述圖1-顯示充氧曲線(oxygenationprofile)和其在測定發酵KLa中應用的圖。A圖表示從氮氣轉換到空氣后的充氧時程。B圖表示ln(100-pO2)對時間所作的圖，其使得可通過測定線,殳的斜率來評估KLa。圖2-白喉棒桿菌發酵方法概述。圖3-表示典型的白喉棒桿菌培養物生長動力學的圖。帶圓標的線表示在不同培養時間后的650nrn處的OD值。帶方塊的線表示培養物的pH。圖4-培養物上清液的SDS-PAGE凝膠。第1道為分子量標記；第2道為l嗎CRM197標準品；第3道為0.5嗎CRM197標準品；第4道為0.25昭CRM197標準品；第5-11道為白喉棒桿菌發酵上清液。A凝膠第5道表示CDT082的上清液，第6-8道表示CDT198的上清液(第6道為22.5小時時取出的上清液；第7道為24小時時取出的上清液；第8道為28小時時取出的上清液)，第9、lO和ll道表示CDT199的上清液(第9道為22小時45分鐘時取出的上清液；第10道為24小時45分鐘時取出的上清液；第11道為隨后微孔過濾和過濾后的上清液)。B凝膠第5道表示CDT082的上清液，第6-9道表示CDT205的上清液(第7道為發酵21小時43分鐘后的上清液；第8道為發酵23小時后的上清液；第9道為發酵24小時后的上清液)，第10-13道表示CDT206的上清液(第10道為發酵22小時10分鐘后的上清液；第11道為發酵23小時49分后的上清液；第12道為發酵24小時30分鐘后的上清液；第13道為微孔過濾和過濾后的上清液)。圖5-表示150升發酵罐在每分鐘23升的通氣條件下不同攪動速度的KLa。發明詳述在各種情況下，對于本文術語"包含"、"包括"，本發明者意欲可任選分別被術語"由…組成"來代替。本發明一方面為發酵方法，其包括在發酵罐中的培養基里培養白喉棒桿菌菌抹的發酵步驟，其在足以維持均質培養的攪動(例如足以產生小于30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1秒的混合時間)和限量通氣以便培養物中的p02在發酵步驟的大部分時間內降低到低于5%、4°/。、3%、1%或0.5°/。的條件下進行。在優選實施方案中，p02降低到接近零，優選在發酵步驟的大部分時間內接近零。舉例而言，從白喉棒桿菌生長到密度足以當氧氣一進入培養物就馬上大部分被消耗(潛伏期，例如在發酵開始后至少1、2、3、4、5或6小時)，一直到p02濃度再次上升接近發酵步驟結束時的發酵點(例如在潛伏期后16、18、20、22或24小時)，培養物內的p02降到低于5%、4%、3%、1%或0.5%。通常當p02上升超過限量通氣條件時，發酵結束，收獲培養物。應該注意，在不同的接種條件下，例如當用大得多的白喉棒桿菌培養物接種發酵罐時，從發酵開始后不久(例如在發酵開始后1、5、10、20、30、40或60分鐘)就開始限量通氣條件。當在34.5。C和0.5巴壓力時向培養基通入壓縮空氣后，用氧氣飽和培養基(其中無培養物)時，存在的氧氣量為100%p02。對于150升發酵罐，通氣速率和攪拌速度應該設定為23升/分鐘和240rpm,而對于20升發酵罐，通氣速率和攪拌速度應設定為3升/分鐘和300rpm。在接種之前，它可設定為在完全充氣的發酵培養基中所存在的氧氣量。均質培養物為其中細菌均勻^:于整個發酵罐以便在最上端100/0的培養基中存在至少3%、4%、5%、60/。、7°/。、8%、9%或10%的細菌的培養物。發酵步驟定義為其中在發酵罐中培養白喉棒桿菌的步驟。在將預培養物引入發酵罐時開始發酵步驟，當p02在本文所述限量通氣條件下最終增加到超過10%時結束。發酵步驟通常持續超過12、14、16、18、20或24小時，例如16-40小時，或例如22-28小時。攪動可任選通過攪拌發酵罐中的培養物來進行，但可以任何其它合適方式，例如通過攪動、振動混合器和/或通氣。攪動足以導致培養物的混合時間不低于20、15、10、8、7、6、5、4、3、2或1秒。可在玻璃發酵罐中測量培養物的混合時間。其為引入彩色水溶液后該彩色水溶液均勻分散到整個培養基中所花的時間。發酵罐是適于工業生產細菌培養物的任何設備。然而，該術語并不包括通常用于小規模培養細菌的培養瓶。發酵步驟的大部分時間定義為超過發酵步驟總長度的50%、60°/。、70%、80%或90°/。的時間。發酵通常在限量通氣條件下持續12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26或28小時。限量通氣闡明了這樣的通氣條件，其使得白喉棒桿菌可使用有氧呼吸，然而限制可利用的氧氣量，以便在培養物密度增加后(例如在至少發酵l、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時后)氧氣進入培養物后很快就被消耗，由此p02低于50/0、4%、3%、2%、1%或0.5%。應該注意，通過增加用于接種發酵罐的培養物的量，在接種后很快(例如在發酵開始l、5、10、20或30分鐘后)就可能達到限量通氣條件。這樣的限量通氣條件導致毒素例如白喉毒素或其突變體的旺盛表達。通過通氣速率和攪動來將p02降低到接近零，以便引入培養物的氧氣在進入培養物后很快就被培養物呼吸耗盡，因此盡管對培養物通氣，但在氧氣監控器上p02讀數為零或接近零。在發酵步驟期間，對于給定設置的攪動和通氣速率而言，p02將以較高水平開始。這是因為培養物中的細菌密度在發酵步驟開始時低，在發酵步驟期間增加。通常需要一段時間(例如長達1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時)pO2才降低到小于5。/。。從這一時間點以后，p02保持低于5%、4%、3%、2%、1%或0.5%,優選接近零的水平，直至接近發酵步驟結束，例如直到收獲發酵罐。在整個發酵步驟過程中，任選以恒定KLa來實施發酵步驟。或者，以一種或多種KLa來實施發酵步驟，以便在發酵步驟的大部分時間(至少50%、60%、70%、80%、卯％、95%)內以存在的KLa值來達到限量通氣。KLa是對進入培養物的氧氣量的度量。KLa越高，則引入培養物的氧氣速率越高。包括培養基體積和組成、攪動、通氣、壓力、溫度和發酵罐的可移部分的位置和特性在內的幾種因素都會影響具體發酵步驟的KLa。通常通過將壓縮空氣通入培養物中來將氧氣引入到發酵培養物中。在引入到培養物中的空氣中存在不同濃度的氧氣時，應該考慮到這點來調整流量。例如，在100%氧氣供給被引入到培養物中時，流量將相應地低一些。在將含氧量低于空氣的氣體引入到培養物中時，應該采用較高的流量。可用實施1所述方法測量KLa。該方法涉及i殳定測量KLa采用的發酵罐的培養基體積、溫度、壓力、攪動和通氣條件，其通過用氮氣取代空氣來吹出氣體，通過恢復通入空氣來吹進氣體，測量p02回到其穩態水平時的速率。ln(100-pO2)=-KLa.T十C通過ln(100-pO2)對時間作圖，直線斜率(或角系數)為KLa。發酵步驟的KLa受到多種因素影響，所述因素包括培養物的攪動量和培養物的通氣速率。當例如降低培養物攪動并增加通氣速率，或正好相反時，可維持恒定的KLa。然而，在實施方案中，在發酵步驟期間培養物的攪動和通氣速率二者都恒定。舉例而言，發酵步驟以下面的KLa來實施10-200h-l、10-150h-l、10-100h-l、10-80h-l、10-50h-l、10-40h曙l、10-30h-l、20-150h-l、20-100h-l、20-50h國l、20-60h-l、20-80h-l、20-30h-l、20-40h-l、30-60h-l、60-80h-l、60-150h-l或60-200h曙l。本發明發酵方法的KLa可變化，其視發酵培養物的多少而定。對于10-30升培養物而言，可用10-30h-l、15-30、20-30或22-28h-1的KLa。對于30-250升培養物，可用30-60或40-50h-l的KLa。對于250-800升培養物，可使用30-50、40-50、40-60、30-60、30-80或60-150h-l的KLa。對于800-3000升培養物，可使用30-50、40-50、40-60、30-60、30-80、60-150或60-200h-l的KLa。對于10-30升量的發酵培養物，例如通過用l-5升/分鐘的空氣流量或通氣速率和200-400rpm的攪拌速度，例如用2-4升/分鐘的通氣速率和250-350rpm的攪拌速度，可達成10-30h-l的KLa。對于30-250升的發酵培養物，例如通過用15-25升/分鐘的空氣流量和150-250rpm的攪拌速度，例如通過用20-25升/分鐘的空氣流量和200-250rpm的攪拌速度，例如通過用15-20升/分鐘的空氣流量和200-250rpm的攪拌速度，可達成30-60h-l的KLa。在發酵步驟期間，在CY培養基中的白喉棒桿菌培養物的pH視培養物通氣和攪動條件而定(Nikolajewski等J.BiologicalStandardization,1982,10;109-114)。在發酵步驟開始時，CY培養基的pH為7.4。在低通氣或低KLa情況下，pH降到大約5。在高通氣情況下，pH上升到大約8.5。在本發明一個實施方案中，在CY培養基或SOC培養基(SambrookJ等1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)或相似培養基中培養白喉棒桿菌。通過通氣程度任選無需加入酸或堿，發酵罐中的pH可維持在7,0-7.8。本發明方法可使用任何白喉棒桿菌菌抹。這樣的菌抹可產生野生型白喉毒素、包含白喉毒素或其片段的融合蛋白(例如揭示于US5863891中的融合蛋白)或白喉毒素突變形式或片段，優選減毒毒素。這樣的突變毒素的實例有CRM176、CRM197、CRM228、CRM45(Uchida等J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107和由Nicholls和Youle在GeneticalyEngineeredToxins,Ed:Frankel,MaecelDekkerInc，1992中闡述的其它突變；Glu-148缺失或突變為Asp、Gin或Ser和/或Ala158變為Gly和揭示于US4709017或US4950740的其它突變；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中至少一個或多個殘基突變和揭示于US5917017或US6455673的其它突變；或揭示于US5843711的片段。在實施方案中，白喉棒桿菌菌抹產生CRM197。在實施方案中，以下白喉棒桿菌菌株用于本發明方法ATCC39255、ATCC39526、ATCC11049、ATCC11050、ATCC11051、ATCC11951、ATCC11952、ATCC13812、ATCC14779、ATCC19409、ATCC27010、ATCC27011、ATCC27012、ATCC296、ATCC43145、ATCC51280或ATCC51696。用于本發明的培養基可含有一種或多種以下組分5-20g/L、10-16g/L或10g/L酪蛋白氨基酸或酪蛋白水解物；5-20g/L、7-15g/L或9-12g/L大豆蛋白胨；和/或10-40g/L、14-32g/L或18-22g/L酵母膏。已知生長培養基的鐵含量可影響白喉棒桿菌的生長，并影響毒素的生產(參見WO00/50449)。鐵對于細菌生長必不可少，然而，業已證明高濃度的鐵抑制毒素的產生。在本發明方法中，培養基的鐵含量下限為10、50、75、100、120或150ppb,上限為200、300、400、500、600、700、細、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000ppb。舉例而言，培養基中的鐵濃度為50-1000ppb、100-1000pb、200-1000ppb、400-1OOOppb、500-1500ppb、700-1300ppb、50-2000ppb、100-2000ppb、200-2000ppb、400-2000ppb、700-2000ppb、50畫3000ppb、100-3000ppb、200-3000ppb、400-3000ppb、700-3OOOppb、1000-3000ppb、1500-3000ppb、1700-3000ppb、50-4000ppb、100畫4000ppb、200畫4000ppb、400-4000ppb、700畫4000ppb、1000-4000ppb、1500-4000ppb、1700-4000ppb或2000-4000ppb。鐵可呈Fe2+和/或Fe3+的形式。在實施方案中，本發明方法足以耐受培養基中的鐵鹽存在，以致在使用前無需處理培養基來除去所需要的鐵。發酵步驟在適于培養白喉棒桿菌的溫度下進行，例如25-45°C、25-40。C、30-38。C或34-35。C。發酵步驟易產生大量泡沫。為了控制泡沫形成，任選將消泡劑加入到發酵罐。任選在發酵罐中例如使用泡沫探測器或機械消沫器以及消泡劑。本發明第二方面為用于制備抗原(例如白喉毒素或其突變體或其片段)制劑的方法,其包括實施上述本發明發酵方法和從培養物分離抗原(例如白喉毒素或其突變體或其片段)的步驟。本發明第三方面為通過本發明方法分離的白喉毒素或其突變體或其片段(例如CRM197)。白喉毒素的毒性任選通過化學處理來減毒，包括用交聯劑處理形成類毒素。提及毒素包括類毒素。本發明另一方面為藥物組合物，其包含本發明白喉毒素或其突變體(例如CRM197)或片段和藥學可接受載體。本發明藥物組合物任選進一步包含聯合疫苗中的另外的抗原。在實施方案中，與上述白喉毒素、其突變體或其片段聯合的抗原包括以下中的一種或多種破傷風類毒素、全細胞百日咳(Pw)、無細胞百日咳(Pa)(如下所述)、乙型肝炎表面抗原、甲肝病毒、B型流感嗜血桿菌多糖或寡糖、奈瑟氏球菌(例如腦膜炎奈瑟氏球菌(TV.mem力g/^fe))多糖或寡糖、腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B蛋白、任選作為外膜嚢泡的部分、肺炎球菌多糖或寡糖、肺炎球菌蛋白質或下面所列出的任何抗原。可將細菌多糖綴合到載體蛋白。舉例而言，用本發明方法制備的白喉毒素或類毒素或白喉毒素突變體例如CRM197或片段，可用作載體蛋白。然而，也可使用其它栽體蛋白例如破傷風類毒素、破傷風類毒素C片段、肺炎球菌溶血素、D蛋白(US6342224)。特定藥物組合物任選含有綴合到不同載體蛋白的多種多糖或寡糖。用本發明方法制備的白喉毒素或其突變體例如CRM197或其片段，可與來源于以下一種或多種細菌的莢膜多糖或寡糖調配腦膜炎奈瑟氏J求菌(iVe&sen'fl附em'"g衍cfc)、B型流感嗜血沐干菌(//0^切0//7^5i'w/we打zaeb)、肺炎鏈球菌(iSfre/fococcMSp"ewmom'ae)、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌CSto//^/ococa^m/rew力或表皮葡萄球菌OStop/^/ococcwse;zVifenm'cfo)。例如，藥物組合物或免疫原性組合物可包含來源于腦膜炎奈瑟氏球菌A、C、W-135和Y血清群中一種或多種的莢膜多糖。例如，血清群A和C;A和W、A和Y;C和W、C和Y、W和Y;A、C和W;AC和Y;A、W和Y;C、W和Y或A、C、W和Y可與CRM197調配。在另一實例中，免疫原性組合物包含來源于肺炎鏈球菌的莢膜多糖。肺炎球菌莢膜多糖抗原優選來自血清群1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最優選來自血清群1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另外的實例含有B型流感嗜血桿菌的PRP莢膜多糖(或寡糖)。另外的實例可含有金黃色葡萄球菌的5型、8型、336、PNAG或dPNAG莢膜多糖。另外的實例可含有表皮葡萄球菌的I型、II型、III型或PIA莢膜多糖。另外的實例可含有B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型或III型莢膜多糖。另外的實例可含有A組鏈球菌的莢膜多糖，任選進一步包含至少一種M蛋白，更優選包含多種類型的M蛋白。用于本發明的細菌多糖可為已純化的全長天然多糖。或者，將多糖篩分(size)2-20次，例如2-5次、5-10次、10-15次或15-20次，以便多糖大小小一些從而更易處理。寡糖通常含有2-20個重復單位。這樣的莢膜多糖可不綴合或綴合載體蛋白，例如破傷風類毒素、破傷風類毒素C片段、白喉類毒素或CRM197(例如二者都由本發明方法制備)、肺炎球菌溶血素或D蛋白(US6342224)。破傷風毒素、白喉毒素和肺炎球菌溶血素通過遺傳突變和/或通過化學處理去毒。可通過任何已知的偶聯技術制備多糖或寡糖綴合物。例如可通過硫醚鍵來偶聯多糖。這種綴合方法依靠用四氟硼酸l-氰基-4-二曱氨基吡啶鏡(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。由此活化的多糖可直接或通過間隔基團偶聯于載體蛋白上的氨基。任選氰酸酯與己二胺偶聯，用涉及形成硫醚鍵的異源連接(heteroligation)化學讓氨基衍生化的多糖綴合于栽體蛋白。這樣的綴合闡述于PCT申請公開說明書WO93/15760UniformedServicesUniversity中。通過如US4365170(Je皿ings)和US4673574(Anderson)所述的直接還原胺化方法也可制備綴合物。其它方法闡述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。另外的方法涉及溴化氰活化的用己二酸肼(ADH)衍生化的多糖通過碳二亞胺縮合偶聯到蛋白載體(ChuC.等Infect.Immunity,(1983)245;256)。在具體實施例中，讓白喉毒素或其突變體片段(例如CRM197)綴合于藥物組合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種另外的抗原。在一個實施方案中，其與多糖組分綴合，例如細菌多糖，包括上面所列的那些細菌多糖。本發明藥物組合物或免疫原性組合物可進一步包含另外的蛋白質組分。其任選與提供抗破傷風和百日咳博德特氏菌感染中一種或多種的保護作用的抗原一起調配。百日咳組分可為殺死的全細胞百曰咳博德特氏菌(Pw)或無細胞百曰咳(Pa)，后兩者含有來自PT、FHA和69kDa百日咳桿菌粘附素(pertactin)中的至少一種抗原(優選2種或所有3種)。某些其它無細胞百日咳制劑也含有凝集原，例如Fim2和Fim3，這些疫苗也涵蓋用于本發明中。通常提供抗破傷風保護作用的抗原為破傷風類毒素，其為化學失活毒素(例如用甲醛處理后)或通過引入一個或多個點突變而被失活。本發明藥物組合物或免疫原性組合物任選包含肺炎球菌蛋白抗原，例如那些暴露于肺炎球菌外膜的肺炎球菌蛋白(在至少部分肺炎球菌生活周期中能夠被宿主免疫系統所識別)，或由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。舉例而言，所述蛋白可為毒素、粘附素、雙組分信號轉導物或肺炎鏈球菌的脂蛋白或它們的片段。這樣的蛋白實例包括但不限于肺炎球菌溶血素(優選通過化學處理或突變去毒)[Mitchell等NucleicAcidsRes.1990Jul11;18(13):4010"Comparisonofpneumolysingenesandproteinsfrom5^re/tococcwsp"ewwow/aetypes1and2."、Mitchell等BiochimBiophysActa1989Jan23;1007(1):67-72"ExpressionofthepneumolysingeneinEsc/zeWc/n'aco//:rapidpurificationandbiologicalproperties."、WO96/05859(A.Cyanamid)、WO卯/06951(Paton等)、WO99/03884(NAVA)];PspA和其橫-爭膜缺失變異體(US5804193-Briles等.)；PspC和其橫跨膜缺失變異體(WO97/09994-Briles等)；PsaA和其橫跨膜缺失變異體(Berry和Paton，InfectImmun1996Dec;64(12):5255-62"SequenceheterogeneityofPsaA,a37-kilodaltonputativeadhesinessentialforvirulenceofSVreptococcwspwewwcra'ae");肺炎^求菌膽石咸結合蛋白和其4黃跨膜缺失變異體；CbpA和其橫跨膜缺失變異體(WO97/41151;WO99/51266);甘油醛3-磷酸脫氬酶(InfectImmun，199664:3544);HSP70(WO96/40928);PcpA(Sanchez-Beato等FEMSMicrobiolLett1998，164:207-14);M樣蛋白(EP0837130)和粘附素18627(EP0834568)。包含在免疫原性組合物中的其它肺炎球菌蛋白抗原為闡述于WO98/18931、WO98/18930和PCT/US99/30390中的抗原。與本發明免疫原性組合物一起調配的奈瑟氏球菌蛋白的實例包括TbpA(WO93/06861;EP586266;WO92/03467;US5912336)、TbpB(WO93/06861;EP586266)、Hsf(W099/31132)、NspA(W096/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(也稱為D15)(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PldA(PCT/EP99/06718)、FrpB(W096/31618,參見SEQIDNO:38)、FrpA或FrpC或這兩種共有的至少30、50、100、500、750個氨基酸的保守部分(W092/01460)、LbpA和/或LbpB(PCT/EP98/05117;Schryvers等Med.Microbiol,199932:1117)、FhaB(WO98/02547SEQIDNO:38)、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、MltA(W099/5728O)和ctrA(PCT/EP00/00135)。奈瑟氏球菌蛋白任選作為純化蛋白或作為外膜制品的部分加入。本發明藥物組合物或免疫原性組合物任選包含可保護宿主4氐抗不可分型流感嗜血桿菌、RSV的一種或多種抗原，和/或可保護宿主抵抗流感病毒的一種或多種抗原。不可分型流感嗜血桿菌蛋白抗原實例包括Fimbrin蛋白(US5766608)和包含來自其中的肽的融合蛋白(例如LB1融合蛋白)(US5843464-OhioStateResearchFoundation),OMP26、P6、D蛋白、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap和D15。流感病毒抗原實例包括全病毒、活病毒或滅活病毒、片段流感病毒(splitinfluenzavirus)(其在雞蛋或MDCK細胞或Vero細胞中培養)或全流感病毒顆粒(如R.Gluck，Vaccine,1992,10，915-920所述)或其純化蛋白或其重組蛋白，例如HA、NP、NA或M蛋白或其組合。RSV(呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus))抗原實例包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。應該了解，本發明抗原組合物可包含來自一種細菌的一種或多種莢膜多糖。抗原組合物也可包含來自一種或多種細菌的莢膜多糖。本發明另一方面包括免疫原性組合物或疫苗，其包含由本發明方法制備的白喉毒素、其片段或其突變體(例如CRM197)和藥學可接受載體。答的量的佐劑。合適的佐劑包括但不限于鋁鹽、角豈烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苦衍生物、分枝桿菌細胞壁制備物、單磷脂酰脂質A、霉菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、QuilA、霍亂毒素B亞單位、聚磷療(polphosphazene)及衍生物和免疫刺激復合物(ISCOM),例如由Takahashi等(19卯)Nature344:873-875闡述的免疫刺激復合物。對于獸醫應用和在動物體內產生抗體，可使用弗氏佐劑的促細胞分裂組分。對于所有免疫原性組合物或疫苗，免疫原的免疫有效量應該憑經驗決定。要考慮的因素包括免疫原性、免疫原是否與佐劑或載體蛋白或其它載體形成復合物或共價連接、給藥途徑和待給予的免疫劑的次數。這樣的因素為疫苗領域所知。不必經過過多實驗就可作出這些決定，這完全在免疫學者的技術范圍內。在本發明藥物組合物或疫苗中活性劑可以不同濃度存在。通常，該物質的最低濃度為達成其計劃應用所需的量，而最高濃度為保留在溶液或均質懸浮在初始混合物中的最大量。例如，治療劑的最小量優選將提供單一治療有效劑量的量。對于生物活性物質，最低濃度為重建時生物活性所需要的量，最高濃度為不能保持均一懸浮液的那一點。在單劑量單位情況下，該量為單一治療應用的量。通常預期每劑將包含l-100嗎蛋白抗原，優選5-50|ig,最優選5-25jig。優選的細菌多糖劑量為10-20jxg、10-5)ig、5-2.5嗎或2.5-ljxg。該物質的優選量隨物質的不同而變化，但其易于由本領域技術人員確定。或治療易感染的哺乳動物(例如人類患者)。這些給予可包括通過肌肉、腹膜內、皮內或皮下途徑注射；或通過粘膜給予口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。盡管本發明疫苗可作為單一劑量給予，但其組分也可同時一起給予，或在不同時間給予(例如若疫苗中存在多糖，則為了彼此之間免疫應答最佳協調，其可同時分開給予，或在給予細菌蛋白組合后1-2周單獨給予)。除了單一給藥途徑外，可用2種不同給藥途徑。例如，可ID(皮內)給予病毒抗原，而可IM(肌肉內)或IN(鼻內)給予細菌蛋白。若存在多糖，則其可IM(或ID)給予，而細菌蛋白可IN(或ID)給予。另外，本發明疫苗的初次劑量可經IM給予，而加強劑量可經IN給予。疫苗制劑在VaccineDesign("Thesubimitandadjuvantapproach"(PowellM.F.和NewmanM.J.編輯)(1995)PlenumPressNewYork)中有全面闡述。Fullerton的US4,235,877闡述可在脂質體內包封。本發明另一方面為制備藥物組合物的方法，其包括下述步驟用本發明發酵方法制備白喉毒素或其片段或其突變體(例如CRM197)，和將其與藥學可接受載體混合，任選加入任何上述額外抗原。這樣的方法還可包括將白喉毒素或其片段或其突變體(例如CRM197)與藥物組合物中的一種或多種額外組分(優選如上所述細菌多糖或寡糖)綴合的步驟。本發明另一方面為本發明白喉毒素或其片段或其突變體(例如CRM197)在制備用于治療或預防細菌性疾病尤其是白喉棒桿菌病的藥物中的用途。本發明另一方面為預防或治療細菌感染(尤其是白喉棒桿菌感染)的方法，其包括將本發明藥物組合物、免疫原性組合物或疫苗給予患者。本專利說明書所引用的所有參考文獻或專利申請在此引作參考。本發明在附隨實施例中闡明。除非另外詳述，否則用本領域技術人員熟知和常規的標準技術實施以下實施例。實施例為說明性的，并非限制本發明。實施例實施例1:測量KLa為了測量發酵步驟的KLa，將所需體積的水裝入發酵罐，應用發酵參數(例如溫度、壓力、攪動和通氣)使系統達到穩態。p02探針校準為100%。將通氣快速轉換為氮氣，同時保持同樣的流量。跟蹤p02直至p02降到小于5%。當達到該點時，將通氣快速轉換為空氣，同時保持同樣的流量。跟蹤p02水平，在幾個時間點記錄以初始穩態100%水平的百分數記錄p02水平。通過1og(100-pO2。/。)對時間作圖計算KLa。圖形線性部分的角系數對應于KIa。通常只考慮20%-80%p02的數據。結果在不同時間點的p02讀數示于以下表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>作圖結果如圖1所示，從圖IB中線的角系數測定KLa。實施例2:以150升^f莫發酵白喉棒桿菌菌林ATCC39255制備CRM197(交叉反應材料)所用的細菌為按照A.Pappenheimer方法(NatureNewBiol.233:8-11,1971)用亞硝基胍處理得到的白喉棒桿菌突變菌抹。其表達去毒白喉毒素(aa52:甘氨酸到谷氨酸突變)。其從ATCC獲得，在ATCC其被稱為39255。發酵方法概要示于圖2。從冰箱(—70。C)取回含有Uxl0^cfu/ml的工作種子，在室溫解凍。解凍后立即旋渦振蕩管形瓶，用帶針頭的lml注射器取出250pd種子。將該體積注射到100ml無菌鹽溶液(0.9%)中。攪動燒瓶。用帶針頭的2ml注射器取出2ml懸浮液，用于接種含有500mLUS4，925，792中所述培養基的3-L錐形瓶。在34.5°C±0.5"于250rpm攪拌速度下溫育該燒瓶，直至光密度(650nm)達到4.0-6.0(溫育后16-19h)。將150升發酵罐滅菌，將100L培養基無菌轉入發酵罐。將500mLH3P0425%(V/V)裝入酸瓶；培養基pH開始大約為7.4,不調整。在接種的前一天準備發酵罐，保持在34.5。C溫度、0.5巴壓力、頂部空間空氣流量23NL/分鐘、攪拌速度50rpm的待用狀態16-20h直至接種。在接種之前，將發酵罐設定到培養條件-34.5。C溫度、0.5巴壓力、噴射入培養基的空氣流量23NL/分鐘和攪拌速度240rpm。240rpm的攪動提供1.76m/s的端速(tipspeed),理論混合時間為3.9秒。不調節溶解氧，僅對其進行監測，打開泡沫控制系統，使pH達到7.8，此后通過加入H3P04來維持pH。在接種之前，將p02探測器設定在100%。撹拌速度設為240rpm,其對應于1.76m/s的外周速度。240rpm的攪拌速度結合23-L/分鐘的通氣速率，導致KLa(20-80%、水30°C、0.5巴)估計為42h-l(參見圖6)。通過接種端口將400ml上述種子培養物接種到發酵罐。繼續發酵直到以下兩個條件都得到滿足。20小時發酵時間，溶解氧水平增加到10%。總發酵期通常為22-28h。在發酵結束時，改變溫度到設為20°C,關閉pH調節，為了限制起泡將空氣流轉移到頂部空間，關閉泡沫控制系統，其它參數不變。將微孔過濾系統連接到發酵罐上，當懸浮液溫度達到2rc時，開始微孔過濾。微孔過濾分兩個階段操作濃縮和滲濾。在濃縮階段，參數為入口壓力0.6巴；出口壓力約0.1巴；滲透物流量用校準的蠕動泵(滲透壓力約0.3巴)保持在2L/分鐘的恒速。濃縮懸浮液直到首次出現以下事件之一。入口壓力達到0.9巴或回收了75升滲透物。在滲濾階段，使用以下參數入口壓力保持在濃縮階段結束時達到的壓力(最大為0.9巴)；以2升/分鐘加入水；加入的總水量為截留物的3倍體積。將截留物在0.22pm膜上過濾，貯存在+4。C。在+4。C或在室溫(+2(TC〈RT〈3。C)儲存長達4天后測定這樣的懸浮液中的CRM197的穩定性。通過ELISA定量或在SDS-page上未觀察到降解和差別。于36。C在BAB瓊脂上溫育進行試驗，以確i正無生長。結果用上述發酵方案進行了兩次150-L規;漠的發酵(CDT199和CDT206)。預培養條件和培養條件示于表2和3中，CRM197產率示于表4中。圖3所示為典型的預培養物生長動力學圖。當O.D.(650nm)為4.0-6.0時，很明顯培養物處于指數生長期，pH僅稍有變化。表2預培養條件<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在發酵期間，觀察到不同階段。第一階段的特征為溶解氧降低直到達到0%(持續時間大約6-7h)。在該階段pH保持穩定或稍微降低(約0.1pH單位)。在第二階段pH升高，達到約pH7.8的穩定水平。在該水平，觸發pH調節，然而，在這些發酵條件下通常根本不必加入酸。在該pH穩定水平期間，觀察到溶解氧水平升高超過0%,接著降到0%。第三階段特征為pH降低到約7.4。最后，在發酵的22和24h之間，觀察到p02升高。這是收獲信號。用質譜儀分析發酵罐的排出氣體。觀察到典型的C02產生曲線(profile),為了評估CRM197產生的動力學，在收獲信號后延長了所存在的2次發酵。我們觀察到，在達到收獲信號后CRM197水平沒有增加，但泡沫產生增加。為了限制消泡劑的消耗，優選在收獲信號時停止發酵。然而，CRM197似乎并沒有受到過量起泡的影響，不發生降解。孩么孔過濾展示了CDT206微孔過濾的數據。當入口壓力達到0.9巴時收獲74.3L滲透物。在整個濃縮步驟中出口壓力為0.15-0.10巴。在整個濃縮步驟中滲透壓為0.3-0.4巴，濃縮步驟持續36分鐘。對于滲濾階段，逐漸加入(2L/分鐘)75-L水，同時以同樣的流量提取滲透物。在滲濾開始時入口壓力為0.9巴，結束時降到0.7巴。出口壓力穩定在O.l巴。滲濾步驟持續時間為39分鐘。CRM197定量低通氣條件下CRM197表達水平通常是高通氣條件(其中在整個發酵期間p02保持在5%或更高)所達到水平的2-4倍。培養物上清液的染色SDS-page在還原條件下進行培養物上清液的SDS-PAGE凝膠電泳(圖4),以便可能檢測出任何降解條帶(在剪下后可檢測出分別為35kD和23kD的2個亞基)。隨后用考馬斯藍對其染色。結果來自2次發酵的樣品的考馬斯染色凝膠示于圖4A(CDT199)和4B(CDT206)中。CRM197出現在預期的分子量位置(理論MW:58.4kD)。CRM197未被降解，因為在發酵結束信號后采集的樣品中未觀察到模式有變化(圖4A第9和10道)。CRM197量不受微孔過濾和在0.22pM上最終過濾的影響，因為在圖4A的第9和11道顯示出等量的CRM197。溫度可能對CRM穩定性有負面影響(圖4B的第12道)。當樣品閥溫熱時采集該樣品，該樣品中存在的CRM197量降低了。實施例3:以20升，發酵白喉棒桿菌菌林ATCC39255除了使用20升發酵罐外，用與實施例2所述相似的方法發酵白喉棒桿菌。以300rpm攪動培養物，空氣流量設為3升/分鐘。在發酵期間不需要加入酸或堿，因為在整個發酵方法中pH保持在大約中性。培養物生長到最終OD(650nm)-18.3。通過對染色凝膠的光密度測定評估，發現CRM197產率為103mg/升。實施例4:以不同規模發酵白喉棒桿菌菌林ATCC39255在恒定KLa條件下培養白喉棒桿菌的發酵方法可用于其它大小和不同設計的發酵罐中。按照表5中所示的發酵罐大小、空氣流量和攪動速度條件，達到了高產率的CRM197生產。在不同設計的發酵罐中進行了三次150L規模的發酵。<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表5所示，重要的是KLa,而不是空氣流量和攪動速度條件的具體選擇。因此，為了產生相似的KLa，較低的空氣流量可由較高的攪動速度來彌補，仍可達到很好的CRM197產率。攪動速度應該足以產生均一懸浮液，限制通氣以保持低p02。N.B.使用不同發酵罐進行20升發酵。不同幾何形狀的不同發酵罐導致的kLa值范圍示于表5。然而，對于不同的發酵規模，最佳KLa條件不同。因此，對于在20升發酵罐中發酵，較低的22-28h-l的KLa為最佳。最佳KLa條件為允許限量通氣使培養物內的p02落在低水平。對于特定大小和幾何形狀的發酵罐而言，本領域技術人員應該能夠容易地確定這樣的條件。實施例5:在不同p02時鐵濃度對發酵產率的影響按照實施例3提出的方法，進行了一系列20升M^莫的白喉棒桿菌菌抹ATCC39255發酵，使p02在整個發酵的大部分時間4艮低，或以恒定的5。/op02。所存在的Fe3+量變化為不加Fe3+、加入250ppbFe3+、加入500ppbFe3+和力口入500ppbFe2+。通過SDS-PAGE凝月交光密度測定法測定發酵結束時的CRM197產率。該方法給出的結果往往大約比ELISA得到的結果低20%。結果表6<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如表6所示，當白喉棒桿菌在5%p02發酵時，加入^t失導致產率降低。然而，當降低p02水平時，在如實施例3所述的恒定Kla時在低p02條件下進行發酵，得到較高產率，并且該產率不受加入Fe3十的影響。實施例6:在低通氣條件下鐵濃度對DT或CRM197產率的影響在微孔板中測定不影響CRM197表達的鐵濃度范圍。微孔板模擬存在于本發明發酵方法中的限量通氣條件。在與上述發酵中所用相同的培養基中(在與CY培養基相似的培養基中)實施微孔板培養。從含lg/1Fe3+離子的FeCl3.6H20儲液中加入Fe3+。將培養基裝入^f效孔板孔中，以8E5細菌/mL進行培養。在表達CRM197的白喉棒桿菌和表達白喉毒素的白喉棒桿菌兩種情況下，微孔板于34.5。C在250rpm攪動下培養46h。將樣品通過0.22jnm濾器過濾。在用考馬斯藍(來自Pierce的Gelcodeblue染色液)著色的SDSpage(XTCriterion4-12%bistris,來自BioRad)上用光密度測定法測量表達。用于定量的參比是ListBiologicalLaboratoriesINC的白喉毒素CRM突變體，其以不同濃度加到凝膠上。結果表7所示為在微孔板孔中白喉棒桿菌在限量通氣條件下于不同鐵濃度下生長時的CRM197表達。CRM197表i^JtFe3+所致的抑制并不很敏感，沒有明顯受到加入lppm或2ppmFe3+的影響。只有在3ppm時CRM197表達出現顯著降低。即使是在該Fe3+水平，CRM197表達仍然為不加Fe3+時所達到水平的79%。表7表達CRM197的白喉棒桿菌<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>CRM197產率以不加額外Fe3+達到的產率的百分比表示。在指定條件下于微孔板孔中培養的白喉棒桿菌的DT表達結果示于表8中。在限量通氣條件下DT生產對Fe3+所致的抑制也不很敏感。隨著Fe3+濃度增加，DT表達增加，在700ppb時達到最大DT產量。只有當Fe3+濃度增加到3ppm時，DT表達才開始下降。表8表達白喉毒素的白喉棒桿菌力口入的Fe3+光密度DT(ppm)46hpH(%)04,168，66100200ppb4,728,42106300ppb4,68，47107400ppb4,98，51125500ppb4,228，59155600ppb4,488,51148700ppb4,048，63167800ppb4，288,52164900ppb4,588,62168lppm4,488,641662ppm4，78,681763ppm4，28，68141DT產率以不加額外Fe3+達到的產率的百分比表示。權利要求1.一種發酵方法，其包括在發酵罐中的培養基里培養白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的發酵步驟，該步驟在足以維持均質培養物的攪動和限量通氣以便培養物中的pO2在發酵步驟的大部分時間內降低到低于4％的條件下進行。2.權利要求l的發酵方法，其中所述p02在發酵步驟的大部分時間內降低到接近零。3.權利要求1或2的方法，其中從白喉棒桿菌生長到因快速消耗氧氣而足以使p02降低到小于4%的密度時直到發酵步驟完成，保持所述p02小于4%。4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述發酵步驟在恒定KLa下進行。5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述發酵步驟在恒定攪動速度和通氣速率下進4亍。6.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述發酵步驟在可變kLa條件下進行。7.前述權利要求中任一項的方法，其中所述發酵步驟在10-50h-l的KLa下進行。8.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述發酵步驟在10-30h-lKLa下于10-30升發酵罐中進行。9.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述發酵步驟在30-60h-l的KLa下于100-250升發酵罐中進行。10.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述發酵步驟在60-150h-l的KLa下于250-800升發酵罐中進行。11.權利要求8的方法，其中所述發酵步驟在l-5L/分鐘的壓縮空氣氣流和200-400rpm的攪動速度下進行。12.權利要求9的方法，其中所述發酵步驟在15-25L/分鐘的壓縮空氣氣流和150-250rpm的攪動速度下進行。13.前述權利要求中任一項的方法，其中所述培養基為CY、SOC或相似培養基，發酵罐中的pH通過通氣程度保持在7.0-7.8,而無需力口入酸或堿。14.前述權利要求中任一項的方法，其中所述白喉棒桿菌菌林產生白喉毒素或其突變體，特別是CRM197。15.前述權利要求中任一項的方法，其中所述白喉棒桿菌菌林為ATCC39255。16.前述權利要求中任一項的方法，其中所述方法足夠耐受培養基中的鐵鹽存在，以致在使用前無需處理培養基來除去鐵。17.前述權利要求中任一項的方法，其中所述培養基含有10-權0ppb的鐵。18.權利要求17的方法，其中所述培養基含有100-3000ppb或1700-3000ppb的4失。19.前述權利要求中任一項的方法，其中所述培養基含有5-20g/L酪蛋白氨基酸或酪蛋白水解物。20.權利要求1-18中任一項的方法，其中所述培養基含有5-20g/L大豆蛋白胨或其它植物蛋白胨。21.前述權利要求中任一項的方法，其中所述培養基含有10-30g/L酵母膏。22.前述權利要求中任一項的方法，其中所述發酵步驟在25-40。C溫度下進行。23.前述權利要求中任一項的方法，其中將消泡劑加入到發酵罐中。24.前述權利要求中任一項的方法，其中在發酵罐中使用泡沫探測器或機械消沫器。25.—種制備白喉棒桿菌抗原制劑的方法，其包括實施權利要求1-24中任一項的發酵方法和從培養物分離白喉棒桿菌抗原的步驟。26.權利要求25的方法，其中所述白喉棒桿菌抗原為白喉毒素或其片段或其突變體。27.權利要求26的方法，其中所述抗原為CRM197。28.權利要求25-27中任一項的方法，其包括將一種或多種另外的抗原加到白喉棒桿菌抗原中的步驟。29.權利要求28的方法，其進一步包括讓白喉毒素或其片段或其突變體與一種或多種另外的抗原綴合。30.權利要求29的方法，其中所述一種或多種另外的抗原包含細菌多糖或寡糖。31.—種制備藥物組合物的方法，其包括讓通過權利要求25-30中任一項的方法制備的抗原或白喉毒素或其突變體(綴合的或未經綴合的)與藥學可接受載體混合的步驟。32.通過權利要求25-31中任一項的方法制備的抗原、白喉毒素或其突變體在制備用于治療或預防細菌性疾病的藥物中的用途。33.權利要求32的用途，其中所述細菌性疾病為白喉棒桿菌病。34.—種預防或治療細菌感染的方法，其包括將用權利要求31的方法制備的藥物組合物給予患者。35.權利要求34的方法，其中所述細菌感染為白喉棒桿菌感染。全文摘要本發明涉及發酵方法，其包括在發酵罐中的培養基里培養白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的發酵步驟，該步驟在足以維持均質培養物的攪動和限量通氣以便培養物中的pO2在大部分發酵步驟中降低到低于4％的條件下進行。文檔編號A61K39/00GK101180313SQ200680017793公開日2008年5月14日申請日期2006年3月21日優先權日2005年3月23日發明者M·R·F·奧爾瓦爾,O·M·S·G·拉盧瓦,P·M·H·德霍泰,S·德蘇伊申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司