專利名稱：用于與蛋白質和肽綴合的四個支鏈的樹枝狀大分子peg的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有四個支鏈的聚乙二醇(PEG)的樹枝狀大分子樣聚合結構，用于獲得藥學目的的綴合物。
背景技術：
治療性蛋白質與聚乙二醇的綴合對于一些藥理學性質的益處是眾所周知的。例如，由于不同的原因，在血中的半衰期延長，其中聚合殘基可以防止蛋白酶的攻擊和通過免疫系統進行的藥物的識別，至于天然蛋白質，綴合物的流體力學體積顯著地減少了腎濾過。盡管在很多情況中，PEG化會影響蛋白質的體外生物活性，但是在血中壽命的顯著延長使得其治療作用更為有效(Harris J.M.y Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2214-21)。
PEG化也從立體上阻止了疏水性相互作用誘導的降解途徑，產生了立體非特異性障礙，從而減小了與蛋白質熱不穩定性有關的分子間作用力。所有這些使得PEG化的蛋白質比未修飾的分子具有了更高的物理穩定性，這是一種對于最終藥物制劑的制備非常有用的性質(HarrisJ.M.y Chess R.B.(2003)Effect of pegylation onpharmaceuticals.Nat.Rev.Drug Discov.2214-21)。
常用于蛋白質綴合的試劑是在其一個末端甲基化的聚乙二醇，稱作單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。甲基保護PEG鏈的一個末端的事實使得其僅能通過另一個末端激活，成為單官能化試劑。這對于治療性蛋白質的綴合是非常重要的，因為一般與雙官能化或多官能化試劑的綴合會導致交聯，從而影響蛋白質的生物活性。mPEG分子總是具有一小部分的非甲基化聚合物，即二醇部分。由于更難以控制非常長的鏈的聚合過程，因此在較高分子量的mPEG中二醇部分的比例更高(Roberts M.J.，Bentley M.D.，Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide和蛋白質PEGylation.Adv.Drug Deliv.Reviews 54459-76)。
由PEG衍生的第一類分子中的一種是通過與氯化氰反應而合成的。但是該試劑的綴合試驗引起了廣泛的PEG化。這是治療性蛋白質所不期望的，因為PEG化的程度較高會導致生物活性突然降低，原因在于直接阻斷活性位點，或是掩蓋了易接觸的蛋白質表面的這些位點的拓撲變化。通常，期望的綴合物是在每個蛋白質分子上僅有一個PEG殘基；該分子已知是單-PEG化的。
從80年代開始，開始使用“更軟”的活性基團。盡管也可以使用其他基團，但這些基團主要是N-羥基琥珀酰亞胺酯。三種最常見的基團是琥珀酰亞胺琥珀酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)和琥珀酰亞胺碳酸酯。這時的活化PEG被稱作第一代活化PEG(Roberts M.J.，Bentley M.D.，Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide andprotein PEGylation.Adv.Drug Deliv.Reviews 54459-76)。
90年代后半期出現了第二代的活化PEG。它有兩個重要的進步能夠更為選擇性地PEG化的基團(例如優選通過蛋白質的N末端綴合的醛基)和支鏈結構(Roberts M.J.，Bentley M.D.，Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide and protein PEGylation.Adv.DrugDeliv.Reviews 54459-76)。支鏈PEG的例子是用兩個支鏈單官能化的(US5,932,462)，用四個支鏈四官能化的和用八個支鏈八官能化的。綴合治療性蛋白質的更有用的活化PEG是單官能化的，因為它們避免了蛋白質和聚合物之間的交聯。支鏈PEG也具有傘樣的結構，從而更好地保護蛋白質的表面。
兩個支鏈的單官能化的PEG能夠得到具有干擾素α-2a的綴合物，該綴合物比天然蛋白質在臨床中顯示出更好的效果(Rajender ReddyK.，Modi M.W.，Pedder S.(2002)Use of peginterferon alfa-2a(40KD)(Pegasys)for the treatment of hepatitis C.Adv.DrugDeliv.Reviews 54571-86)。
至于mPEG合成的現有技術，僅僅能獲得30kDa的鏈，原因在于具有兩個支鏈的試劑能夠獲得最大為60kDa的分子量。人們期望具有更高分子量的單官能化的PEG的結構，其可以用于探索更寬范圍的綴合物，以在某些蛋白質中得到最佳的值。但是，在上述的報告中都沒有使用、表征或提及單官能化和具有兩個以上的PEG鏈的PEG化試劑。在獲得具有兩個以上的PEG鏈的試劑的情況中，可以獲得更高分子量的綴合物，除了上述的優點以外，它允許使用更短的mPEG線性支鏈使類似分子量的PEG化試劑成為兩個支鏈的結構。這些較小的支鏈含有的二醇部分量更小，這使得合成過程更容易。
發明內容
本發明解決了上述問題，提供了具有四個mPEG支鏈的單官能化樹枝狀大分子樣結構。該結構能夠獲得具有高達120kDa的聚合殘基的綴合物。這個事實可以用于探索具有廣泛不同的分子量的綴合物，包括具有高分子量的綴合物。此外，使用這個方法，可以獲得分子量與其他支鏈化的單官能化試劑類似的PEG分子，但是它具有較低分子量的線性鏈。
在本發明一個優選的實施方案中，獲得了一種聚合結構，其中PEG鏈的分子量為5,000到30,000Da，總分子量為20,000到120,000Da。
使用小的線性鏈幾乎消除了在較大的線性PEG分子中的二醇污染。出人意料地，與類似分子量但是用僅有兩個支鏈的結構制備的綴合物相比，具有本發明所述結構的綴合物具有高得多的物理-化學穩定性(耐高溫和蛋白酶降解)。同時出人意料的是，它們在血中具有更高的平均壽命。另一個出人意料的結果是具有本發明樹枝狀大分子樣結構的綴合物更為同質，與具有類似分子量但僅有兩個支鏈的綴合物所獲得的結果相比，具有更少的位置異構體。
樹枝狀大分子樣四個支鏈的單官能化的PEG是在兩個主要步驟中獲得的。第一個步驟是通過兩個線性PEG分子與核結合來合成兩支鏈-衍生物，其中該核可以是例如賴氨酸。其他作者已經使用類似方法獲得了良好的結果(US 5,932,462)。第二個步驟是與前一步驟類似，將兩分子的兩支鏈-衍生物與核結合，獲得四支鏈-衍生物。為了在第一步驟中將兩個線性PEG支鏈與核結合，它們需要具有活性基團。該基團可以選自現有技術水平已知的基團。例如，其中包括琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酰亞胺碳酸酯、對硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亞胺丙酸酯、琥珀酰亞胺丁酸酯。在本發明中優選的線性活化PEG是琥珀酰亞胺碳酸酯。這主要是由于下列主要的不同原因該試劑和具有游離氨基的核之間具有良好的反應性，制備官能化PEG的方法簡便。合成方法(Miron T.，Wilchek M.(1993)A Simplified Method for thePreparation of琥珀酰亞胺碳酸酯Polyethylene Glycol forCoupling to Proteins.Bioconjugate Chem.4568-69)是本領域技術人員公知的
當準備好線性的活化PEG時，通過與選作核的分子進行反應可以容易地完成第一個步驟。在本發明一個優選的實施方案中，由于其生物適合性，核是L-賴氨酸，它具有兩個游離的氨基和一個羧基，它們可以在隨后用于被激活。
通過色譜法可以從反應混合物中容易地純化兩支鏈-衍生物。用核分子激活該兩支鏈-衍生物以用于后續的反應并合成四支鏈-衍生物。可以以不同方法激活該產品，但是根據效力和簡便性優選的一種方法是形成N-羥基琥珀酰亞胺酯。
該方法已經成功地用于激活具有包含PEG鏈的結構的羧基，使其成為N-羥基琥珀酰亞胺酯(US 4,732,863，US 5,932,462)。
制備四支鏈-衍生物的第二個階段包括兩支鏈-衍生物與核分子的反應，其與本發明的第一個階段類似；本發明的一個優選實施方案是使用L-賴氨酸作為核。
通過色譜法可以容易地從反應混合物中純化感興趣的衍生物。
使用不同的反應性基團與蛋白質綴合可以激活樹枝狀大分子樣PEG分子。用于激活其他PEG結構的任意官能團同樣可用于本專利所述的樹枝狀大分子樣PEG。這些基團的一些例子是N-羥基琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺碳酸酯、不同類型的醛、馬來酰亞胺等等。可以使其結構與蛋白質結合的其它類型的基團是螯合基次氮基三乙酸酯(NTA)，其可以通過過渡金屬與肽骨架中存在的組氨酸殘基綴合。反應性基團的選擇將取決于欲與PEG分子結合的蛋白質殘基。
例如，如果優選與游離的氨基結合，那么樹枝狀大分子樣聚合物可以激活成N-羥基琥珀酰亞胺酯。這樣，根據與階段1中激活兩支鏈-結構所述相同的方法，本發明的一個實施方案是獲得N-羥基琥珀酰亞胺酯。
蛋白質與激活的PEG的綴合發生在適當的緩沖溶液中。除了其他因素，緩沖溶液的性質取決于聚合物的官能團和綴合的目的。例如，如果需要通過游離氨基與官能化的PEG綴合而成N-羥基琥珀酰亞胺酯，那么用預定的pH將可以在一定程度上預測綴合位點。pH值約為9對于通過賴氨酸的ε-氨基進行綴合是有利的。
另一個例子是，當與醛基官能團綴合時，稍酸性的pH將允許PEG化優選發生在蛋白質的N-末端上。然后可以通過不同的色譜技術進行感興趣的綴合物的純化。
在本發明的一個實施方案中，所述的綴合物是，其中的親核基團包含在選自蛋白質、肽和多肽的生物分子中。
必須分析綴合物的某些化學、物理和生物學性質，盡可能地完成對純化的綴合物的特征描述。例如，通常可以通過紫外線光譜法(在280nm處的吸光度)來確定綴合物的濃度，這是因為PEG殘基幾乎不會影響蛋白質的消光系數。必須通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)確定純化產品的純度，這是因為色譜法例如凝膠過濾很難分辨感興趣的綴合物和污染物所對應的信號。通過常用方法可以研究其他的物理-化學性質。
該操作的結果是，本發明的一個優選的成果是描述了綴合物的制備，其中蛋白質選自干擾素α-2b、鏈激酶、粒細胞集落刺激因子、紅細胞生成素或表皮生長因子。
附圖1.保護免受蛋白酶的降解。X-軸表示時間，單位為小時；Y-軸是未降解的蛋白質的量，單位是對時間為0時的量的百分比。
附圖2.耐熱性。X-軸表示時間，單位為天；Y-軸是未降解的蛋白質的量，單位是對時間為0時的量的百分比。
具體實施方式
/實施例 實施例1.激活為N-羥基琥珀酰亞胺酯的PEG的合成 結構的獲得和激活 獲得單甲氧基聚乙二醇的琥珀酰亞胺碳酸酯(SC-PEG) 將分子量為12,000Da(mPEG12K)的15g單甲氧基聚乙二醇溶解于500mL甲苯中，并共沸干燥3小時。然后將體積減小至250mL，反應混合物冷卻至室溫。向該溶液中加入下列試劑60mL的干燥二氯甲烷，溶解于15mL干燥丙酮中的2g二琥珀酰亞胺碳酸酯(DSC)，和溶解于甲苯DCM為3:1混合物10mL中的1g二甲氨基吡啶。反應在攪拌下過夜(16小時)。用1L的冷乙醚沉淀反應混合物，過濾收集沉淀。將產物溶解于丙酮中，并用乙醚沉淀，如此重結晶3次。高真空下干燥最終產物，并貯存于-20℃的氮氣下。該方法的最終收率在90％以上。通過與甘氨酰(glycil)-甘氨酸反應來確定激活的PEG的份數，通過與TNBS反應來定量游離的氨基。
獲得二PEG化的賴氨酸(Lys-2PEG) 將12g的SC-PEG12K與溶解于100mM硼酸鹽緩沖液的pH8.5的濃度為0.2mg/mL的46mg L-(+)-賴氨酸反應。反應在室溫下攪拌過夜(16小時)。然后用重蒸餾水將反應混合物稀釋5倍，并用鹽酸調節pH。用1體積的DCM將PEG萃取3次。用無水硫酸鈉干燥合并的3次萃取部分并過濾。在旋轉式蒸發器中濃縮PEG的DCM溶液直至20mL。用120mL的冷乙醚沉淀該濃縮物，過濾收集并高真空下干燥。用DEAE瓊脂糖通過離子交換色譜從反應混合物的剩余組分中分離Lys-2PEG。
用3體積的100mM硼酸鹽緩沖液，pH7.5使包含1L色譜基質的柱達到平衡，然后用5體積的重蒸餾水洗滌。將10g的反應混合物以5mg/mL溶解于重蒸餾水中。用2體積的重蒸餾水洗滌該柱，清除未反應的PEG，用1mM的氯化鈉溶液洗脫Lys-2PEG。用鹽酸將該部分的pH調節至3并用1體積的DCM萃取3次。用無水硫酸鈉干燥合并的3次萃取部分并過濾。在旋轉式蒸發器中濃縮PEG的DCM溶液直至10mL。用60mL的冷乙醚沉淀該濃縮物，過濾收集并高真空下干燥。通過SDS-PAGE確定純度，用5％的氯化鋇溶液和100mM碘給凝膠染色。通過MALDI-TOF確定的分子量是23.0-24.5kDa。該方法的總收率在40％以上。
激活二PEG化的賴氨酸成為N-羥基琥珀酰亞胺酯(PEG2，12K-NHS) 將6g的Lys-2PEG溶解于20mL的干燥DCM中，并加入60mg的N-羥基琥珀酰亞胺和250mg的N，N’-二環己基碳二亞胺(DCC)。將反應在室溫和攪拌下保持24小時。過濾混合物，并通過旋轉蒸發濃縮至5mL。用20mL的冷乙醚沉淀產物，將其溶解于丙酮并用乙醚沉淀，如此重結晶3次。高真空下干燥最終產物，并貯存于-20℃的氮氣下。該方法的總收率在95％以上。通過與甘氨酰-甘氨酸反應來確定激活的PEG的份數，通過與TNBS反應來定量游離氨基的個數。
獲得樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG 將5g的PEG2，12K-NHS與溶解于100mM硼酸鹽緩沖液的pH8.5的濃度0.1mg/mL的7mg L-(+)-賴氨酸反應。反應在室溫下攪拌16小時進行。然后用重蒸餾水將反應混合物5倍稀釋，并用鹽酸調節pH至3。用1體積的DCM將PEG萃取3次。用無水硫酸鈉干燥合并的3次萃取部分并過濾。在旋轉式蒸發器中濃縮PEG的DCM溶液直至5mL。用30mL的冷乙醚沉淀該濃縮物，過濾收集并高真空下干燥。在G3000PW柱中通過大小排阻層析法純化樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG。用鹽酸將包含所需結構的部分的pH調節至3，用1體積的DCM萃取3次。用無水硫酸鈉干燥合并的3次萃取部分并過濾。在旋轉式蒸發器中濃縮PEG的DCM溶液直至5mL。用30mL的冷乙醚沉淀該濃縮物，過濾收集并高真空下干燥。通過SDS-PAGE確定純度，用5％的氯化鋇溶液和100mM碘給凝膠染色，純度在98％以上。通過MALDI-TOF確定的分子量是45.5-50kDa。該方法的總收率在30％以上。
樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG官能化為N-羥基琥珀酰亞胺酯(PEG4，12K-NHS) 將1.5g的樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG溶解于5mL的干燥DCM中，并加入9mg的N-羥基琥珀酰亞胺和37mg的N，N’-二環己基碳二亞胺。將反應在室溫和攪拌下保持24小時。過濾產物，并用20mL的冷乙醚沉淀。將其溶解于丙酮并用乙醚沉淀，如此將沉淀重結晶3次。高真空下干燥最終產物，并貯存于-20℃的氮氣下。該方法的總收率在95％以上。通過與甘氨酰-甘氨酸反應來確定激活的PEG的份數，通過與TNBS反應來定量游離的氨基個數。
實施例2.用PEG4，12K-NHS獲得IFN-α2b綴合物 綴合反應 將活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯(PEG4，12K-NHS)的4g樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG加入到溶液中，該溶液是包含濃度為6mg/mL的1gIFN-α2b的120mM硼酸鹽緩沖液，且pH 8.5的溶液。溫和攪拌下將反應在4℃下保持1小時，然后用pH 4的10mM乙酸鈉緩沖溶液稀釋50倍來停止反應。通過SDS-PAGE的光密度測定來確定反應的收率，用考馬斯亮藍R-250染色。含有樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的單PEG化IFN-α2b的份數在40％以上。
純化含有樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的單PEG化IFN-α2b 用3體積的pH 4的10mM乙酸鹽緩沖液，以40mL/分鐘的流速使包含500mL的觸須型樹脂填料Fractogel EMD 650(M)COO-的XK50/60柱(Pharmacia公司)達到平衡。以相同流速將包含反應混合物的溶液應用于該柱。用pH4的40mM乙酸鹽緩沖液、和25mM的氯化鈉進行2小時的洗滌，以清除未反應的PEG和具有一個以上的PEG殘基的綴合物。用pH4的50mM乙酸鈉緩沖液、和150mM的氯化鈉洗脫單PEG化的綴合物。純度在96％以上，主要的污染物是未變性的干擾素和二PEG化的綴合物。濃縮感興趣的部分直至200mL，并應用于XK 50/60柱(Pharmacia)上，該柱包含用pH7的50mM磷酸鹽緩沖溶液，及用100mM氯化鈉平衡的1L的Sephadex G-25。通過0.2μm孔徑的乙酸纖維素膜過濾含有樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的單PEG化的干擾素，并在4℃下貯存。
實施例3.PEG4，12K-IFN-α2b的物理-化學性質 確定綴合物的濃度 通過在280nm的UV-吸光度確定作為蛋白質殘基的函數的綴合物濃度。認為一個吸光度單位等于1mg/mL的濃度。
確定綴合物的分子量 通過MALDI-TOF確定綴合物的分子量。期望的樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的平均分子量是48,000 Da，IFN-α2b的平均分子量是19,200Da，因此該綴合物的理論分子量是67,200Da。PEG4，12K-IFN-α2b的計算分子量是64,000-70,000Da。
實施例4.PEG4，12K-IFN-α2b綴合物的生物學性質 在ELI SA-型分析中綴合物的免疫鑒定 將不同濃度的綴合物樣品和陰性對照物應用于ELISA微量滴定板上，該滴定板上補充有對抗IFN-α2b的單克隆抗體。接著，加入另一種單克隆抗體，其中該抗體識別IFN-α2b的另一個表位，與辣根過氧化物酶結合。我們認為，當綴合物樣品的吸光度高于陰性樣品的吸光度的平均值加上這些值的標準差的3倍時，該樣品就是免疫識別的。在所有情況中，這些樣品都被識別。
體外抗病毒活性 通過抑制腦心肌炎病毒對Hep-2細胞(ATCC No.CCL23)產生的細胞病變效應來確定體外抗病毒活性。在96-孔微量滴定板的細胞單層中混合綴合物的最小必需培養基的系列稀釋液(1:2)，其中該培養基含有2％胎牛血清和40μg/mL的慶大霉素。將該板在3％二氧化碳大氣、95％相對濕度和37℃下培養24小時。加入病毒(107TCID)，培養該板，直至細胞病變效應變得明顯(90％細胞溶解)。通過用結晶紫將細胞染色來測定細胞破壞的程度。用國際單位(IU)表示每種樣品的活性，用世界衛生組織的IFN-α2b國際標準69/19計算，表1是所得到的結果。
表1.天然IFN-α2b和與樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG綴合的IFN-α2b的體外抗病毒活性
體外抗增殖活性 通過綴合的IFN-α2b抑制Daudi細胞(Burkitt Lymphoma)生長的能力來測定體外抗增殖活性。結果表明，PEG4，12K-IFN-α2b的體外活性等于未變性的IFN-α2b的5％。
實施例5.PEG4，12K-IFN-α2b的物理-化學穩定性 對于蛋白酶降解的抵抗性 將包含400μg/mL天然IFN-α2b與類似分子量的兩或四支鏈-PEG的綴合物的40微升4％碳酸氫鈉溶液，pH 8與10μL的160μg/mL胰島素溶液混合。將樣品在37℃下培養一段時間。用10μL的三氟乙酸使反應停止。通過SDS-PAGE分析中譜帶的消失來評價蛋白質(綴合或未綴合)的殘留量，用考馬斯亮藍染色。結果(附圖1)表明，四個支鏈的PEG結構(▲)對IFN-α2b綴合物降解的保護優于類似分子量的兩個支鏈-結構(●)產生的保護。
熱穩定性 為了確定具有樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的IFN-α2b綴合物的穩定性，將天然和綴合后的蛋白質樣品在60℃的磷酸鹽緩沖溶液中進行培養。使用類似分子量的兩支鏈-PEG的IFN-α2b綴合物樣品作為對照。在某些時間分離樣品，通過SDS-PAGE分析中譜帶的消失來評價蛋白質(綴合或未綴合)的殘留量，用考馬斯亮藍染色。結果(附圖2)表明，具有四個支鏈的結構的綴合物(▲)的熱穩定性高于其他兩種情況[天然IFN(■)，與兩個支鏈結構的IFN綴合物(●)]。
實施例6.PEG4，12K-IFN-α2b的藥代動力學 在平均重量為2kg的新西蘭兔中進行未變性干擾素和與樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的蛋白質綴合物之間的比較藥代動力學研究。使用兩支鏈-PEG的IFN-α2b綴合物作為對照。通過每kg體重150μg蛋白質的皮下途徑來注射生物分子。在144小時的間隔里，在預定時間取血樣。離心樣品，分離血清，并在-20℃下貯存至分析。用對該細胞因子具有特異性的單克隆抗體通過ELISA-型分析來確定IFN-α2b濃度(綴合或未綴合)。判讀是基于經典的房室乳突模型。結果如表2所示。
表2.天然IFN-α2b、與兩支鏈-PEG綴合的IFN-α2b和PEG4，12K-IFN-α2b的比較藥代動力學 實施例7.其他治療性蛋白質與樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的綴合 其他治療性蛋白質例如重組鏈激酶(r-SK)、紅細胞生成素(EPO)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和表皮生長因子(EGF)可以與樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG綴合。評價綴合對蛋白酶降解率的效應。
激活為N-羥基琥珀酰亞胺酯的樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的綴合 將100mg的激活為N-羥基琥珀酰亞胺酯的樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG(PEG4，12K-NHS)加入到溶液中，該溶液是包含6mg/mL的25mg治療性蛋白質的120mM硼酸鹽緩沖溶液、pH 8.5的溶液。溫和攪拌下將反應在4℃下保持1小時，然后用10mM乙酸鈉緩沖溶液，pH4稀釋50倍來停止反應。通過SDS-PAGE的光密度測定來確定反應的收率，用考馬斯亮藍R-250將樣品染色。在所有情況中，含有樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的單PEG化的蛋白質的比例都在30％以上。
用激活為醛的樹枝狀大分子樣PEG進行綴合 將100mg的激活為醛的樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG(PEG4，12K-ALD)加入到溶液中，該溶液是包含4mg/mL的15mg治療性蛋白質的100mM乙酸鹽緩沖溶液、pH 5并包含20mM氰基硼氫化鈉的溶液。溫和攪拌下將反應在4℃下持續24小時，然后用1mM HCl稀釋20倍來停止反應。通過SDS-PAGE的光密度測定來確定反應的收率，用考馬斯亮藍R-250將樣品染色。在所有情況中，含有樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的單PEG化的蛋白質的比例都在30％以上。
樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的綴合對于蛋白酶降解蛋白質的效應 將包含400μg/mL天然蛋白質、或與四支鏈-PEG的綴合物的40微升4％碳酸氫鈉溶液，pH 8與10μL的160μg/mL胰島素溶液混合。將樣品在37℃和溫和攪拌下培養4小時。然后用10μL的三氟乙酸使反應停止。通過SDS-PAGE分析中譜帶的消失來評價蛋白質(綴合或未綴合)的殘留量，用考馬斯亮藍染色。結果(表3)表明，與樹枝狀大分子樣四支鏈-PEG的綴合保護了綴合的蛋白質免受胰島素的降解。在所有情況中，不依賴于所使用的化學綴合方法，在與胰島素反應4小時后，超過35％的蛋白質都沒有消化。但是，天然蛋白質在該反應時間后，沒有檢測到任何信號。
表3相對于反應前的蛋白質量，未消化的蛋白質的份數(％)
權利要求
1.聚合樹枝狀大分子樣結構，包括四個支鏈的單甲氧基-聚乙二醇，其可以表示為
用于獲得藥學目的的綴合物。
2.權利要求1的聚合結構，其中每個PEG鏈的分子量是5,000-30,000Da，總分子量是20,000-120,000Da。
3.權利要求2的聚合結構，活化用于與親核基團綴合，通過羧基官能化獲得。
4.一種綴合物，包含權利要求1的聚合結構和親核基團。
5.權利要求4的綴合物，其中親核基團包含在選自蛋白質、肽和多肽的生物分子中。
6.權利要求5的綴合物，其中蛋白質選自干擾素α 2-b、鏈激酶、粒細胞集落刺激因子、紅細胞生成素或表皮生長因子。
全文摘要
本發明涉及具有四個支鏈的單甲氧基-聚乙二醇的聚合樹枝狀大分子樣結構，其可以表示為右式，可以將前述結構的羧基官能化，以產生藥學目的的綴合物，該樹枝狀大分子樣聚乙二醇與治療性蛋白質的結合改善了它們的體外和體內穩定性。
文檔編號A61K47/48GK101389354SQ200680049165
公開日2009年3月18日 申請日期2006年11月20日 優先權日2005年11月30日
發明者J·A·拉蒙赫爾南德茲, F·R·卡斯特羅奧迪澳, V·M·賽茲瑪提內茲, R·派斯梅雷萊斯, E·菲爾南德茲薩恩徹茲 申請人:遺傳工程與生物技術中心