專利名稱：輔酶復合物的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種輔酶復合物的制備方法。
背景技術：
輔酶復合物是由多種輔酶和生物活性物質組成，主要含有輔酶A、輔酶I、三磷酸腺苷、還原型谷胱苷肽和核苷酸等生物活性物質。它們大都是人體內乙酰化反應，氧化還原反應、轉甲基反應和能量代謝的重要酶的輔酶，對體內糖、蛋白質、脂肪及能量代謝起著重要作用，在糖酵解、三羧酸循環，脂肪酸β-氧化、肝糖元的合成和分解、乙酰膽堿的合成、組織呼吸、能量轉移、保肝解毒、抗放射(輻射)作用等方面，均與其密切相關，其產品市場前景非常廣闊。
目前，國內復合輔酶生產主要是依據中國專利200410058086.X中所述的高壓均質破壁——活性炭提取分離——離子交換樹脂純化——超濾純化——丙酮沉淀等步驟。其缺點在于1.各工藝之間無法連貫的銜接，需要進行中間處理之后才能進入下一工序。2.工藝步驟中活性炭洗脫時所采用的堿性環境對輔酶活性有嚴重的破壞作用。3.將超濾置于離子交換樹脂純化之后，使超濾的作用效果大幅下降。4.各工藝環節繁瑣，對操作人員要求較高。
發明內容
本發明的目的在于提供一種輔酶復合物的制備方法。
為達到上述目的，本發明采用如下技術方案一種輔酶復合物的制備方法，其特征是該方法的步驟如下a)原材料的處理將酵母與冰水混合物按1∶1∶2～4的質量比混合后，置于沸水中，然后在80℃～100℃溫度下保溫5～10min，迅速投入碎冰冷卻，經離心機離心分離，取上清液，離心條件為4000rpm～6000rpm，時間為15～30min；b)超濾分離將步驟a所得上清液置于超濾器，在0.1～0.3MPa超濾壓下進行分離純化，取濾出液；所述超濾器采用切割分子量8000～12000的超濾膜；c)柱層析純化將步驟b所得的濾出液用強堿型陰離子交換樹脂進行吸附，洗脫體系為0.2mol/L NaCl溶液，并用0.1mol/L HCl調節pH到1.5～2.0，洗脫流速為150～250mL/h，并用核酸蛋白檢測儀實時監測流出液OD值，收集在254nm波長下有光吸收的部分；d)濃縮將步驟c所得洗脫液置于旋轉蒸發儀中，在55℃～60℃溫度下減壓濃縮至原體積的1/15～1/20；e)沉淀析出將步驟d所得濃縮液的pH值調至2～3，緩慢倒入10～20倍體積，-10℃～-20℃的丙酮溶液中，該溶液用5～8mol/L硝酸調節pH到2～3，靜置過夜，取沉淀，即得輔酶復合物。
上述的酵母為啤酒酵母、面包酵母或食用酵母；所述的強堿型陰離子交換樹脂有717型樹脂以及711型樹脂。
同現有技術相比，本發明方法采用溫差破壁、減壓濃縮等成熟工藝，在取得令人滿意的產品得率的同時，降低了對生產設備的要求。其次，充分利用了現有設備，將超濾步驟提前，一方面代替活性炭的分離提取，減少了工藝環節，同時避免了洗脫時堿性環境對輔酶活性的破壞。另一方面，由于超濾可以將大部分分子量大、粘度高的雜質除去，再進入層析柱，降低了分離難度，提高了層析分離純化的效率以及層析的生產速度。第三，在本發明工藝中各提取純化步驟之間無須各種附加處理，可以直接進入下一步操作，因此，可以使整個工藝做到無縫式，連續化，自動化操作，提高了整個過程的整體性，降低了生產周期，簡化了操作步驟。所得產品色澤呈淡黃色、疏松，符合國家相關標準WS1-XG-010-2002。
具體實施例方式
1.將面包酵母與水、冰按1∶1∶2的比例混合后，置于1體積沸水中，90℃保溫5min，迅速投入碎冰冷卻。置離心機4800rpm離心分離30min，取上清液。
2.將上清液置于裝有切割10000分子量超濾膜的超濾器中，0.2MPa超濾壓下進行分離純化，取濾出液。
3.將濾出液用717強堿型陰離子交換樹脂進行柱層析吸附純化，0.2mol/LNaCl(用0.1mol/L HCl調節pH為1.7)體系洗脫，在洗脫時采用蠕動泵控制流速在200mL/h，核酸蛋白檢測儀實時監測流出液OD值，收集在254nm波長下有光吸收的部分。
4.將洗脫液置于旋轉蒸發儀中，58℃減壓濃縮至原體積的1/20。
5.將濃縮液用8mol/L的硝酸調節pH至2.3，緩慢倒入15倍體積，-20℃的酸性丙酮(用5～8mol/L硝酸調節pH為2.3)溶液中，靜置過夜，取沉淀，即得成品。
最終得到的成品呈淡黃色粉末、疏松，得率為8％左右。其中含有輔酶A(CoA)、輔酶I(CoI)、谷胱苷肽(GSH)等主要成分外，還含有微量的腺三磷(ATP)，黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，黃素單核苷酸(FMN)，腺一磷(AMP)，腺二磷(ADP)，腺苷蛋氨酸(SAM)。輔酶A純度為1.5～3.0U/mg、輔酶I純度為0.0015～0.003mg/mg、谷胱苷肽純度為0.017～0.07mg/mg。
采用以上方法所得產品依據國家藥品標準WS1-XG-010-2002檢驗結果如下
其結果符合國家標準。
權利要求
1.一種輔酶復合物的制備方法，其特征是該方法的步驟如下a.原材料的處理將酵母、水和冰混合物按1∶1∶2～4的質量比混合后，置于沸水中，然后在80℃～100℃溫度下保溫5～10min，迅速投入碎冰冷卻，經離心機離心分離，取上清液，離心條件為4000rpm～6000rpm，時間為15～30min；b.超濾分離將步驟a所得上清液置于超濾器，在0.1～0.3MPa超濾壓下進行分離純化，取濾出液；所述超濾器采用切割分子量8000～12000的超濾膜；c.柱層析純化將步驟b所得的濾出液用強堿型陰離子交換樹脂進行吸附，洗脫體系為0.2mol/L的NaCl溶液，并用0.1mol/L HCl調節pH到1.5～2.0，洗脫流速為150～250mL/h，并用核酸蛋白檢測儀實時監測流出液OD值，收集在254nm波長下有光吸收的部分；d.濃縮將步驟c所得洗脫液置于旋轉蒸發儀中，在55℃～60℃溫度下減壓濃縮至原體積的1/15～1/20；e.沉淀析出將步驟d所得濃縮液的pH值調至2～3，緩慢倒入10～20倍體積，-10℃～-20℃的丙酮溶液中，該丙酮溶液用5～8mol/L硝酸調節pH到2～3，靜置過夜，取沉淀，即得輔酶復合物。
2.根據權利要求1所述的一種輔酶復合物的制備方法，其特征在于所述的酵母為啤酒酵母、面包酵母或食用酵母；所述的強堿型陰離子交換樹脂有717型樹脂或711型樹脂。
全文摘要
本發明涉及一種輔酶復合物的制備方法。本發明方法采用溫差破壁、減壓濃縮等成熟工藝，經超濾分離、柱層析純化、濃縮、沉淀析出等步驟得到輔酶復合物。本方明方法在取得令人滿意的產品得率的同時，降低了對生產設備的要求。其次，充分利用了現有設備，將超濾步驟提前，一方面代替活性炭的分離提取，減少了工藝環節，同時避免了洗脫時堿性環境對輔酶活性的破壞。另一方面，由于超濾可以將大部分分子量大、粘度高的雜質除去，再進入層析柱，降低了分離難度，提高了層析分離純化的效率以及層析的生產速度。第三，在本發明工藝中各提取純化步驟之間無須各種附加處理，可以直接進入下一步操作，因此，可以使整個工藝做到無縫式，連續化，自動化操作，提高了整個過程的整體性，降低了生產周期，簡化了操作步驟。所得產品色澤呈淡黃色、疏松，符合國家相關標準WS
文檔編號A61P43/00GK101023968SQ20071003742
公開日2007年8月29日 申請日期2007年2月9日 優先權日2007年2月9日
發明者沈忠明, 朱俊毅, 殷建偉 申請人:上海大學