治療缺血相關疾病的方法

專利名稱：治療缺血相關疾病的方法
技術領域：
本發明涉及治療缺血相關的疾病及紊亂的方法，包括由于突然喪失氧氣導致的神經及心臟疾病，以及像阿爾茲海默病這樣的變性疾病。
背景技術：
中樞神經系統(CNS)由脊髓、腦及視網膜構成，含有上千億個神經細胞(神經元)，由此形成勝任復雜功能的網絡。CNS神經元的存在及生理功能的實現需要能量支持。中樞神經細胞能量的唯一來源通常認為來自血液的葡萄糖及氧氣。如果全部或任何部分中樞神經系統的血液供應被關閉，那么受累的神經元會缺氧及低糖(又稱缺血)，以至迅速變性。臨床上，通常將神經系統缺乏血液供應的情況稱為“腦卒中”。僅僅是氧氣供應的中斷，則稱為“缺氧”，這發生在昏厥、窒息或溺水。單獨是葡萄糖的供應中斷，則稱為“低糖”，比如出現在糖尿病患者服用了過量的胰島素。上述所有情況，都涉及到能量短缺，在臨床上被認為是腦損傷的潛在原因。下文中，“能量短缺”和“缺血”會交替使用，但都意指使中樞神經系統所需能量短缺的任意狀況。
幾年來，神經科學家在理解能量短缺導致的神經變性的機理方面有了長足的進展。已經認識到，谷氨酸鹽在中樞神經系統正常和健康的情況下是一種重要的興奮神經遞質，但在缺血時則起著神經毒性作用，稱為“興奮毒性(excitotoxicity)”。通常，谷氨酸鹽存在于細胞內，僅僅在突觸連接處微量釋放，作用到毗鄰含有谷氨酸鹽受體的神經元以傳遞神經信號。在正常情況下，釋放到細胞外液的谷氨酸鹽在數毫秒時間內會以一種高效的轉運過程被轉運回神經元內。
只要這種轉運過程工作正常，谷氨酸鹽的興奮毒性潛能就會被遏制。然而，這種轉運過程是需要能量的，所以在缺血(能量短缺)的情況下，谷氨酸鹽轉運失能，已經釋放作為遞質的谷氨酸鹽分子則會在細胞外的突觸液中蓄積。這使得谷氨酸鹽持續與興奮受體接觸，讓這些受體處于過度刺激狀態，這種情況下神經元過度興奮導致死亡。兩個額外的因素使情況更加復雜和惡化(1)受刺激過度的神經元在另外的突觸連接處釋放過量的谷氨酸鹽，使更多的神經元處于過度刺激狀態，神經毒積累范圍超過初始的缺血區；和(2)與正常的神經元相比，受過度刺激的神經元更迅速消耗葡萄糖或氧氣，這加速了有限能源的消耗，并進一步損害谷氨酸鹽的轉運過程。因此，象在腦卒中、心跳停止、昏厥的缺氧或低糖這樣能量不足情況下導致的腦損傷是由一種復合的機制造成的；初始的原因是缺血本身，但由此導致的谷氨酸鹽轉運系統失靈及谷氨酸鹽介導的興奮毒性事件級聯反應很大程度上為隨后的腦損傷負責。
除上述情況外，最近已經注意到神經元使用能量基質(葡萄糖及氧氣)來維持其能量水平的能力的各種缺陷還可以激發導致神經元死亡的興奮毒性過程。據推定，這是出現在象阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、杭廷頓氏舞蹈病及肌萎縮性脊髓側索硬化這樣的神經疾病中的神經變性的機制。例如，在患阿爾茲海默病病人腦活檢組織中，已發現細胞內能量代謝缺陷的證據，并被建議引發谷氨酸鹽興奮毒性潛能釋放導致阿爾茲海默病中神經元的死亡，從而通過與能量關聯的興奮毒性過程來解釋。也有報道，在帕金森氏綜合癥及杭廷頓氏舞蹈病中細胞內存在能量代謝的內在缺陷的證據。因此，防范這些疾病中神經變性的合理治療策略，將包括糾正能量缺陷或防止興奮毒性神經變性的方法。
神經變性疾病為特征在于正常神經元功能改變，大多數情況下導致神經死亡的一組疾病(大多數這些疾病，尤其在晚期與嚴重的神經損傷有關)。在大多數情況下，致病原因未知而且疾病是進行性發展的。神經變性疾病的結果會毫無例外地出現嚴重的情感、身體及財政方面壓力，不僅影響個體，也造成社會負擔。
發展成神經變性紊亂(特別是阿爾茲海默病或帕金森氏綜合癥)的最一致的危險因素是年齡的增長。一個世紀以來，在工業化國家中，65歲及以上人口的增長率已經遠遠超過人口整體的增長率。這樣，可以預料再過幾代人，老年人口的比例將加倍；與之相伴的是可能患神經變性疾病人群的比例亦會加倍。這種預測是醫學界及法律制定者擔憂加劇的中心點，因為很容易預料與傷殘性疾病有關的，給病人、福利事業(caregivers)及社會的情感、身體及財政帶來的負擔會大幅度增加。事實上，要解決這種問題，目前已有數種已獲批的藥物在某種程度上可以減輕數種神經變性疾病的癥狀，這些藥物的長期使用經常有一定程度的副作用，似乎無一可以終止變性進程。與此有關的是，我們對于神經變性疾病中神經元死亡的原因及機制的了解有限阻礙著開發有效的預防或保護性治療。盡管前景黯淡，數個神經生物學的突破已經使我們比以往更趨近揭開數種神經變性疾病的秘密及獲得有效治療戰略的那一天。
在開發保護及減少CNS缺血相關的神經元損傷的方法方面，已取得了重要的進展。該領域中最活躍的研究涉及使用受體特異性的拮抗藥物(藥理學術語，為一種占據和封閉細胞表面上的某種受體而不引發該受體的活性的藥物，稱為該受體的拮抗劑)在谷氨酸鹽受體處抑制興奮活性的方法。能夠介導興奮毒性神經變性的谷氨酸鹽受體，廣義分為NMDA及非NMDA受體兩大類。NMDA受體是以N-甲基-D-天冬氨酸鹽命名，這類藥物在自然情況下不存在于腦內，但發現可以很強地結合到谷氨酸鹽受體上，因此與之結合的受體稱為NMDA受體。近來非NMDA類谷氨酸鹽受體又分為兩種不同類型，一種是KA(紅藻氨酸)受體，另一種是AMPA受體(曾稱為QUIS受體)。
NMDA受體拮抗劑在體外實驗及在許多體內動物模型中，一再表明可以保護CNS免受缺血性神經變性的危害；然而，近來也有各種證據表明，NMDA受體拮抗劑對于一種主要類型的缺血-“彌漫性缺血”可能是無效的，而對另一種主要的缺血“病灶性(focal)”缺血僅僅提供部分保護。進而，NMDA拮抗劑必須在缺血發作后立即給藥，才能提供顯著的保護。有關非NMDA拮抗劑的實驗數據更有限，但少數體內動物實驗研究表明，這些拮抗劑即使是在缺血事件發生后給藥仍可對缺血性神經變性提供顯著的保護。
盡管單獨使用NMDA或非NMDA拮抗劑，宣稱能夠對CNS缺血提供實質性的保護，但越來越多的證據表明，它們單獨使用的保護程度是相對有限的。
谷氨酸鹽受體拮抗劑作為神經保護劑抵抗缺血性神經變性的突出限制是，它們僅暫時使神經元與變性隔離；它們既沒有更正能量短缺，也沒有更正隨著能量短缺繼發而來的其它錯亂。因此，盡管這些拮抗劑的確在動物模型中對缺血性神經變性提供了某種程度的保護，但如上所述，其保護是不完全的，在某種情況下僅延緩了變性的始發時間。但是，重要的是注意，如果在這延緩的期間中有其它藥物或方法能夠提供額外和/或持續的保護，那么使變性的始發時間延緩也許是很有價值的。
在大多數缺血研究中尚未給予足夠解決的一個關鍵因素是涉及損傷(缺血)事件的給藥時間。這是一個非常重要的考量；盡管某些缺血事件可以預測(如心臟打開手術)，但絕大多數的缺血事件是不能預計的，而且在大多數情況下，治療僅僅在缺血事件發生的過程中或之后開始。因為缺血發生后CNS細胞開始非常迅速地變性，所以很明確尚需要新的神經保護方法，以在CNS變性開始之后給藥仍能奏效。
另一個重要的考慮是，缺血僅僅是短暫的(如在心動停止的發作期)，還是持續的(如CNS血管的血栓性或栓子性阻塞之后)。如果缺血是短暫的，在事件后立即恢復攜帶氧氣及葡萄糖的血液對CNS的供給，防止神經變性或促進缺血侵害恢復的藥物經血液循環可以達到缺血組織。
如果腦區的血液供應被凝血塊永久阻斷，那么現有方法不可能阻止缺血區中心的神經變性，因為缺血組織永久性喪失氧氣及葡萄糖，而藥物無法經阻斷的血管到達缺血組織。然而，在環繞著缺血區邊緣存在著一個大的組織區域，稱作半影(penumbra)，這里可以得到毗鄰CNS區域的血液，這一組織區域是藥物治療的潛在靶。同樣，現在正檢測和研發用于治療心臟病發作的溶解凝血塊藥物(溶栓劑，如鏈激酶及組織纖維蛋白溶酶原激活劑)，以恢復腦卒中后給CNS的血液供應。當這些藥物廣泛用于人體的CNS時，利用這些藥物可使血管再通，這樣缺血的CNS組織不僅可以獲得氧氣及葡萄糖，同時亦可得到這里公開的神經變性保護或促進缺血侵害后恢復的藥物。
最后，在特殊情況下，如給眼睛視網膜供血的主要動脈出現血栓阻塞，這里公開的藥物會有幫助。當這種血管阻塞時，直接注射本發明藥物于眼睛的玻璃體(即眼球內的清亮液體)以投藥于缺血的視網膜是可能的。藥物可以迅速地由玻璃體擴散進入視網膜。
開發能夠預防或治療不管是急性還是慢性缺血事件的疾病/紊亂后果的治療劑，將是極受歡迎的。
發明概述本發明涉及以通式I化合物或其藥物前體投藥給所需病人以治療缺血相關疾病的方法 通式I其中
E是氧、硫、NH或N-C1-6烷基；R1、R2、R3和R4獨立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個另外選自氮、氧及硫的雜環原子；并且HET為任選取代的5到7元雜芳香基殘基，該雜芳香基殘基含有1到4個選自氮、氧或硫的雜原子。
優選實施方案涉及用于本發明方法的組合物，其中HET是下列通式的殘基 其中m是0或1；當m為0時，Z1、Z2及Z3獨立地選自N、O、S或CR，或當m為1時，Z1、Z2及Z3獨立地選自N或CR；R每次出現時，獨立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基(thiol)、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基；并且x為由0到4的整數。
更優選的實施方案包括組合物的應用，其中HET殘基獨立地選自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且R1、R2、R3和R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子。
本發明的另一實施方案涉及通過對需要的病人給藥下列通式II的化合物或其藥物前體以治療缺血相關疾病的方法 通式II其中R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷酰基，或者NR1R2組合形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子，并且x為由0到5的整數。
并且，此處更具體其中x為0、1、2或3R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子。
本發明另一實施方案涉及通過對需要的病人給藥下列通式III的化合物或其藥物前體以治療缺血相關疾病的方法
通式III其中R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子；R6為氫、羥基、氨基或C1-8烷基；R5及R7獨立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基。
本發明最優選的實施方案涉及通過對需要的病人給藥具有下列通式的PAN811(3-氨基吡啶-2-羧醛縮氨基硫脲)以治療缺血相關疾病的方法 本發明的優選實施方案涉及治療特定的缺血相關疾病的方法，這些疾病包括但不限于阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側枝架橋手術、心搏停止導致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內血管異常破裂造成的腦出血、顱內動脈瘤破裂造成的蛛網膜下腔出血、高血壓性腦病、頸動脈狹窄或阻塞造成的腦缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性，心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
附圖簡述

圖1為用PAN-811(A)或已知的神經保護劑維生素E(B)、硫辛酸(C)或銀杏(Ginkgo Biloba)(D)預處理，隨后用過氧化氫處理的細胞存活率(左版面)及神經保護能力(右版面)的代表性圖示。
圖2為PAN-811對神經細胞中產生ROS的影響的代表性圖示。(A)PAN-811對神經細胞中產生過氧化氫誘導的ROS的影響。(B)PAN-811對神經細胞中產生基礎水平的ROS的影響。
圖3為在缺氧情況下神經毒性對葡萄糖濃度的依賴性的代表性圖示。
圖4為細胞在缺氧情況下有或沒有神經保護劑MK-801及PAN-811的代表性組織學影像。
圖5為在常氧情況下及缺氧情況下PAN-811的神經保護作用的代表性圖示。
圖6為在缺氧/低糖情況下PAN-811毒性的代表性圖示。
圖7為輕度缺氧/低糖情況下PAN-811對神經細胞死亡的保護作用的代表性圖示。
圖8為腦皮質神經元被PAN-811處理24小時時，PAN-811神經毒性的代表性圖示。
圖9為PAN-811對缺血產生毒性的保護作用的代表性圖示。
圖10為在用PAN-811或溶劑預處理，然后用過氧化氫處理后的細胞存活率的代表性圖示。
圖11為在用PAN-811或溶劑預處理，然后用過氧化氫處理后的細胞存活率的代表性圖示。
發明詳述本發明的特點及其它細節，現在將給予更具體的描述，并將在權利要求書中指出。應當理解，本發明的具體實施方案由說明方式展示的而非對本發明的限制。本發明的主要特點可被用于不同的實施方案而不偏離本發明的范圍。
缺血相關紊亂或疾病的病理學，涉及通常由于血管狹窄或阻塞導致的體內器官、組織或機體的部分血液供應減少，例如視網膜病、急性腎衰竭、心肌梗塞及腦卒中。這可以是急性發作(如心臟病發作)或慢性過程(如神經變性疾病)的結果。
本發明涉及將通式I化合物或其藥物前體給藥到所需病人以治療缺血相關疾病的方法 通式I其中E是氧、硫、NH或N-C1-6烷基；R1、R2、R3和R4獨立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子；并且HET為可任選取得的5到7元雜芳香基殘基，該雜芳香基殘基含有1到4個選自氮、氧或硫的雜環原子。
優選的實施方案涉及用于本發明方法中的組合物，其中HET是下列通式的殘基
其中m是0或1；當m為0時，Z1、Z2及Z3獨立地選自N、O、S或CR或當m為1時，Z1、Z2及Z3獨立地選自N或CR；R每次出現時，獨立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基；并且x為由0到4的整數。
更優選的實施方案包括使用組合物，其中HET殘基獨立地選自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且R1、R2、R3和R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子。
本發明的另一實施方案涉及通過給藥通式II化合物或其藥物前體到所需病人以治療缺血相關疾病的方法 通式II其中R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷酰基，或者
NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子，并且x為由0到5的整數。
并且，更具體的其中x為0、1、2或3，R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子。
本發明的另一實施方案涉及通過給藥通式III的化合物或其藥物前體給所需病人來治療缺血相關疾病的方法 通式III其中R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8成環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個額外選自氮、氧及硫的雜環原子；R6為氫、羥基、氨基或C1-8烷基；R5及R7選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基。
本發明最優選的實施方案涉及通過給藥具有下列通式的PAN811(3-氨基吡啶-2-羧醛縮氨基硫脲)給所需病人以治療缺血相關疾病的方法 本發明的優選實施方式涉及治療特定缺血相關疾病的方法，所述疾病包括但不限于阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側枝架橋手術、心博停止導致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內血管異常破裂造成的腦出血、顱內動脈瘤破裂造成的蛛網膜下腔出血、高血壓性腦病、頸動脈狹窄或阻塞造成的腦缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，粥樣硬化、脈管炎、斑變性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
用于本發明方法中的化合物的合成方法在本領域是眾所周知的。這樣的合成方案在美國數個專利中給予描述5,281,715、5,767,134、4,447,427、5,869,676及5,721,259。在此，它們以全文引為參考。
藥物組合物本發明的另一個方面，涉及用于本發明方法中的縮氨基硫脲的藥物組合物。本發明的藥物組合物通常包含用于本發明方法中的化合物及藥學上可接受的載體。在此，“藥學上可接受的載體”包括任一和所有的溶劑、分散介質、涂層、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及延緩吸收劑和生理相容的類似物。載體的類型可根據打算的給藥途徑選擇。在不同的實施方案中，載體適合于靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、局部、經皮或口服給藥。藥學上可接受的載體，包括無菌水溶液或分散系及適用于臨時制備無菌注射溶液或分散系的無菌粉劑。這些介質及試劑用作藥學活性物質是本領域眾所周知的。除與活性化合物不相容以外，任何常規的介質或試劑都可考慮在本發明中的藥物化合物中的使用。補充的活性化合物也能被添加到這種組合物中。
治療用藥物組合物通常在制造及儲存情況下必須是無菌及穩定的。這種組合物能夠配制成溶液、微乳狀液、脂質體或其它適合于高濃度藥的有序結構。載體可以是含有，例如水、乙醇、多羥基化合物(如丙三醇、丙二醇、液狀聚乙二醇及類似物)及其它適合的其混合物的溶劑或分散介質。例如，適合的流動性，可以通過使用象卵磷脂這樣的涂層，在分散系中保持所需顆粒的尺寸及使用表面活化劑來維持。在許多情況下，更優選在組合物中包含等滲劑，如糖類，象甘露醇及山梨(糖)醇這樣的多醇或氯化鈉。可注射成份的延遲吸收可以通過在組合物中包含一種延緩吸收劑，如單硬脂酸鹽或明膠來實現。此外，化合物能以隨時間而釋放的劑型給藥，例如在包含緩釋聚合物的組合物中。活性化合物可與載體一起制備，以防化合物迅速釋放，諸如這種控制釋放的劑型，包括植入物及微膠囊化投遞系統。生物可降解、生物相容的聚合物可用于此，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸、聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。制備這些劑型的許多方法是本領域眾所周知的。
可注射的無菌溶液，可用所需的量將活性化合物與上述列舉的成分之一或其組合(視需要)摻入在合適溶劑中，之后過濾除菌而制備。通常，將活性化合物摻入到含有基本分散介質及其它所需的上述列舉成分的無菌媒介物中來制備分散系。在無菌粉劑用于制備可注射無菌溶液的情況下，優選的制備方法是真空干燥及冰凍干燥，這生成活性成分加上來自其前述無菌過濾溶液的任何額外所需成分的粉劑。
取決于給藥途徑，化合物可用材料涂布以保護其免受酶、酸及其它可以失活該試劑的自然條件作用的材料。例如，可將化合物以適當載體或稀釋劑與酶抑制劑共同給藥或以合適的載體例如脂質體給藥于對象。藥用稀釋液包括鹽和水性緩沖液。酶抑制劑包括胰腺的胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟代磷酸鹽(DEP)和抑肽酶(trasylol)。脂質體包括油包水-水包油乳狀液(water-in-oil-in-water)及常規的脂質體(Strejan，etal.，(1984)J.Neuroimmunol 727)。分散系也可用丙三醇、液狀聚乙二醇及其混合物和油來制備。在通常的儲存及使用條件下，這些制備物中可含防腐劑，以防止微生物的生長。
組合物中的活性劑(即一或多種縮氨基硫脲)，優選以治療有效量配制在組合物中。“治療有效量”意指在劑量及所需時間段獲得期望的治療結果，從而影響特定疾病狀態的療程的有效量。活性劑的治療有效量可根據個體的疾病狀態、年齡、性別、體重及該活性劑在個體引起期望反應的能力的不同而異。劑量方案可被調整以提供最佳的治療反應。治療有效量也指治療上有益效果超過其毒性或有害性作用的量。在另一個實施方案中，活性劑以預防有效量被配制在組合物中。“預防有效量”意指在劑量及所需時間段獲得期望的疾病預防結果的有效量。通常，預防劑量低于治療有效量，這是因為該劑量用于對象發病之前或疾病的早期。
組合物中活性化合物的量可根據個體的疾病狀態、年齡、性別及體重等因素的不同而異。劑量方案可被調整，以提供最佳的治療反應。例如給藥可以是單次團注(bolus)、一段時間內數次分劑量給藥，或根據治療緊急狀況成比例地加減劑量。特別有利的是，以容易給藥和均一劑量的單位劑量形式配制胃腸外給藥組合物。這里使用的單位劑量形式，意指對待治療的哺乳動物對象而言適合作為單位劑量的物理上分散的單元；每單元含有與所需的藥物載體聯用計算產生所需治療效果的預定量活性化合物。本發明的劑量單位形式規格由以下指定并直接依賴于(a)活性化合物的獨特性質及想獲得的具體療效；(b)對個體治療敏感度方面，在組合這種活性化合物時技術上的內在局限。
本發明的化合物，可以配制成該化合物是其中唯一活性劑的藥物組合物。或者，藥物組合物可含有額外的活性劑。例如，本發明的兩種或更多種化合物可以組合使用。
本發明可通過下列的實施例進一步闡明，這些實施例不應解釋為局限性。本申請中所有參考文獻、專利及公布的專利申請、以及圖示的內容，在此引作參考。
實施例實施例1PAN-811與其它神經保護劑的神經保護效能比較目的本研究的目的是在阿爾茲海默病相關的氧化應激細胞模型中，比較PAN-811(3-氨基吡啶-2-羧醛縮氨基硫脲；C7H9N5S；MW＝195)與已知的神經保護劑，如維生素E，硫辛酸及銀杏的神經保護能力。
1.材料及方法1.1研究設計1.1.1.細胞的分離及培養初生皮層神經元從17日齡大鼠胚腦分離，以每孔5萬個細胞接種到96孔板，在常規的神經基礎培養基(neurobasal medium)中培養2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經基礎培養基半量換液兩次。
1.1.2.用PAN-811、其它神經保護劑及過氧化氫處理PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇，并進一步以培養基稀釋到0.1μM、1μM及10μM的終濃度。其它已知的神經保護劑被溶解到合適的溶劑中，并稀釋到指示的終濃度。神經元用PAN-811、已知的神經保護劑或媒介物預處理24小時，然后進行過氧化氫(終濃度150μM)誘導的氧化應激。對照包括未處理的細胞(沒有化合物及過氧化氫處理)、僅僅用化合物處理的細胞、暴露于過氧化氫但無化合物的細胞。未處理的細胞被用作對照來評價毒性及改進的存活率。每個分析重復三次。
1.1.3.細胞功能的評價24小時后，使用標準的MTS分析(Promega)評價存活率及線粒體功能。遵循制造商的操作規程。
1.2材料-神經基礎培養基(Invitrogen)-B27-AO(Invitrogen)-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)-過氧化氫(Calbiochem)-乙醇(Sigma)-維生素E(Sigma)-硫辛酸(Sigma)-銀杏(CVS)-MTS分析試劑盒(Promega)1.3設備-天平(Mettler-Toledo，Inc.)-可調加樣器(Finnpipette)-細胞培養櫥(Thermo Forma)-細胞培養箱(Thermo Forma)-讀板機(Bio-Rad Model 550)2.結果2.1實驗實驗以上述“研究設計”中描述的方法進行。PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇，并進一步以神經基礎培養基稀釋到0.1μM、1μM及10μM的終濃度。硫辛酸以240mM溶解于乙醇，并進一步以神經基礎培養基稀釋到10μM、25μM及100μM的終濃度。維生素E以100mM溶解于乙醇，并進一步以神經基礎培養基稀釋到50μM、100μM、200μM及400μM的終濃度。銀杏以6mg/ml溶解于去離子水，并進一步以神經基礎培養基稀釋到2.5μg/ml、5μg/ml、25μg/ml及250μg/ml的終濃度。在處理結束時，用100μl新鮮的預熱神經基礎培養基加上B27(-AO)更換培養基。培養板放回到細胞培養箱(37℃，5％CO2)一小時。之后，每孔中加入20μl的MTS試劑，培養板再放回到細胞培養箱(37℃，5％CO2)兩小時。以BioRad讀板機(型號550)記錄每孔在490nm的吸收。僅含培養基的孔作為空白對照。每個數據點為3個單獨分析孔的平均值。未處理的細胞被用作計算細胞存活率及神經保護能力的對照。兩周齡原代培養物用于這一研究。結果參見圖1。
結論PAN-811在1-10μM濃度時，顯示良好的神經保護能力，甚至是在苛刻的過氧化氫處理之下。維生素E及硫辛酸在苛刻處理之下，有最小的神經保護能力。銀杏在苛刻處理之下，顯示某種程度的神經保護。
PAN-811在1-10μM終濃度時，顯示顯著的神經保護，甚至是在苛刻的過氧化氫處理之下。PAN-811的神經保護效能明顯超出其它已知神經保護劑，維生素E、硫辛酸及銀杏。
實施例2PAN-811對神經細胞中產生活性氧(ROS)的影響目的本研究的目的是評價PAN-811在阿爾茲海默病相關的氧化應激細胞模型中減少ROS產生的能力
1.材料及方法1.1研究設計1.1.1細胞的分離及培養初生皮層神經元從17日齡大鼠胚腦分離，以每孔5萬個細胞接種到96孔板，在常規的神經基礎培養基中培養2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經基礎培養基半量換液兩次。
1.1.2.以CM-H2DCFDA染料預裝載細胞和用PAN-811及過氧化氫處理細胞初生皮層神經元由HBSS緩沖液沖洗一次，用10μM 5-(及6-)氯甲基-2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯，乙酰酯(CM-H2DCFDA)孵育以預裝載染料。之后細胞用HBSS緩沖液沖洗，用終濃度為0.1、1、5及10μM的PAN-811處理一小時，并進一步進行由300μM過氧化氫誘導的氧化應激兩小時。
1.1.3.神經細胞中產生ROS的評價每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF熒光以BMG極星(polar star)讀板機記錄，并用于評價細胞內ROS的生成。裝載了染料但未處理的細胞用作計算c-DCF熒光改變的對照。每一分析重復三次。
1.2材料-神經基礎培養基(Invitrogen)-B27-AO(Invitrogen)-HBSS緩沖液(Invitrogen)-CM-H2DCFDA(Molecular Probes)-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)-過氧化氫(Calbiochem)-乙醇(Sigma)-PEG-300(Sigma)
1.3設備-天平(Mettler-Toledo，Inc.)-可調加樣器(Finnpipette)-細胞培養櫥(Thermo Forma)-細胞培養箱(Thermo Forma)-極星(Polarstar)熒光讀板機(BMG)2.0結果2.1實驗實驗以上述“研究設計”中描述的方法進行。每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF熒光以BMG極星讀板機記錄。含有細胞但無染料的孔作為空白對照。每個數據點是三個單獨分析孔的均值。加了染料但未處理的細胞用作計算c-DCF熒光改變的對照。兩周齡的原代培養物被用于本研究。
3.0討論CM-H2DCFDA是一種細胞滲透性的ROS指示劑，直到乙酸酯基團被細胞內酯酶去除并在細胞中出現氧化，CM-H2DCFDA方顯示出熒光。它被廣泛用于檢測細胞內及動物體內活性氧(ROS)的生成。在此，按照研究設計中描述的方法，它被用作評價PAN-811對神經細胞內ROS生成影響的工具。如圖2所示，PAN-811在降低過氧化氫誘導的ROS生成和神經細胞內基礎水平的ROS生成上，展示了良好的能力。使用緩沖液及PGE-300/EtOH替代PAN-811的平行對照實驗，顯示對細胞內的ROS生成無影響。實驗以不同批次細胞重復4次，獲得類似的結果。代表性的實驗參見圖2。
4.0結論PAN-811在原代神經細胞內明顯減低基礎水平的ROS生成(～50％；在10μM)及過氧化氫誘導的ROS生成(～30％；在10μM)。
參考文獻(1).Gibson GE，Zhang H，Xu H，Park LC，Jeitner TM.(2001).Oxidative stress increases internal calcium stores and reduces a keymitochondrial enzyme(氧化應激增加內部鈣儲量和減少關鍵的線粒體酶).Biochim Biophys Acta.Mar16；1586(2)177-89.
(2).Chignell CF，Sik RH.(2003).A photochemical study of cellsloaded with 2’，7’-dichlorofuorescinimplications for the detection ofreactive oxygen species generated during UVA irradiation(裝載有2’，7’二氯熒光素的細胞的光化學研究在UVA照射中檢測產生的活性氧的提示).Free Radic Biol Med.Apr 15；34(8)1029-34.
實施例3PAN-811對缺氧或缺氧/低血糖癥誘發的神經毒性是一種潛在的神經保護劑1.0導言在腦卒中后的頭幾分鐘減少神經元損傷是獲得有效治療的重要策略。在腦卒中期間，血栓栓子封閉了動脈，中斷了局部腦區的氧及葡萄糖供給，從而導致梗死中心核中神經元的喪失。中心核中的細胞通過壞死性機制非常迅速地死亡。環繞著缺血梗死區的腦區，結構尚存，但(電傳導)功能終止，稱作半影。半影是一種暫時的區域，它演變成梗死是一種相對進行性現象(Touzani et al.，2001)。這一區域為挽救某些腦功能提供了可能性，處理半影的治療窗口大大長于處理梗死區。半影也可描述為供血受限的區域，其中能量代謝仍然保留。因此，半影是神經保護治療及重新激活靜止神經元的因子如高壓氧的靶區。由此，中樞神經受損后立即的損傷也許不是可逆的，但加重腦損傷，主要是彌漫性腦缺氧/缺血事件鏈的進行，可以由有效的神經保護策略加以阻止。例如，在冠狀動脈側枝架橋手術(CABG)之前及期間給予神經保護劑，能夠有效地保護手術過程中由腦短期的血流改變(引起輕度缺氧/低糖狀態)造成的神經變性。如此，能夠顯著地保護神經并能在神經損傷后挽救神經元的化合物具有非常的重要性。
2.0目的本研究的目的是理解PAN-811是否能夠在體外保護由缺氧或缺氧/低糖(H/H)導致的神經毒性。在相關的工作中，PAN-811對過氧化氫處理的原代神經元已顯示明顯的神經保護作用。
3.0材料及方法3.1材料-神經基礎培養基(Invitrogen)-B27-AO(Invitrogen)-PAN-811(Vion Pharmaceuticals)-乙醇(Sigma)-DMSO(Sigma)-PEG-300(Sigma)-MTS分析試劑盒(Promega)-LDH分析試劑盒(Sigma)3.2設備-天平(Mettler-Toledo，Inc.)-可調加樣器(Finnpipette)-細胞培養櫥(Thermo Forma)-細胞培養箱(Thermo Forma)-讀板機(Bio-Rad Model 550)-FYRITE氣體分析器(Bacharach，Inc)-模塊培養室(Modular Incubator Chamber)-101TM(Billups-Rothenberg，Inc.)3.3縮寫BSS＝平衡鹽溶液
CABG ＝冠狀動脈側枝架橋手術d.i.v.＝體外天數EtOH ＝乙醇H/H ＝缺氧/低血糖癥LDH ＝乳酸脫氫酶MCAO ＝中腦動脈閉塞NB＝神經基礎培養基NMDA ＝N-甲基-D-天冬氨酸鹽PEG ＝聚乙二醇3.4研究設計3.4.1神經元培養96孔培養板用于本實驗。皮質神經元以每孔5萬個細胞密度接種在聚-D-賴氨酸涂布的表面，培養在無血清培養基中(NB加上B27補充劑)以獲得高富集神經元的培養物。培養神經元14d.i.v.以上，以增加細胞對興奮氨基酸的易感性(Jiang et al.，2001)。6個重復孔作為一組處理以利于分析定量。
3.4.2在體外模型中誘導神經毒性如下表所示，腦中葡萄糖濃度通常超過2.2mM。在缺血時，其濃度在中心核及半影分別下降到0.2mM及1.4mM。恢復循環后一至兩小時，葡萄糖濃度回復到正常水平(Folbergrováet al.，1995)。
表1.葡萄糖濃度(mmol/kg) 為理解葡萄糖濃度對缺氧誘導的神經毒性的影響，我們已經檢測了不同劑量的葡萄糖。如圖3所示，與正常情況下葡萄糖濃度為25mM相比，葡萄糖濃度下降到2.9mM沒有導致神經細胞死亡。當葡萄糖濃度下降到0.4mM時，MTS分析顯示有強烈的細胞死亡出現。
為模擬腦卒中的腦環境，我們建立了三種體外模型系統。極度H/H模型(0.4mM葡萄糖)是梗死中心核環境的模擬；輕度H/H模型(1.63mM葡萄糖)為MCAO期間半影區環境的模擬；而以單純缺氧模型(正常神經元下，體外葡萄糖的濃度為25mM)來模擬重新灌流后半影區的環境，這是因為在重新灌流后缺氧而不是能量衰竭是造成可能的細胞死亡的主要原因。
對于極度H/H及輕度H/H而言，通過將葡萄糖的濃度分別降低到0.4mM及1.63mM獲得缺氧/低血糖癥。在使用前，將BSS(116.0mMNaCl，5.4mM KCl，0.8mM MgSO4·7H2O，1.0mM NaH2PO4，1.8mMCaCl2·2H2O，26.2mM NaHCO3及0.01mM甘氨酸)或含有25mM葡萄糖的BBS脫氣5分鐘。缺氧下培養板中的培養基用BBS或含有葡萄糖的BBS置換。同時，常氧下培養板中的培養基由未脫氣的BBS或含有葡萄糖的BBS置換。為造成細胞缺氧，將培養板置于密封的容器(模塊培養室-101TM，Billups-Rothenberg，Inc.)，施加真空20分鐘以從培養基中去除氧及其它氣體，然后以30psi的壓力向容器內充填5％二氧化碳及95％氮氣1分鐘。以O2指示器(FYRITE氣體分析器，Bacharach，Inc)測定容器內氧氣的含量為0。培養板置于室內6小時。作為實驗對照，重復的培養板維持在正常培養條件下(5％二氧化碳及95％環境氣體)同樣長的時間。6小時后從容器內取出處理的培養板，以含有25mM葡萄糖的終止液[添加1×丙酮酸鈉，10.0mM HEPES及1×N2補充的DMEM]，置換缺氧及常氧條件下培養物中的培養基，并培養在5％二氧化碳及95％環境氣體的條件中。用不同濃度的PAN-811及媒介物作為陰性對照處理神經元。以MK801作為陽性對照。在H/H侵害后的24或48小時，以MTS及LDH分析(見下文)來評價線粒體功能及細胞死亡。
在單純缺氧模型中，以溶劑或PAN-811預處理神經元24或48小時。藥物處理在缺氧24小時期間及之后仍在持續。在缺氧侵害之后的24或48小時，評價細胞形態及功能(MTS及LDH分析)。
3.4.3.形態學監控在圖4中，可見形態評估的神經細胞死亡。在缺氧之前，神經元是健康的，具有相亮(phase-brilliant)的體細胞(箭頭頭部)及完整的神經突起(空心箭頭)。背景上，這些突起及其分枝形成致密的網絡。缺氧導致細胞體的皺縮及神經突起與網絡的崩潰。5μM劑量的PAN-811及谷氨酸鹽NMDA受體拮抗劑MK801有效地避免了神經細胞的死亡，并部分保存了神經突起。
3.4.4.MTS分析MTS分析是一種測定代謝活性細胞中線粒體功能的比色分析。該檢測間接反映細胞存活率。MTS四唑化合物在代謝活性細胞的線粒體中，被還原為有色的可溶于組織培養基的甲月替(formazan)產物，其在490nm的吸收可被檢測。將20μl的MTS試劑(Promega)加到含有樣品的100μl培養基的96孔培養板的孔中。在增濕、5％二氧化碳、37℃條件下，孵育培養板1到2小時，直至充分呈現顏色。以Bio-Rad96孔讀板機記錄在490nm處的吸收。
3.4.5.LDH分析乳酸脫氫酶(LDH)分析是基于乳酸脫氫酶作用使NAD還原。得到的還原NAD(NADH)用于四唑鹽染料的化學計量轉換。如果分析從不同處理培養物取出的無細胞培養基等份，則活性可用作相關細胞死亡以及細胞膜完整性的指示。將50μl等份的培養基由每孔測試的96孔培養板的孔中轉移到未用過的培養板中的孔，并補入25μl等量混合的底物、酶及染料(Sigma)。在室溫下孵育20到30分鐘，之后于490nm波長處進行分光光度測定。
3結果4.1.單純缺氧模型3.1.1.PAN-811的效力及毒性以PAN-811在缺氧前預處理皮質神經元48小時。PAN-811于24小時缺氧期間及缺氧之后的48小時保留存在。如圖5所示，2μM劑量的PAN-811完全阻止了細胞死亡，但在50μM出現細胞毒性。
3.1.2.與其它神經保護劑的比較用2μM PAN-811、1∶80綠茶或5μM MK801于缺氧24小時之前、期間和之后處理皮層24小時。在檢測的試劑中，PAN-811顯示了最高的效力，完全阻止神經細胞死亡及線粒體機能障礙。
輕度H/H模型3.1.3在受侵害之前及期間，PAN-811保護神經元免受輕度H/H誘導的神經毒性培養胚胎(E17)大鼠皮質神經元15天，以PAN-811及媒介物在缺氧/低血糖癥之前24小時和缺氧/低血糖癥期間(6小時)處理。在接受侵害后17小時，通過MTS及LDH分析評價結果。PAN-811在濃度為5μM時，完全保護了缺氧/低血糖癥誘導的線粒體機能障礙及神經細胞死亡，而1∶1520倍稀釋的PEG∶EtOH(相當于媒介物在5μM PAN-811中的量)，沒有形成這種保護。
代表性數據見圖6。下面的表2總結了6次實驗的結果，濃度范圍覆蓋2-50μM。
表2 4.2.2.PAN-811在受侵害期間，特別是侵害之后，保護細胞免受輕度H/H誘導的神經毒性神經元培養15天后，用PAN-811或媒介物PEG∶EtOH(7∶3)于6小時H/H之前處理24小時(之前組)。或者，神經元培養16天后，用上述試劑在6小時H/H期間處理(期間組)，在6小時H/H期間及H/H之后的48小時階段處理(期間及之后組)，或在H/H之后的48小時階段處理(之后組)。在H/H階段之后48小時，進行LDH分析。圖7中的結果表明，在H/H期間，特別是H/H之后處理神經元，PAN-811保護神經細胞死亡，但在H/H之前處理神經元，保護作用微不足道。
3.2極度H/H模型PAN-811在濃度≤50μM，未見神經保護作用(未示資料)。
4結論4.1.PAN-811在2μM時，對單純缺氧及輕度H/H誘導的神經毒性有完全的保護作用。PAN-811在100μM時，對極度H/H誘導的神經細胞死亡僅有部分阻止作用。因此，PAN-811不太可能與能量代謝有關。
4.2.當缺氧或局部缺血侵害期間或之后給藥，PAN-811顯著保護神經細胞免于死亡。
4.3.PAN-811的效力明顯高于MK801和/或綠茶。
4.4.在長時間暴露(120小時)的情況下，50μM的PAN-811是神經毒性的。
5.0參考文獻1.Jiang，Z.-G.，Piggee，C.A.，Heyes，M.P.，Murphy，C.M.，Quearry，B.，Zheng，J.，Gendelman，H.E.，and Markey，S.P.Glutamate is a principalmediator of HIV-1-infected immune competent human macrophageneurotoxicity(谷氨酸鹽是HIV-1感染的免疫活性人巨噬細胞神經毒性主要介質).J.Neuroimmunology 117(12)97-107，2001.
2.Folbergrová，J.，Zhao，Q.，Katsura，K.，and Siesj，B.K.N-tert-butyl-phenylnitrone improves recovery of brain energy state in ratsfollowing transient focal ischemia(N-叔丁基苯基硝酮改善大鼠在短暫的局部缺血后腦能量狀態的恢復).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925057-5061，1995.
3.Touzani，O.，Roussel，S.，and MacKenzie，E.T.The ischemicpenumbra.(局部缺血半影)Curr.Opin.Neurol.1483-88，2001.
實施例4在短暫的局部腦缺血的體內模型中，PAN-811顯示顯著的神經保護作用1.導言在腦卒中后的頭幾分鐘減少神經損傷，是獲得有效治療的重要策略。在腦卒中期間，血栓栓子封閉了動脈，中斷了局部腦區的氧及葡萄糖供給，從而導致梗死中心核的神經元的喪失。中心核中的細胞經壞死性機制，非常迅速地死亡。環繞著缺血梗死區的腦區，結構尚存，但(電傳導)功能終止，稱作半影。半影是一種暫時的區域，它演變成梗死是一種相對進行性現象(Touzani et al.，2001)。這一區域提供了挽救某些腦功能的可能性，處理半影的治療窗口大大長于處理梗死區。半影也可描述為供血受限的區域，能量代謝仍然保留。因此，半影區是神經保護治療及重新激活靜止神經元的因子如高壓氧的靶區。由此，中樞神經受損后立即的損傷也許不是可逆的，但加重腦損傷，主要是迷漫性腦缺氧/缺血事件鏈的進行，可以由有效的神經保護戰略加以防止。例如，在冠狀動脈側枝架橋手術(CABG)之前及期間給予神經保護劑，能夠有效地保護由腦血流短期改變(引起輕度缺氧/低糖狀態)造成的神經變性。如此，能夠顯著地保護神經并在神經損傷后挽救神經元的化合物具有非常的重要性。
2.目的在氧化應激及缺血的體外模型中，PAN-811已顯示顯著的神經保護作用。對該化合物的現有工作與已知的毒性譜及藥代動力學數據，強烈表明PAN-811用于治療腦卒中的潛力。
3.0材料及方法3.1材料-PAN-811(Vion Pharmaceuticals)-乙醇(Sigma)-PEG-300(Sigma)-MTS分析試劑盒(Promega)
3.2縮寫CABG ＝冠狀動脈側枝架橋手術EtOH＝乙醇H/H ＝缺氧/低血糖癥MCAO ＝中腦動脈閉塞PEG ＝聚乙二醇3.3研究設計3.3.1體外研究在著手體內研究前，在數種神經變性的細胞模型中檢測PAN-811。
3.3.1.1.神經元培養由胚齡為15日齡的Sprague-Dawley大鼠胚胎制備富集的神經元培養物。以無菌技術，從子宮中取出鼠胚，置于無菌神經元培養基中。在解剖鏡下，從各胚胎中取出腦組織，小心去除腦膜及血管。在顯微鏡下通過大致解剖分離小腦，僅小腦組織用于培養。研碎組織，游離細胞，以每孔5×105細胞的密度接種到聚-L-賴氨酸預涂布的48孔培養板上。培養物在含有等量Eagle氏基礎培養基(無谷氨酰胺)和Ham氏F-12k培養基的溶液中維持，該溶液補充有10％熱滅活的馬血清、10％胎牛血清、600μl/ml葡萄糖、100μg/ml谷氨酰胺、50U/ml青霉素及50μg/ml鏈霉素。48小時后，加入10μM阿糖胞苷，以抑制非神經細胞的分裂。培養7天的細胞，用于實驗。
3.3.1.2.PAN-811的神經毒性用不同濃度(0-100μM)的PAN-811處理細胞24小時。以MTT分析確定細胞存活率。
3.1.3.3.體外模型中神經毒性的誘導對4種興奮毒性的體外模型進行研究。暴露細胞于H/H條件3小時，或以100μM谷氨酸鹽、1μM staurosporine、10μM藜蘆定(veratridine)處理45分鐘。所有細胞與或不與10μM PAN-811的Locke氏溶液共同處理。在各興奮毒性暴露結束時，更換條件培養基(原始培養基)。將細胞孵育在無外加葡萄糖的Locke氏溶液，5％二氧化碳及95％氮氣飽和的增濕密閉容器中3小時來誘導H/H。
3.1.3.4.MTS分析興奮毒性侵害24小時后，評價細胞存活率。應用以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鹽(MTT，SigmaChemical Co.Ltd.，St.Louis，Mo)為基礎的四唑鹽比色分析，定量評價細胞損傷。簡言之，將染料添加到各孔(終濃度1.5mg/ml)，細胞用MTT酸化的異丙醇(0.1N HCl的異丙醇)孵育細胞，然后用96孔讀板機測定各樣品在540nm的吸收強度。值表示為維持在各板上的媒介物處理的對照細胞的百分比，并計算細胞存活率百分數的變化。
3.1.2體內研究3.1.2.1.MCAO 36只雄性Sprague-Dawley大鼠(270-330克，Charles River Labs，Raleigh，VA)用于本項研究。以5％氟烷誘導麻醉，和在2％氟烷的氧氣中維持。以恒溫加熱系統(Harvard Apparatus，SouthNatick，MA)，使體溫在整個手術過程中保持在正常溫度(37±1℃)。食物及水于手術前后隨意攝取，動物在12小時明暗周期環境中，分籠飼養。麻醉后，使用中腦動脈閉塞(MACO)的絲阻方法(filament method)來實現短暫局部缺血并重灌流。簡言之，分離右側外頸動脈并凝結其分支。以3-0未涂布的圓頭單絲尼龍縫合線，經外頸動脈插入內頸動脈，并向前推進(由頸動脈分叉算起約22mm)直至遇到輕微阻抗，這樣封閉了MCA的起端。血管內縫合線留在原處2小時，然后收回以允許血液重新灌流到MCA。MCAO手術后，動物放到維持22℃室溫的恢復籠中。在2小時缺血階段及缺血后最初6小時，也用75瓦加熱燈直接放在每個籠子的頂部，以保證整個試驗中動物的體溫恒定在正常體溫。
3.1.2.2.用PAN-811處理在MCAO之前，經靜脈內注射，以每公斤體重1毫克PAN-811處理大鼠10分鐘。制備PAN-811的70％PEG300，30％EtOH的儲液。在注射前，用無菌鹽水將該儲液稀釋5倍(終濃度為1mg/ml)。
3.1.2.3.梗死體積的測定對每只大鼠腦而言，缺血性腦損傷的分析被測量為總的梗死體積的函數。這從氯化2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色7個冠狀切片(2毫米厚)獲得。腦切片采集區由額極1毫米處開始，終止于皮質小腦接合處的嘴端。使用計算機輔助影像分析計算梗死體積。簡言之，每一TTC染色的前腦切片的后表面被數字化成像(Loats Associates，Westminster，MD)，并定量缺血損傷的面積(以平方毫米計)。
4結果4.1.體外研究4.1.1PAN-811的神經毒性結果見圖1。實際上，PAN-811在濃度最高為100μM時，僅有輕微的毒性。在檢測的最高濃度，最大毒性僅為8.7％(見圖8)。
4.1.2PAN-811的神經保護PAN-811顯示明顯地保護神經元免受不同興奮毒的侵害(圖2)。以10μM PAN-811預處理神經元保護缺氧/低糖(保護約92％)，100μM谷氨酸鹽(保護約75％)，1μM staurosporine蛋白激酶C抑制劑及細胞凋亡誘導劑(保護約47％)及10μM藜蘆定鈉通道阻斷劑(保護約39％)處理3小時誘導的損害(見圖9)。
4.2體內研究本實驗的結果見表3。36只大鼠用于本試驗，而11只大鼠因以下原因被排除在外4只在無出血并發癥下死于嚴重卒中，4只出現亞急性出血(SAH)(24小時內有3只死亡)、1只由于手術中突發火災演習、1只鼠由于統計定為無關項、另1只死于過量的氟烷。在這7只死亡的大鼠(4只無SAH，和3只有SAH下死于嚴重卒中)中，6只是未處理(媒介物)的大鼠，僅1只是PAN-811處理的。媒介物處理的大鼠的平均梗死體積為292.96mm3，范圍在198.75-355.81。PAN-811處理的大鼠的平均梗死體積為225.85mm3，范圍在42.36-387.08。這顯示23％的神經保護(p＜0.05)。由于原因未知，在對照組觀察到比正常測量更嚴重的損傷。因此，PAN-811處理動物的梗死尺寸也比預計的神經保護要顯著得多。盡管如此，在兩組中的差異性是極好的(SEM為10％或更少)，差異性結果與先前發表的研究一樣好，如果不是更好的話。
5結論11.1在體外及體內模型系統中，PAN-811的耐受良好，并且相對無毒。
11.2以10μM PAN-811預處理神經元，明顯保護神經元免受導致神經變性的興奮毒性的侵害。
11.3在短暫局部腦缺血前10分鐘以單劑量(1mg/ml)的PAN-811預處理大鼠，可減小23％的平均梗死體積。
6參考文獻6.1文獻5.1.1Williams AJ，Dave JR，Phillips JB，Lin Y，McCabe RT，andTortella FC.(2000)Neuroprotective efficacy and therapeutic window of thehigh-affinity N-methyl-D-aspartate antagonist conantokin-Ginvitro(primary cerebellar neurons)and in vivo(rat model of transient focalbrain ischemia)studies(高親和性N-甲基-D-天冬氨酸鹽拮抗劑conantokin-G的神經保護功效和治療窗口體外(原代小腦神經元)和體內(短暫局部腦缺血大鼠模型)研究).J Pharmacol Exp Ther.294(1)378-86.
7.表3

表I媒介物和PAN-811處理的大鼠的梗死體積。大鼠在MACO前用1mg/ml PAN-811處理10分鐘，手術之后24小時測定梗死體積。
實施例5PAN-811保護神經元免受過氧化氫誘導的氧化應激1.0目的本研究的目的是在阿爾茲海默病相關的氧化應激細胞模型中，評價PAN-811作為神經保護劑的功效。神經保護及細胞毒性被測定。不同的溶劑被檢測，以確定是否合適作為投遞PAN-811的媒介體。
2.0材料及方法
2.1材料-神經基礎培養基(Invitrogen)-B27-AO(Invitrogen)-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)-過氧化氫(Calbiochem)-乙醇(Sigma)-DMSO(Sigma)-PEG-300(Sigma)-MTS分析試劑盒(Promega)2.2設備-天平(Mettler-Toledo，Inc.)-可調加樣器(Finnpipette)-細胞培養櫥(Thermo Forma)-細胞培養箱(Thermo Forma)-讀板機(Bio-Rad Model 550)2.3研究設計2.3.1細胞的分離及培養初生皮層神經元從17日齡大鼠的胚腦分離，并以每孔5萬個細胞接種到96孔板，在常規的神經基礎培養基中培養2-3周。以不含抗氧化劑的新鮮神經基礎培養基半量換液兩次。
2.3.2用PAN-811及過氧化氫處理PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇或DMSO中，以5mg/ml(～25mM)溶解于PEG-300/乙醇(70％/30％)中，并進一步以培養基稀釋到1μM、5μM、20μM及50μM的終濃度。神經元用PAN-811或媒介物處理24小時，之后進行由過氧化氫(終濃度60-70μM)誘導的氧化應激。對照包括未處理的細胞(沒有PAN-811及過氧化氫處理)、僅僅用PAN-811處理的細胞和暴露于過氧化氫但沒有PAN-811的細胞。未處理的細胞用作對照以評價神經元毒性及改進的存活率。每個分析重復3次。等體積的溶劑(乙醇、DMSO與PEG-300/乙醇)被加到細胞中以測定溶劑對分析的影響。
2.3.3.細胞功能的評價24小時后，使用標準的MTS分析(Promega)評價培養物的存活率及線粒體功能。遵循制造商的操作規程。
3.結果3.1實驗1實驗以上述研究設計中描述的方法進行。在處理結束時，用100μl新鮮的預熱神經基礎培養基加上B27(-AO)更換所有的處理和培養基。培養板被放回到37℃，5％CO2的細胞培養箱一小時，然后每孔中加入20μl的MTS試劑，培養板繼續在37℃，5％CO2的細胞培養箱中培養兩小時。以BioRad讀板機(型號550)記錄每孔在490nm的吸收。僅含培養基的孔作為空白對照。每個資料點是三個單獨分析孔的平均。未處理的細胞被用作計算細胞存活率及神經保護能力的對照。三周齡的原代培養物用于這一研究。結果請見圖10。
3.2實驗2實驗以實驗1的相同方法進行。兩周齡的原代培養用于這一研究。結果請見圖11。
4.討論所有三種溶劑在相當于PAN-811終濃度1-10μM的稀釋度時，對本分析系統有最小的影響。DMSO在相當于PAN-811終濃度20μM或以上的稀釋度時，顯示一定水平的神經保護。乙醇和PEG-300/乙醇在相當于PAN-811終濃度50μM的稀釋度時，顯示一定水平的神經保護能力。PAN-811在1-10μM時，顯示好的神經保護。與單獨乙醇比較，PAN-811在PEG-300/乙醇中有較好的溶解性。
5.結論PAN-811在1-10μM的終濃度時，顯示良好的神經保護能力。PEG-300/乙醇在相當于PAN-811 1-20μM的稀釋度時，對分析系統有最小的干擾，因此是被檢3種溶劑中最好的PAN-811溶劑。
本領域技術人員很容易得知本發明非常適合于實現目標，并獲得最終結果和所述優點以及其中內在的東西。對本領域技術人員顯而易見的是，在實施本發明時，可有不同的修飾及變更而無需背離本發明的精神及范圍。對本領域技術人員而言可以在包含權利要求書中限定的本發明實質的范圍內進行這里所述的修改和其他的應用。
權利要求
1.治療缺血相關疾病的方法，包括對病人給藥通式I的化合物或其藥物前體 其中E是氧、硫、NH或N-C1-6烷基；R1、R2、R3和R4獨立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個另外選自氮、氧及硫的雜環原子；并且HET為任選取代的5到7元雜芳香基殘基，該雜芳香基殘基含有1到4個選自氮、氧或硫的雜環原子。
2.權利要求1的方法，其中E是硫。
3.權利要求1的方法，其中HET是下列通式的殘基 其中m是0或1；當m為0時，Z1、Z2及Z3獨立地選自N、O、S或CR；或當m為1時，Z1、Z2及Z3獨立地選自N或CR；R每次出現時，獨立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基；并且x為由0到4的整數。
4.權利要求3的方法，其中當Z1、Z2或Z3中的0或1個為N時，剩余的為CR。
5.權利要求1的方法，其中HET殘基選自任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基。
6.權利要求1的方法，其中HET是任選取代的吡啶基。
7.權利要求1的方法，其中E為硫；HET殘基是選自任選取代的吡啶基、任選取代的吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且R1、R2、R3和R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個另外選自氮、氧及硫的雜環原子。
8.治療缺血相關疾病的方法，包括對病人給藥通式II的化合物或其藥物前體 其中R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫，任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的環烷基、任選取代的鹵代烷基、任選取代的芳香基、任選取代的氨基烷基、任選取代的羥烷基、任選取代的烷氧基烷基及任選取代的烷酰基，或者NR1R2組合形成3到7元環，該環可包含0、1或2個另外選自氮、氧及硫的雜環原子；并且x為0到5的整數。
9.權利要求8的方法，其中x是0、1、2或3，R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個另外選自氮、氧及硫的雜環原子。
10.權利要求9的方法，其中R、R1、R2和R3獨立地選自氫、C1-4烷基、C1-2鹵代烷基、苯基、氨基C1-4烷基、羥基C1-4烷基、C1-4烷氧基C148烷基及C1-4烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0、1或2個另外選自氮、氧及硫的雜環原子。
11.權利要求8的方法，其中給藥的化合物或其藥物前體是下列通式III的化合物 其中R、R1、R2、R3及R4獨立地選自氫、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8環烷基、C1-8鹵代烷基、C6-10芳香基、氨基C1-8烷基、羥基C1-8烷基、C1-8烷氧基C1-8烷基及C1-8烷酰基，或者NR1R2組合形成3到7元環，該環可包含0、1或2個另外選自氮、氧及硫的雜環原子；R6為氫、羥基、氨基或C1-8烷基；R5及R7獨立地選自氫、鹵化物、羥基、巰基、氨基、羥氨基、單-C1-8烷基氨基、二(C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基、C1-8烷基、C2-8烯基及C2-8炔基。
12.權利要求8的方法，其中R4是氫或C1-6烷基。
13.權利要求12的方法，其中R4是氫、甲基、乙基、正丙基或異丙基。
14.權利要求11的方法，其中R5選自氫或任選取代的氨基；R6為氫或C1-4烷基；并且R7為氫，任選取代的氨基或羥基，其中R5中至少一個是氨基、N-羥基氨基、單-或二-(C1-4烷基)氨基或N-(C1-4烷基)-N-(羥基)氨基，并且R5選自氫、羥基氨基、單-及二-(C1-8烷基)氨基、羥基及C1-8烷氧基；R6選自氫、羥基氨基、單-及二-(C1-8烷基)氨基；并且R5不同于R6，并且R5及R6之一為氫。
15.權利要求11的方法，其中R4是氫或C1-6烷基；并且，R1、R2及R3獨立地選自氫、C1-4烷基、C1-2鹵代烷基、苯基、氨基C1-4烷基、羥基C1-4烷基、C1-4烷氧基C148烷基及C1-4烷酰基，或者NR1R2合起來形成3到7元環，該環可包含0或1個另外選自氮、氧及硫的雜環原子。
16.權利要求11的方法，其中R4為氫、甲基、乙基、正丙基或異丙基；并且R1、R2及R3獨立地選自氫、甲基、乙基、乙酰基、甲酰基，或者NR1R2合起來形成哌啶基、吡咯烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基或哌嗪基。
17.權利要求11的方法，其中R4為氫、甲基或乙基；并且R1、R2及R3獨立地選自氫、甲基、乙基及乙酰基。
18.權利要求1到17中任一項的方法，其中缺血相關疾病選自阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側枝架橋手術、心博停止導致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內血管異常破裂造成的出血、顱內動脈瘤破裂造成的蛛網膜下腔出血、高血壓性腦病、造成腦缺血的頸動脈狹窄或阻塞、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性，心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
19.治療缺血相關疾病的方法，包含對病人給藥具有下列通式的化合物
20.權利要求19的方法，其中缺血相關疾病選自阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側枝架橋手術、心博停止導致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內血管異常破裂造成的腦出血、顱內動脈瘤破裂造成的蛛網膜下腔出血、高血壓性腦病、造成腦缺血的頸動脈狹窄或阻塞、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
全文摘要
本發明涉及通過施用縮氨基硫脲化合物給需要的病人來治療缺血相關疾病的方法。本發明優選的實施方案涉及治療特定的缺血相關疾病的方法，所述疾病包括但不限于阿爾茲海默病、帕金森氏綜合癥、冠狀動脈側枝架橋手術、心搏停止導致的彌漫性腦缺血、病灶性腦梗塞、腦出血、出血性梗塞、高血壓性出血、由顱內血管畸形破裂造成的腦出血、顱內動脈瘤破裂造成的蛛網膜下腔出血、高血壓性腦病、頸動脈狹窄或阻塞造成的腦缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓損傷、腦血管疾病例如，動脈粥樣硬化、脈管炎、斑變性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心動過速。
文檔編號A61K31/44GK1816336SQ200480018789
公開日2006年8月9日 申請日期2004年4月30日 優先權日2003年5月1日
發明者畢堅·阿爾瑪森, 侯賽因·甘巴瑞, 邁克爾·力包未次, 潘魏英, 姜志鋼 申請人:萬能藥制藥公司