治療缺血相關疾病的方法

專利名稱：：治療缺血相關疾病的方法
技術領域：
：本發明涉及治療缺血相關的疾病及紊亂的方法，包括由于突然喪失氧氣導致的神經及心臟疾病，以及像阿爾茨海默病這樣的變性疾病。所述方法涉及某些縮氨基硫脲化合物的使用。
背景技術：
：本發明總地涉及某些N-雜環甲醛縮氨基硫脲(HCTs)的新用途，目前己知所述的N-雜環甲醛縮氨基硫脲(HCTs)，作為核糖核苷酸還原酶的強力抑制劑，可用作抗腫瘤劑。使用這些化合物治療腫瘤的方法特別地在Sartorelli等的美國專利5,721,259和5,281,715中公開。另外，本發明涉及HCTs的許多新的類似物，其令人驚訝地被發現具有神經保護作用。新近，美國專利6,613,803公開了某些新型的縮氨基硫脲用于治療神經元損傷和神經變性疾病的用途。據稱該新型化合物作為鈉通道阻斷劑發揮其治療作用。然而，到目前為止，本領域中一直沒有公開與Sartorelli的專利中公開的那些相同或相似的化合物用于治療或預防神經元損傷的用途。神經細胞的存在及生理功能的實現需要能量支持。中樞神經細胞能量的唯一來源通常認為來自血液的葡萄糖及氧氣。如果全部或任何部分中樞神經系統的血液供應被關閉，那么受累的神經元會缺氧及低糖(又稱缺血疾病，并且其在本文中與缺氧和/或低糖同義使用)，并且它們迅速變性和死亡。臨床上，通常將神經系統缺乏血液供應的情況稱為"腦卒中"。僅僅是氧氣供應的中斷，則稱為"缺氧"，這發生在昏厥、窒息或溺水。單獨是葡萄糖的供應中斷，則稱為"低糖"。近年來，已經認識到，谷氨酸鹽在中樞神經系統正常和健康的情況下是一種重要的興奮神經遞質，但在缺血時則起著神經毒性作用，稱為"興奮毒性(excitotoxicity)"。通常，谷氨酸鹽存在于細胞內，僅僅在突觸連接處微量釋放，作用到毗鄰含有谷氨酸鹽受體的祌經元以傳遞神經信號。在正常情況下，釋放到細胞外液的谷氨酸鹽在數毫秒時間內會以一種高效的轉運過程被轉運回神經元內。只要這種轉運過程工作正常，谷氨酸鹽的興奮毒性潛能就會被遏制。然而，這種轉運過程是需要能量的，所以在缺血(能量短缺)的情況下，谷氨酸鹽轉運失能，已經釋放作為遞質的谷氨酸鹽分子則會在細胞外的突觸液中蓄積。這使得谷氨酸鹽持續與興奮受體接觸，讓這些受體處于過度刺激狀態，這種情況下神經元過度興奮導致死亡。兩個額外的因素使情況更加復雜和惡化(l)受刺激過度的神經元在另外的突觸連接處釋放過量的谷氨酸鹽，使更多的神經元處于過度刺激狀態，神經毒積累范圍超過初始的缺血區；和(2)與正常的神經元相比，受過度刺激的神經元更迅速消耗葡萄糖或氧氣，這加速了有限能源的消耗，并進一步損害谷氨酸鹽的轉運過程。因此，象在腦卒中、心跳停止、昏厥的缺氧或低糖這樣能量不足情況下導致的腦損傷是由雙重機制造成的；初始的原因是缺血本身，其導致谷氨酸鹽轉運系統失靈及谷氨酸鹽介導的興奮毒性事件級聯反應很大程度上為隨后的腦損傷負責。除上述情況外，最近已經注意到神經元使用能量基質(葡萄糖及氧氣)來維持其能量水平的能力的各種缺陷還可以激發導致神經元死亡的興奮毒性過程。據推定，這是出現在象阿爾茨海默病、帕金森氏綜合癥、亨廷頓舞蹈病及肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)這樣的神經疾病中的神經變性的機制。例如，在患阿爾茨海默病病人腦活檢組織中，已發現細胞內能量代謝缺陷的證據，并被建議引發谷氨酸鹽興奮毒性潛能釋放導致阿爾茨海默病中神經元的死亡，從而通過與能量關聯的興奮毒性過程來解釋。也有報道，在帕金森氏綜合癥及亨廷頓舞蹈病中細胞內存在能量代謝的內在缺陷的證據。盡管目前市場上沒有神經保護用治療劑，但是存在被批準用于治療慢性神經疾病的藥物，其是谷氨酸受體(NMDA)拮抗劑。盡管有證據表明這些藥物在慢性CNS變性疾病中有改善作用，但是NMDA拮抗劑單獨似乎通常不能提供實質的對缺血的保護作用，特別是在緊急情況下。谷氨酸鹽受體拮抗劑作為神經保護劑抵抗缺血性神經變性的突出限制是，它們僅暫時使神經元與變性隔離；它們既沒有更正能量短缺，也沒有更正隨著能量短缺繼發而來的其它錯亂。因此，盡管這些拮抗劑的確在動物模型中對缺血性神經變性提供了某種程度的保護，但其保護是不完全的，并且在某種情況下僅延緩了變性的始發時間。因為缺血狀況發生后神經元開始非常迅速地變性，所以很明確尚需要新的治療劑，它們會發揮作用以保護神經元免受進一步的變性和死亡，例如通過恢復由血流中的氧和糖提供的能量平衡發揮作用。這些治療劑不僅用于治療急性缺血疾病，而且用于預防在慢性變性疾病如阿爾茨海默病和帕金森氏綜合癥中的神經元變性，基于糾正神經元能量短缺和預防興奮毒性神經元變性。另外，本發明的化合物還可用于治療眼和耳的由缺血性病因導致的神經疾病，以及糖尿病性神經病。開發能夠預防或治療不管是急性還是慢性缺血事件的后果的治療劑，將是極受歡迎的。
發明內容本發明涉及以某些N-雜環2-甲醛縮氨基硫脲(HCTs)及其可藥用鹽或前藥投藥給所需病人以預防和/或治療由缺血狀況導致的疾病的方法這種有用的化合物由式I表示更優選地，所述化合物選自式II:更優選地，本發明的方法采用了在以下更完全描述的選自式III、IV、V或VI的化合物。作為最優選的實施方案，PAN-811(3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲)，其具有下式結構，用于實踐本發明的方法更優選地所述化合物選自式II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本發明還涉及治療、改善和/或預防特定的缺血相關疾病的方法，包括但限于治療在任何原因導致的彌散性和病灶性缺血后的神經元損傷(并預防另外的缺血性損傷)，治療或預防牽涉缺血性狀況的耳神經毒性和眼病(如黃斑變性)，預防由于創傷或冠狀動脈旁路手術導致的缺血，治療或預防神經變性疾病如肌萎縮性側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病、帕金森氏綜合癥和亨廷頓舞蹈病，以及治療或預防糖尿病性神經病。圖1為用PAN-811(A)或已知的神經保護劑維生素E(B)、硫辛酸(C)或銀杏(GinkgoBiloba)(D)預處理，隨后用過氧化氫處理的細胞存活率(左版面)及神經保護能力(右版面)的代表性圖示。圖2為PAN-811對神經細胞中產生ROS的影響的代表性圖示。(A)PAN-811對神經細胞中產生過氧化氫誘導的ROS的影響。(B)PAN-811對神經細胞中產生基礎水平的ROS的影響。圖3為在缺氧情況下神經毒性對葡萄糖濃度的依賴性的代表性圖示。圖4為在常氧情況下及缺氧情況下PAN-811的神經保護作用的代表性圖示。圖5為在缺氧/低糖情況下PAN-811毒性的代表性圖示。圖6為輕度缺氧/低糖情況下PAN-811對神經細胞死亡的保護作用的代表性圖示。圖7為腦皮質神經元被PAN-811處理24小時時，PAN-811神經毒性的代表性圖示。圖8為PAN-811對缺血產生毒性的保護作用的代表性圖示。圖9為在用PAN-811或溶劑預處理，然后用過氧化氫處理后的細胞存活率的代表性圖示。圖10為在用PAN-811或溶劑預處理，然后用過氧化氫處理后的細胞存活率的代表性圖示。發明詳述缺血相關紊亂或疾病的病理學，涉及通常由于血管狹窄或阻塞導致的體內器官、組織或機體的部分血液供應減少，例如視網膜病、急性腎衰竭、心肌梗塞及腦卒中。這可以是急性發作(如心臟病發作)或慢性過程(如阿爾茨海默病或ALS)的結果。本發明意在可用于急性或慢性病理學中。本發明涉及以式I的化合物或其可藥用鹽或前藥投藥給所需病人以治療缺血相關疾病特別是神經元細胞和組織的方法其中HET是含1或2個選自N和S的雜原子的5或6元雜芳基殘基，并且任選地被氨基取代；并且R為H或Q-C4-垸基。在一優選實施方案中，所述化合物由式n表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中R是H或C廣Q-烷基；并且R1、re和W獨立地選自H和氨在另一優選實施方案中，所述化合物由式III表示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula其中R是H或C1-4-垸基；并且Ri和R2獨立地選自H和氨基,在另一優選實施方案中，所述化合物由式IV表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中R是H或C1-4-垸基。在又一優選實施方案中，所述化合物由式V表示:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中R是H或C1-4垸基.最后，另一優選實施方案是式VI所示的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中R是H或d-Or烷基,作為更優選的實施方案，本發明的化合物選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(在式n中，R是甲基，并且R!、R2和R3是H);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(在式III中，R是甲基并且R,和R2是H);<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(在式V中，R是H);和(在式VI中，R是H)。本發明的最優選的實施方案涉及下式所示的PAN811(3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲)投藥給所需病人以治療缺血相關疾病的方法
技術領域：
：本發明的某些化合物可在C二N雙鍵附近以E、Z-立體異構體存在，并且本發明包括異構體的混合物以及單獨的異構體，單獨的異構體可通過本領域普通技術人員公知的方法被分離。本發明的某些化合物可以光學異構體形式存在，并且本發明包括這些光學異構體的外消旋混合物以及單獨的對映體，單獨的對映體可通過本領域普通技術人員公知的方法被分離。可藥用鹽的例子是無機酸和有機酸的加成鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸、乙酸鹽、二氯乙酸鹽和草酸鹽。前藥的例子包括，例如，化合物與作為羥垸基的R,-R3形成的酯，并且這些前藥可根據己知技術制備。本發明人令人驚訝地和意想不到地發現化合物3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲，及其若干新型類似物，可有效用作神經保護劑，已知目前僅僅公開了所述化合物作為抗腫瘤劑的用途。例如，參見美國專利5,721,259。因此，本發明的實施方案之一涉及特定的缺血相關疾病的改善，包括但限于治療在任何原因導致的彌散性和病灶性缺血后的神經元損傷(并預防另外的缺血性損傷)，治療或預防牽涉缺血性狀況的耳神經毒性和眼病(如黃斑變性)，預防由于創傷或冠狀動脈旁路手術導致的缺血，治療或預防神經變性疾病如肌萎縮性側索硬化(ALS)、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷頓舞蹈病，以及治療或預防糖尿病性神經病。在腦卒中后的頭幾分鐘減少神經損傷，是獲得有效治療的重要策略。在腦卒中期間，血栓栓子封閉了動脈，中斷了局部腦區的氧及葡萄糖供給，從而導致梗死中心核的神經元的喪失。中心核中的細胞經壞死性機制，非常迅速地死亡。環繞著缺血梗死區的腦區，結構尚存，但(電傳導)功能終止(稱作半影)。半影是一種暫時的區域，它演變成梗死是一種相對進行性現象(Touzanietal.,Curr.Opin.Neurol.14:83-8，2001)。這一區域提供了挽救某些腦功能的可能性，處理半影的治療窗口大大長于處理梗死區。半影也可描述為供血受限的區域，能量代謝仍然保留。因此，半影區是神經保護治療及重新激活靜止神經元的因子如高壓氧的靶區。由此，中樞神經受損后立即的損傷也許不是可逆的，但加重腦損傷，主要是迷漫性腦缺氧/缺血事件鏈的進行，可以由有效的神經保護戰略加以防止。例如，在冠狀動脈旁路移植術(CABG)之前及期間給予神經保護劑，能夠有效地保護由腦血流短期改變(引起輕度缺氧/低糖狀態)造成的神經變性。如此，本發明的化合物能夠顯著地保護神經并在神經損傷后挽救神經元，因此特別可用于對腦卒中患者的投藥。用于本發明方法中的化合物的合成方法在本領域是眾所周知的。這樣的合成方案在美國數個專利中給予描述5,281,715、5,767,134、4,447,427、5,869,676及5,721,259。在此，它們以全文引為參考。在另一個方面，本發明涉及可用于本發明方法中的2-甲醛縮氨基硫脲的藥物組合物。本發明的藥物組合物包含一種或多種所述化合物及藥學上可接受的載體或稀釋劑。在此，"藥學上可接受的載體"包括任一和所有的溶劑、分散介質、涂層、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及延緩吸收劑和生理相容的類似物。載體的類型可根據打算的給藥途徑選擇。在不同的實施方案中，載體適合于靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、局部、經皮或口服給藥。藥學上可接受的載體，包括無菌水溶液或分散系及適用于臨時制備無菌注射溶液或分散系的無菌粉劑。這些介質及試劑用作藥學活性物質是本領域眾所周知的。除與活性化合物不相容以外，任何常規的介質或試劑都可考慮在本發明中的藥物化合物中的使用。補充的活性化合物也能被添加到這種組合物中。本發明的藥物組合物可通過任何手段給藥以實現其預定目的，例如，通過非腸道、皮下、靜脈內、肌內、腹膜內、透皮或經頰途徑。優選地，通過經口途徑給藥，并且可以是立即釋放或延遲釋放形式。給藥劑量將根據接受者的年齡、健康和體重，同時進行的治療的種類(如果有的話)，治療頻率，和所需作用的性質等的不同而異，并且通常由臨床醫師確定。本發明的藥物組合物通過制藥工業的普通技術生產，并且本發明不受這些技術的限制。將/優選將活性劑配制到用于經口給藥的片劑或膠囊中，其使用本領域已知方法制備，例如使用濕法造粒和直接壓片的方法。經口給用片劑使用本領域已知的任何適當的方法制備。例如參見Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEdition,A.Gennaro,Ed.,MackPub.Co.(Easton,PA19卯)，Chapters88-91，其全文作為參考被引入。通常，將活性成分，即，一種或多種縮氨基硫脲，與藥學可接受的賦形劑(例如粘合劑、潤滑劑等)混合并壓縮成片劑。優選地，通過為形成均勻粒子的濕法造粒技術或直接壓片法制備所述劑型。或者，可將活性成分與先前制備的非活性粒子混合。然后將潮濕粒子千燥，并使用適當的篩分設備進行過篩以提供粉末，然后根據需要將該粉末填充進膠囊中或者壓縮成基質片劑或錠劑。在一個方面，使用直接壓片法制備片劑。直接壓片法相對于濕法造粒法提供了許多潛在的優點，特別是關于生產容易性方面而言。在直接壓片法中，將至少一種藥學活性劑和賦形劑或其它組分通過不銹鋼篩如40目的鋼篩進行過篩。然后將過篩后的粒子加入到適當的摻混機中并摻混適當的時間。然后將摻混物在使用適當工具的旋轉壓片機上壓縮成片劑。或者，可將藥物組合物包含在含有微膠囊或小球的膠囊中。制備這些小球的方法是本領域已知的(參見Remington's,同上)。通過常規方法將小球填充進膠囊，例如明膠膠囊中。可注射的無菌溶液，可用所需的量將活性化合物摻入到藥學可接受的液體介質中并過濾除菌而制備。通常，將活性化合物摻入到含有基本分散介質的無菌媒介物中來制備分散系。在無菌粉劑用于制備可注射無菌溶液的情況下，優選的制備方法是真空干燥及冰凍干燥，這將生成活性成分加上來自其前述無菌過濾溶液的任何額外所需成分的粉劑。所述藥物組合物中的活性劑(即一或多種縮氨基硫脲)以治療有效量存在。"治療有效量"意指在劑量及所需時間段獲得期望的治療結果，該結果積極影響特定疾病狀態的過程的有效量。當然，活性劑的治療有效量可根據個體的疾病狀態、年齡、性別、體重及該活性劑在個體引起期望反應的能力的不同而異。劑量方案可被調整以提供最佳的治療反應。治療有效量也指治療上有益效果超過其毒性或有害性作用的量。在另一個實施方案中，活性劑以預防有效量被配制在組合物中。"預防有效量"意指在劑量及所需時間段獲得期望的疾病預防結果的有效量。通常，預防劑量低于治療有效量，這是因為該劑量用于對象發病之前或疾病的早期。組合物中活性化合物的量可根據個體的疾病狀態、年齡、性別及體重等因素的不同而異。劑量方案可被調整，以提供最佳的治療反應。本發明的劑量單位形式規格由以下指定并直接依賴于(a)活性化合物的獨特性質及想獲得的具體療效；(b)對個體治療敏感度方面，在組合這種活性化合物時技術上的內在局限。預期本發明的劑量單位將包含與目前在抗腫瘤治療中使用的量(例如Triapine,VionPharmaceuticals,Inc.)幾乎相同的量的活性劑。本發明的藥物組合物可對需要本發明化合物的有益效果的的任何動物給藥。所述動物優選是哺乳動物，最優選是人。本發明可通過下列的實施例進一步闡明，這些實施例不應解釋為局限性。本申請中所有參考文獻、專利及公布的專利申請特別地并以全文在此引作參考。實施例實施例1PAN-811與其它神經保護劑的神經保護效能比較本研究的目的是在阿爾茨海默病相關的氧化應激細胞模型中，比較PAN-811(3-氨基吡啶-2-羧醛縮氨基硫脲；C7H9N5S;MW495)與已知的神經保護劑，如維生素E，硫辛酸及銀杏的神經保護能力。細胞的分離及培養初生皮層神經元從17日齡大鼠胚腦分離，以每孔5萬個細胞接種到96孔板，在常規的神經基礎培養基(neurobasalmedium)中培養2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經基礎培養基半量換液兩次。用PAN-811、其它神經保護劑及過氧化氫處理PAN-811以lmg/ml(5mM)溶解于乙醇，并進一步以培養基稀釋到O.l]uM、lpM及10pM的終濃度。其它已知的神經保護劑被溶解到合適的溶劑中，并稀釋到指示的終濃度。神經元用PAN-8U、已知的神經保護劑或媒介物預處理24小時，然后進行過氧化氫(終濃度150pM)誘導的氧化應激。對照包括未處理的細胞(沒有化合物及過氧化氫處理)、僅僅用化合物處理的細胞、暴露于過氧化氫但無化合物的細胞。未處理的細胞被用作對照來評價毒性及改進的存活率。每個分析重復三次。細胞功能的評價24小時后，使用標準的MTS分析(Promega)評價存活率及線粒體功能。遵循制造商的操作規程。材料神經基礎培養基(Invitrogen);B27-AO(Invitrogen);PAN-811(VionPharmaceuticals,Inc.);過氧化氫(Calbiochem);乙醇(Sigma);維生素E(Sigma);硫辛酸(Sigma);銀杏(CVS);MTS分析試劑盒(Promega)。實驗以上述"研究設計"中描述的方法進行。PAN-811以lmg/ml(5mM)溶解于乙醇，并進一步以神經基礎培養基稀釋到O.lpM、lpM及10pM的終濃度。硫辛酸以240mM溶解于乙醇，并進一步以神經基礎培養基稀釋到10|iM、25pM及100pM的終濃度。維生素E以lOOmM溶解于乙醇，并進一步以神經基礎培養基稀釋到50nM、100pM、20(HiM及400pM的終濃度。銀杏以6mg/ml溶解于去離子水，并進一步以神經基礎培養基稀釋到2.5pg/ml、5pg/ml、25pg/ml及250pg/ml的終濃度。在處理結束時，用lOOpl新鮮的預熱神經基礎培養基加上B27(-AO)更換培養基。培養板放回到細胞培養箱(37'C，5。/。C02)—小時。之后，每孔中加入2(Hil的MTS試劑，培養板再放回到細胞培養箱(37。C，5。/。C02)兩小時。以BioRad讀板機(型號550)記錄每孔在4卯nm的吸收。僅含培養基的孔作為空白對照。每個數據點為3個單獨分析孔的平均值。未處理的細胞被用作計算細胞存活率及神經保護能力的對照。兩周齡原代培養物用于這一研究。結果參見圖l。結果PAN-811在l-10pM濃度時，顯示良好的神經保護能力，甚至是在苛刻的過氧化氫處理之下。維生素E及硫辛酸在苛刻處理之下，有最小的神經保護能力。銀杏在苛刻處理之下，顯示某種程度的神經保護。PAN-811在l-10nM終濃度時，顯示顯著的神經保護，甚至是在苛刻的過氧化氫處理之下。PAN-811的神經保護效能明顯超出其它已知神經保護劑，維生素E、硫辛酸及銀杏。實施例2PAN-811對神經細胞中產生活性氧(ROS)的影響本研究的目的是評價PAN-811在阿爾茨海默病相關的氧化應激細胞模型中減少ROS產生的能力。在本實施例中使用的材料與實施例1中使用的材料相同。初生皮層神經元從17日齡大鼠胚腦分離，以每孔5萬個細胞接種到96孔板，在常規的神經基礎培養基中培養2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經基礎培養基半量換液兩次。初生皮層神經元由HBSS緩沖液沖洗一次，用IO^iM5-(及6-)氯甲基-2，，7，-二氯二氫熒光素二乙酸酯，乙酰酯(CM-H2DCFDA)孵育以預裝載染料。之后細胞用HBSS緩沖液沖洗，用終濃度為0.1、1、5及10pM的PAN-811處理一小時，并進一步進行由300pM過氧化氫誘導的氧化應激兩小時。每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF熒光以BMG極星(polarstar)讀板機記錄，并用于評價細胞內ROS的生成。裝載了染料但未處理的細胞用作計算c-DCF熒光改變的對照。每一分析重復三次。結果每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF熒光以BMG極星讀板機記錄。含有細胞但無染料的孔作為空白對照。每個數據點是三個單獨分析孔的均值。加了染料但未處理的細胞用作計算c-DCF熒光改變的對照。兩周齡的原代培養物被用于本研究。CM-H2DCFDA是一種細胞滲透性的ROS指示劑，直到乙酸酯基團被細胞內酯酶去除并在細胞中出現氧化，CM-H2DCFDA方顯示出熒光。它被廣泛用于檢測細胞內及動物體內活性氧(ROS)的生成。在此，按照研究設計中描述的方法，它被用作評價PAN-811對神經細胞內ROS生成影響的工具。如圖2所示，PAN-811在降低過氧化氫誘導的ROS生成和神經細胞內基礎水平的ROS生成上，展示了良好的能力。使用緩沖液及PGE-300/EtOH替代PAN-811的平行對照實驗，顯示對細胞內的ROS生成無影響。實驗以不同批次細胞重復4次，獲得類似的結果。代表性的實驗參見圖2。PAN-811在原代神經細胞內明顯減低基礎水平的ROS生成(~50%;在10pM)及過氧化氫誘導的ROS生成(~30%;在10pM)。參考文獻GibsonGE，ZhangH，XuH，ParkLC,JeitnerTM.(2001).Oxidativestressincreasesinternalcalciumstoresandreducesakeymitochondrialenzyme(氧化應激增加內部鈣儲量和減少關鍵的線粒體酶).BiochimBiophysActa.Marl6;1586(2):177-89。ChignellCF，SikRH.(2003).Aphotochemicalstudyofcellsloadedwith2',7，-dichlorofuorescin:implicationsforthedetectionofreactiveoxygenspeciesgeneratedduringUVAirradiation(裝載有2，，7，二氯熒光素的細胞的光化學研究在UVA照射中檢測產生的活性氧的提示).FreeRadicBiolMed.Apr15;34(8):1029-34。實施例3PAN-811對缺氧或缺氧/低血糖癥誘發的神經毒性是一種潛在的神經保護劑。目的本研究的目的是理解PAN-811是否能夠在體外保護由缺氧或缺氧/低糖(H/H)導致的神經毒性。在相關的工作中，PAN-811對過氧化氫處理的原代神經元已顯示明顯的神經保護作用。本實施例中使用的材料與實施例1中所用的材料相同。LDH試驗試劑盒得自Promega。(縮寫BSS二平衡鹽液；CABG-冠狀動脈旁路移植術；d.i.v.-體外天數；EtOH-乙醇；H/I^缺氧/低糖；LDH-乳酸脫氫酶；MCAO中腦動脈閉塞；NB^4申經基質介質；NMDA二N-甲基-D-天冬氨酸；PEG二聚乙二醇)96孔培養板用于本實驗。皮質神經元以每孔5萬個細胞密度接種在聚-D-賴氨酸涂布的表面，培養在無血清培養基中(NB加上B27補充齊U)以獲得高富集神經元的培養物。培養神經元14d丄v.以上，以增加細胞對興奮氨基酸的易感性(Jiangetal.，2001)。6個重復孔作為一組處理以利于分析定量。如下表1所示，腦中葡萄糖濃度通常超過2.2mM。在缺血時，其濃度在中心核及半影分別下降到0.2mM及1.4mM。恢復循環后一至兩小時，葡萄糖濃度回復到正常水平(Folbergrovdetal.,1995)。表1.葡萄糖濃度(mmol/kg)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>為理解葡萄糖濃度對缺氧誘導的神經毒性的影響，我們己經檢測了不同劑量的葡萄糖。如圖3所示，與正常情況下葡萄糖濃度為25mM相比，葡萄糖濃度下降到2.9mM沒有導致神經細胞死亡。當葡萄糖濃度下降到0.4mM時，MTS分析顯示有強烈的細胞死亡出現。為模擬腦卒中的腦環境，我們建立了三種體外模型系統。極度H/H模型(0.4mM葡萄糖)是梗死中心核環境的模擬；輕度H/H模型(1.63mM葡萄糖)為MCAO期間半影區環境的模擬；而以單純缺氧模型(正常神經元下，體外葡萄糖的濃度為25mM)來模擬重新灌流后半影區的環境，這是因為在重新灌流后缺氧而不是能量衰竭是造成可能的細胞死亡的主要原因。對于極度H/H及輕度H/H而言，通過將葡萄糖的濃度分別降低到0.4mM及1.63mM獲得缺氧/低血糖癥。在使用前，將BSS(116.0mMNaCl,5.4mMKC1,0.8mMMgS04'7H20，l.OmMNaH2P04,1.8mMCaC12*2H20,26.2mMNaHC03及0.01mM甘氨酸)或含有25mM葡萄糖的BBS脫氣5分鐘。缺氧下培養板中的培養基用BBS或含有葡萄糖的BBS置換。同時，常氧下培養板中的培養基由未脫氣的BBS或含有葡萄糖的BBS置換。為造成細胞缺氧，將培養板置于密封的容器(模塊培養室-101TM，Billups-Rothenberg，Inc.),施加真空20分鐘以從培養基中去除氧及其它氣體，然后以30psi的壓力向容器內充填5%二氧化碳及95%氮氣1分鐘。以02指示器(FYRITE氣體分析器，Bacharach，Inc)測定容器內氧氣的含量為0。培養板置于室內6小時。作為實驗對照，重復的培養板維持在正常培養條件下(5%二氧化碳及95%環境氣體)同樣長的時間。6小時后從容器內取出處理的培養板，以含有25mM葡萄糖的終止液[添加1X丙酮酸鈉，10.0mMHEPES及1XN2補充的DMEM]，置換缺氧及常氧條件下培養物中的培養基，并培養在5%二氧化碳及95%環境氣體的條件中。用不同濃度的PAN-811及媒介物作為陰性對照處理神經元。以MK801作為陽性對照。在H/H侵害后的24或48小時，以MTS及LDH分析(見下文)來評價線粒體功能及細胞死亡。在單純缺氧模型中，以溶劑或PAN-811預處理神經元24或48小時。藥物處理在缺氧24小時期間及之后仍在持續。在缺氧侵害之后的24或48小時，評價細胞形態及功倉巨(MTS及LDH分析)。形態評估的神經細胞死亡。在缺氧之前，神經元是健康的，具有相亮(phase-brilliant)的體細胞(箭頭頭部)及完整的神經突起(空心箭頭)。背景上，這些突起及其分枝形成致密的網絡。缺氧導致細胞體的皺縮及神經突起與網絡的崩潰。5nM劑量的PAN-811及谷氨酸鹽NMDA受體拮抗劑MK801有效地避免了神經細胞的死亡，并部分保存了神經突起。MTS分析是一種測定代謝活性細胞中線粒體功能的比色分析。該檢測間接反映細胞存活率。MTS四唑化合物在代謝活性細胞的線粒體中，被還原為有色的可溶于組織培養基的甲月替(fomiazan)產物，其在490nm的吸收可被檢測。將20^1的MTS試劑(Promega)加到含有樣品的lOOpil培養基的96孔培養板的孔中。在增濕、5%二氧化碳、37°C條件下，孵育培養板1到2小時，直至充分呈現顏色。以Bio-Rad96孔讀板機記錄在490nm處的吸收。乳酸脫氫酶(LDH)分析是基于乳酸脫氫酶作用使NAD還原。得到的還原NAD(NADH)用于四唑鹽染料的化學計量轉換。如果分析從不同處理培養物取出的無細胞培養基等份，則活性可用作相關細胞死亡以及細胞膜完整性的指示。將50|11等份的培養基由每孔測試的96孔培養板的孔中轉移到未用過的培養板中的孔，并補入25pl等量混合的底物、酶及染料(Sigma)。在室溫下孵育20到30分鐘，之后于490nm波長處進行分光光度測定。結果單純缺氧模型以PAN-811在缺氧前預處理皮質神經元48小時。PAN-811于24小時缺氧期間及缺氧之后的48小時保留存在。如圖4所示，2)tiM劑量的PAN-811完全阻止了細胞死亡，但在50pM出現細胞毒性。用2jiMPAN-811、1:80綠茶或5pMMK801于缺氧24小時之前、期間和之后處理皮層24小時。在檢測的試劑中，PAN-811顯示了最高的效力，完全阻止神經細胞死亡及線粒體機能障礙。輕度H/H模型在受侵害之前及期間，PAN-811保護神經元免受輕度H/H誘導的神經毒性培養胚胎(E17)大鼠皮質神經元15天，以PAN-811及媒介物在缺氧/低血糖癥之前24小時和缺氧/低血糖癥期間(6小時)處理。在接受侵害后17小時，通過MTS及LDH分析評價結果。PAN-811在濃度為5pM時，完全保護了缺氧/低血糖癥誘導的線粒體機能障礙及神經細胞死亡，而1:1520倍稀釋的PEG:EtOH(相當于媒介物在5pMPAN-811中的量)，沒有形成這種保護。代表性數據見圖5。下面的表2總結了6次實驗的結果，濃度范圍覆蓋2-50jiM。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>**在03年7月13日及03年7月25日實驗中，檢測范圍的起始濃度為5pMPAN-811在受侵害期間，特別是侵害之后，保護細胞免受輕度H/H誘導的神經毒性神經元培養15天后，用PAN-811或媒介物PEG:EtOH(7:3)于6小時H/H之前處理24小時(之前組)。或者，神經元培養16天后，用上述試劑在6小時H/H期間處理(期間組)，在6小時H/H期間及H/H之后的48小時階段處理(期間及之后組)，或在H/H之后的48小時階段處理(之后組)。在H/H階段之后48小時，進行LDH分析。圖6中的結果表明，在H/H期間，特別是H/H之后處理神經元，PAN-811保護神經細胞死亡，但在H/H之前處理神經元，保護作用微不足道。極度H/H模型PAN-811在濃度《50iiM，未見神經保護作用(未示資料)。PAN-811在2pM時，對單純缺氧及輕度H/H誘導的神經毒性有完全的保護作用。PAN-811在100pM時，對極度H/H誘導的神經細胞死亡僅有部分阻止作用。因此，PAN-811不太可能與能量代謝有關。當缺氧或局部缺血侵害期間或之后給藥，PAN-811顯著保護神經細胞免于死亡。PAN-811的效力明顯高于MK801和/或綠茶。在長時間暴露(120小時)的情況下，5(HiM的PAN-811是神經毒性的。參考文獻Jiang,Z.-G.,Piggee,C.A.，Heyes,M.P.,Murphy,C.M.,Quearry，B.，Zheng，J.，Gendelman，H.E.，andMarkey，S.P.GlutamateisaprincipalmediatorofHIV-l-infectedimmunecompetenthumanmacrophageneurotoxidty(谷氨酸鹽是HIV-l感染的免疫活性人巨噬細胞神經毒性主要介質)丄Neuroimmunology117(12):97-107，2001。Folbergrov&,J.，Zhao,Q.，Katsura,K.,andSiesj6，B.K.N-tert-butyl-phenylnitroneimprovesrecoveryofbrainenergystateinratsfollowingtransientfocalischemia(N-叔丁基苯基硝酮改善大鼠在短暫的局部缺血后腦能量狀態的恢復).Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:5057-5061,1995。Touzani，O.，Roussel,S.，andMacKenzie，E.T.Theischemicpenumbra.(局部缺血半影)Curr.Opin.Neurol.14:83-88,2001。實施例4在短暫的局部腦缺血的體內模型中，PAN-811顯示顯著的神經保護作用在氧化應激及缺血的體外模型中，PAN-811已顯示顯著的神經保護作用。對該化合物的現有工作與已知的毒性譜及藥代動力學數據，強烈表明PAN-811用于治療腦卒中的潛力。使用的材料與上述實施例中使用的材料相同。在本實施例中，MCAO用作中腦動脈閉塞的縮寫。在著手體內研究前，在數種神經變性的細胞模型中檢測PAN-Sll。由胚齡為15日齡的Sprague-Dawley大鼠胚胎制備富集的神經元培養物。以無菌技術，從子宮中取出鼠胚，置于無菌神經元培養基中。在解剖鏡下，從各胚胎中取出腦組織，小心去除腦膜及血管。在顯微鏡下通過大致解剖分離小腦，僅小腦組織用于培養。研碎組織，游離細胞，以每孔5Xl()S細胞的密度接種到聚-L-賴氨酸預涂布的48孔培養板上。培養物在含有等量Eagle氏基礎培養基(無谷氨酰胺;)和Ham氏F-12k培養基的溶液中維持，該溶液補充有10%熱滅活的馬血清、10%胎牛血清、600^/ml葡萄糖、100|ag/ml谷氨酰胺、50U/ml青霉素及50pg/ml鏈霉素。48小時后，加入l(HiM阿糖胞苷，以抑制非神經細胞的分裂。培養7天的細胞，用于實驗。用不同濃度(0-100iiiM)的PAN-811處理細胞24小時。以MTT分析確定細胞存活率。對4種興奮毒性的體外模型進行研究。暴露細胞于H/H條件3小時，或以lOOjiM谷氨酸鹽、l(iMstaurosporine、lOpM藜蘆定(veratridine)處理45分鐘。所有細胞與或不與10pMPAN-811的Locke氏溶液共同處理。在各興奮毒性暴露結束時，更換條件培養基(原始培養基)。將細胞孵育在無外加葡萄糖的Locke氏溶液，5%二氧化碳及95%氮氣飽和的增濕密閉容器中3小時來誘導H/H。興奮毒性侵害24小時后，評價細胞存活率。應用以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鹽(MTT，SigmaChemicalCo.Ltd.,St.Louis,Mo)為基礎的四唑鹽比色分析，定量評價細胞損傷。簡言之，將染料添加到各孔(終濃度1.5mg/ml)，細胞用MTT酸化的異丙醇(0.1NHC1的異丙醇)孵育細胞，然后用96孔讀板機測定各樣品在540nm的吸收強度。值表示為維持在各板上的媒介物處理的對照細胞的百分比，并計算細胞存活率百分數的變化。體內研究36只雄性Sprague-Dawley大鼠(270-330克，CharlesRiverLabs,Raleigh,VA)用于本項研究。以5%氟烷誘導麻醉，和在2%氟垸的氧氣中維持。以恒溫加熱系統(HarvardApparatus,SouthNatick,MA)，使體溫在整個手術過程中保持在正常溫度(37il。C)。食物及水于手術前后隨意攝取，動物在12小時明暗周期環境中，分籠飼養。麻醉后，使用中腦動脈閉塞(MACO)的絲阻方法(filamentmethod)來實現短暫局部缺血并重灌流。簡言之，分離右側外頸動脈并凝結其分支。以3-0未涂布的圓頭單絲尼龍縫合線，經外頸動脈插入內頸動脈，并向前推進(由頸動脈分叉算起約22mm)直至遇到輕微阻抗，這樣封閉了MCA的起端。血管內縫合線留在原處2小時，然后收回以允許血液重新灌流到MCA。MCAO手術后，動物放到維持22'C室溫的恢復籠中。在2小時缺血階段及缺血后最初6小時，也用75瓦加熱燈直接放在每個籠子的頂部，以保證整個試驗中動物的體溫恒定在正常體溫。在MCAO之前，經靜脈內注射，以每公斤體重1毫克PAN-811處理大鼠10分鐘。制備PAN-811的70。/。PEG300，30。/。EtOH的儲液。在注射前，用無菌鹽水將該儲液稀釋5倍(終濃度為lmg/ml)。對每只大鼠腦而言，缺血性腦損傷的分析被測量為總的梗死體積的函數。這從氯化2,3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色7個冠狀切片(2毫米厚)獲得。腦切片采集區由額極l毫米處開始，終止于皮質小腦接合處的嘴端。使用計算機輔助影像分析計算梗死體積。簡言之，每一TTC染色的前腦切片的后表面被數字化成像(LoatsAssociates,Westminster,MD)，并定量缺血損傷的面積(以平方毫米計)。結果體外研究PAN-811的神經毒性結果見圖l。實際上，PAN-811在濃度最高為100pM時，僅有輕微的毒性。在檢測的最高濃度，最大毒性僅為8.7%(見圖7)。PAN-811的神經保護PAN-811顯示明顯地保護神經元免受不同興奮毒的侵害(圖2)。以10pMPAN-811預處理神經元保護缺氧/低糖(保護約92。/。)，100pM谷氨酸鹽(保護約75%)，lnMstaurosporine蛋白激酶C抑制劑及細胞凋亡誘導齊U(保護約47。/。)及l(HiM藜蘆定鈉通道阻斷劑(保護約39。/。)處理3小時誘導的損害(見圖8)。體內研究本實驗的結果見表3。36只大鼠用于本試驗，而ll只大鼠因以下原因被排除在外4只在無出血并發癥下死于嚴重卒中，4只出現亞急性出血(SAH)(24小時內有3只死亡)、l只由于手術中突發火災演習、l只鼠由于統計定為無關項、另l只死于過量的氟垸。在這7只死亡的大鼠(4只無SAH，和3只有SAH下死于嚴重卒中)中，6只是未處理(媒介物)的大鼠，僅1只是PAN-811處理的。媒介物處理的大鼠的平均梗死體積為292.96mm3，范圍在198.75-355.81。PAN-81l處理的大鼠的平均梗死體積為225.85mm3，范圍在42.36-387.08。這顯示23。/。的神經保護(p〈0.05)。由于原因未知，在對照組觀察到比正常測量更嚴重的損傷。因此，PAN-811處理動物的梗死尺寸也比預計的神經保護要顯著得多。盡管如此，在兩組中的差異性是極好的(SEM為10X或更少)，差異性結果與先前發表的研究一樣好，如果不是更好的話。在體外及體內模型系統中，PAN-811的耐受良好，并且相對無毒。以10lnMPAN-811預處理神經元，明顯保護神經元免受導致神經變性的興奮毒性的侵害。在短暫局部腦缺血前10分鐘以單劑量(lmg/ml)的PAN-811預處理大鼠，可減小23%的平均梗死體積。參考文獻WilliamsAJ,DaveJR,PhillipsJB,LinY,McCabeRT，andTortellaFC.(2000)Neuroprotectiveefficacyandtherapeuticwindowofthehigh-affinityN-methyl-D-aspartateantagonistconantokin-G:invitro(primarycerebellarneurons)andinvivo(ratmodeloftransientfocalbrainischemia)studies(高親和性N-甲基-D-天冬氨酸鹽拮抗劑conantokin-G的神經保護功效和治療窗口體夕卜(原代小腦神經元)和體內(短暫局部腦缺血大鼠模型)研究).JPharmacolExpTher.294(l):378-86.表3媒介物處理PAN-811處理大鼠編號梗死體積大鼠編號梗死體積R28198.75R2142.36R17208.03Rl126.42R2267.38R30143.74Rll270.89R24158.83R34282.51R3196.18R19308.19R26200.08R27308.45R23218.54R36334.81R20221.46RIO339.85R25224.32R4347.89R31255.36R32355.81R5267.40R13344.47R16375.59R8387.08均值292.96均值225.85標準差53.60標準差96.67標準誤16.16標準誤25.84數量11數量14P值0.05%保護23%表3:媒介物和PAN-811處理的大鼠的梗死體積(以mmS表示)。大鼠在MACO前用lmg/mlPAN-811處理10分鐘，手術之后24小時測定梗死體積。實施例5PAN-811保護神經元免受過氧化氫誘導的氧化應激本研究的目的是在阿爾茨海默病相關的氧化應激細胞模型中，評價PAN-811作為神經保護劑的功效。神經保護及細胞毒性被測定。不同的溶劑被檢測，以確定是否合適作為投遞PAN-811的媒介體。使用的材料與其它實施例中使用的材料相同。初生皮層神經元從17日齡大鼠的胚腦分離，并以每孔5萬個細胞接種到96孔板，在常規的神經基礎培養基中培養2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經基礎培養基半量換液兩次。PAN-811以lmg/ml(~5mM)溶解于乙醇或DMSO中，以5mg/ml(25mM)溶解于PEG-300/乙醇(70。/。/30。/q)中，并進一步以培養基稀釋到lpM、5pM、20pM及50juM的終濃度。神經元用PAN-811或媒介物處理24小時，之后進行由過氧化氫(終濃度60-70)iiM)誘導的氧化應激。對照包括未處理的細胞(沒有PAN-811及過氧化氫處理)、僅僅用PAN-811處理的細胞和暴露于過氧化氫但沒有PAN-811的細胞。未處理的細胞用作對照以評價神經元毒性及改進的存活率。每個分析重復3次。等體積的溶劑(乙醇、DMSO與PEG-300/乙醇)被加到細胞中以測定溶劑對分析的影響。24小時后，使用標準的MTS分析(Promega)評價培養物的存活率及線粒體功能。遵循制造商的操作規程。結果實驗1實驗以上述研究設計中描述的方法進行。在處理結束時，用ioopi新鮮的預熱神經基礎培養基加上B27(-AO)更換所有的處理和培養基。培養板被放回到37。C，5%002的細胞培養箱一小時，然后每孔中加入2(^1的MTS試劑，培養板繼續在37°C，5%(302的細胞培養箱中培養兩小時。以BioRad讀板機(型號550)記錄每孔在490nm的吸收。僅含培養基的孔作為空白對照。每個資料點是三個單獨分析孔的平均。未處理的細胞被用作計算細胞存活率及神經保護能力的對照。三周齡的原代培養物用于這一研究。結果參見圖9。實驗2實驗以實驗1的相同方法進行。兩周齡的原代培養用于這一研究。結果請見圖10。在這些實驗中，所有三種溶劑在相當于PAN-811終濃度l-10pM的稀釋度時，對本分析系統有最小的影響。DMSO在相當于PAN-811終濃度20pM或以上的稀釋度時，顯示一定水平的神經保護。乙醇和PEG-300/乙醇在相當于PAN-811終濃度50pM的稀釋度時，顯示一定水平的神經保護能力。PAN-811在l-10pM時，顯示好的神經保護。與單獨乙醇比較，PAN-811在PEG-300/乙醇中有較好的溶解性。PAN-811在l-10pM的終濃度時，顯示良好的神經保護能力。PEG-300/乙醇在相當于PAN-811l-20^M的稀釋度時，對分析系統有最小的干擾，因此是被檢3種溶劑中最好的PAN-811溶劑。本領域技術人員很容易得知本發明非常適合于實現目標，并獲得最終結果和所述優點以及其中內在的東西。對本領域技術人員顯而易見的是，在實施本發明時，可有不同的修飾及變更而無需背離本發明的精神及范圍。對本領域技術人員而言可以在包含權利要求書中限定的本發明實質的范圍內進行這里所述的修改和其他的應用。權利要求1.緩解、治療或預防由缺血狀況引起的神經元損傷的方法，該方法包括對有需要的病人投藥治療有效量的式I的化合物或其藥學可接受的鹽或前藥其中HET是含1或2個選自N和S的雜原子的5或6元雜芳基殘基，并且任選地被氨基取代；并且R為H或C1-C4-烷基。2.權利要求1的方法，其中對所述病人投藥的所述化合物或其鹽或前藥由式II表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R是H或CrCr烷基；并且R1、R2和R3獨立地選自H和氨基。3.權利要求1的方法，其中對所述病人投藥的所述化合物或其鹽或前藥由式III表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R是H或d-C4-烷基；并且Ri和R2獨立地選自H和氨基。4.權利要求1的方法，其中對所述病人投藥的所述化合物或其鹽或前藥由式IV表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>IV其中R是H或Q-Cr烷基。5.權利要求1的方法，其中對所述病人投藥的所述化合物或其鹽或前藥由式V表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>V其中R是H或d-C4-烷基。6.權利要求1的方法，其中對所述病人投藥的所述化合物或其鹽或前藥由式VI表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R是H或Q-CV烷基。7.權利要求1的方法，其中對所述病人投藥的所述化合物或其鹽或前藥由下式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>8.權利要求2的方法，其中R是甲基，并且RpR2和R3是H。9.權利要求3的方法，其中R是甲基并且Ri和R2是H。10.權利要求4的方法，其中R是甲基。11.權利要求5的方法，其中R是H。12.權利要求6的方法，其中R是H。13.式I的化合物，其中HET是含1或2個選自N和S的雜原子的5或6元的未取代的雜芳基殘基；并且R為H或d-C4-垸基。14.權利要求13的化合物，其中HET是吡啶、哌嗪、噻唑或咪唑。15.權利要求14的化合物，其中R是甲基。16.藥物組合物，其包括權利要求13、14或15所述的一種或多種化合物以及藥學可接受的載體。全文摘要本發明涉及通過以某些縮氨基硫脲化合物投藥給需要的病人來治療或預防缺血相關(如神經細胞缺氧和/或低糖)疾病的方法。更特別地，本發明涉及預防或治療某些缺血相關疾病的方法，所述疾病包括但不限于阿爾茨海默病，帕金森氏綜合癥，和由于如下所述狀況導致的缺血疾病冠狀動脈旁路移植術、心搏停止導致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內血管畸形破裂造成的腦出血、顱內動脈瘤破裂造成的蛛網膜下腔出血、高血壓性腦病、頸動脈狹窄或阻塞造成的腦缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。文檔編號A61K31/17GK101365436SQ200680042845公開日2009年2月11日申請日期2006年11月20日優先權日2005年11月18日發明者侯賽因·A·甘巴里,姜志鋼,畢堅·阿爾瑪森,潘魏英,邁克爾·S·萊博維茨申請人:萬能藥制藥公司