專利名稱：抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物制劑的制備方法，具體是一種抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法。用于生物工程領域。
背景技術：
犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV)性腸炎是犬最常見的傳染病之一，其發病率與死亡率高達50％～100％，嚴重影響犬的健康。近年來，隨著城鄉肉用犬及寵物犬飼養數量的增加，該病的發病率呈上升趨勢。目前對患病犬一般采用對癥和支持治療，治愈率很低，尤其是對2～3月齡幼犬效果更差。有報道用犬、馬、兔、豬、驢等動物制作抗病毒血清，將提純的犬細小病毒性腸炎免疫球蛋白注射液用于治療患病犬。自1992年Yokoyama等發現卵黃抗體能治療仔豬大腸桿菌性腹瀉以來，卵黃抗體已廣泛應用于消化道疾病的防治中。卵黃中的IgY耐消化道屏障，性質穩定。
經對現有技術的文獻檢索發現，王玉燕等在《中國預防獸醫學報》(2003年第25卷第3期)發表的“抗CAD、CAV卵黃抗體的制備”一文，該研究用CDV、CAV分別免疫產蛋雞，收集雞蛋，用海藻酸鈉-硫酸銨法提取卵黃抗體(IgY)，并對提取的IgY采用了SDS-PAGE和低壓層析檢測純度，用間接ELISA測定提取的IgY的活性。但是該方法需對卵黃抗體進行多步提純后使用，制備工藝繁瑣，成本高且IgY的活性損失較大。
發明內容
本發明針對現有技術的不足和缺陷，自制疫苗，在強化免疫的基礎上，提供一種抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，使其建立抗犬細小病毒抗體效價評定依據，將具有生物活性的卵黃抗體制備成無副作用的能直接飲用的口服生物制劑或利于保存的粉劑，該制劑也可作為寵物保健品或生物制藥的原料。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟步驟一，采集診斷為細小病毒感染的病死犬的腸道及內容物按重量比1∶1加生理鹽水研磨，離心去除沉渣，上清液20000rpm離心60分鐘去除微小顆粒；步驟二，按去除微小顆粒后的上清液總體積的10％加入氯仿，劇烈振蕩，離心去除脂溶性物質；步驟三，取去除脂溶性物質后的上清液，按其總體積的10％加入用體積百分比濃度為2.5％戊二醛醛化、洗滌后的豬紅細胞，搖勻4℃放置2小時進行病毒吸附，離心沉淀豬紅細胞，用體積比為4％的鹽水配成體積比10％的紅細胞懸液，37℃放置2小時進行病毒釋放，離心去除豬紅細胞，取病毒釋放液，釋放液中的病毒HA效價達1∶4096有效；步驟四，取上述病毒釋放液經甲醛滅活后加入褐藻多糖，使每毫升液體含4毫克，制備成油乳劑疫苗，即犬細小病毒疫苗；將制備的犬細小病毒疫苗免疫20周齡以上經產母雞后，用血凝抑制試驗(HI)進行效價測定，當卵黃中HI效價達1∶256以上時收集免疫卵，效價低于1∶128時進行第三次免疫；步驟五，收獲卵黃用無菌蒸餾水對倍稀釋，用乳酸液調pH4.4進行酸處理去除雜蛋白、-40℃凍融處理2次去除脂質，抽濾液經35％飽和硫酸銨鹽析、除鹽后即可獲得IgY，稀釋封裝在安培瓶中，放65℃水浴箱處理20分鐘，經口服安全性檢驗、微生物檢驗合格后即成安全的口服生物制劑，其IgY的得率達95％以上，活性不受任何影響，5毫升卵黃混合液中提取后可獲得IgY26毫克以上，一個免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。本發明制得的制劑噴霧干燥成粉劑后IgY的活性不變。
本發明的基本原理是利用家禽作為生物反應器生產各類生物活性物質。當供試雞免疫后即產生特異性抗體，血液中的抗體逐漸進入卵黃并蓄積。該抗體穩定，經口服后能抵抗胃酸的破壞，活性物質封閉胃腸中的特異性病原入侵受體或直接中和特異性病原體或毒素，從而達到預防和治療的目的。
與現有技術相比，本發明的有益效益是感染細小病毒的病犬，可直接口服生物制劑替代其他生物制劑的注射治療，幼犬臨床治愈率高達95％以上，也可添加于寵物保健品中口服，可預防幼犬感染細小病毒。該方法成本低，見效快，一個免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。
具體實施例方式
下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1犬細小病毒野毒采集取診斷為細小病毒感染的病死犬的腸道及內容物按重量比1∶1加生理鹽水研磨，離心去除沉渣，上清液20000rpm高速離心60分鐘去除微小顆粒。
病毒初提按上清液總量的10％加入氯仿，劇烈振蕩，離心去除脂溶性物質。
病毒吸附取上清液按總量的10％加入用體積百分比濃度為2.5％的戊二醛醛化的洗滌后的豬紅細胞，搖勻4℃放置2小時，離心沉淀豬紅細胞。
病毒釋放用4％濃度的高滲鹽水將沉淀的豬紅細胞配成體積比10％的懸液，37℃2小時，離心去除豬紅細胞。
HA效價測定釋放液中的病毒效價用HA試驗進行檢測，達1∶4096有效。
疫苗水相制備取上述病毒釋放液經甲醛滅活后加入褐藻多糖，使每毫升釋放病毒液體含4毫克褐藻多糖，并加入無菌的吐溫80。
疫苗油相制備在10號白油中加入硬脂酸鋁和司本80，滅菌后備用。
疫苗制備按水相與油相之比1∶1在高速搗碎機中進行乳化，制備成油乳劑疫苗。
免疫選擇20周齡以上經產母雞，用上述制備的油乳劑疫苗(即犬細小病毒油乳劑苗)進行免疫，第一次肌注0.5ml，10天后第二次免疫，肌注1ml，14天后用血凝抑制試驗(HI)進行效價測定，當卵黃中HI效價達1∶256以上時收集免疫卵。
IgY提取收獲卵黃用無菌蒸餾水對倍稀釋，用乳酸液調pH4.4進行酸處理去除雜蛋白、-40℃凍融處理2次去除脂質，抽濾液備用。
IgY純化經35％飽和硫酸銨鹽析、除鹽后即可獲得較純的IgY。
口服制劑制備用無菌水將提純的抗細小病毒IgY稀釋成每毫升加入褐藻多糖后的釋放病毒液體含2毫克IgY，封裝在安培瓶中，放65℃水浴箱處理20分鐘，經口服安全性檢驗、微生物檢驗合格后即成安全的口服生物制劑。
實施例2犬細小病毒野毒采集、病毒初提、病毒吸附釋放試驗提純、HA價檢測、疫苗制備同實施例1。第一次免疫，免疫劑量每頭份0.5ml。間隔10天進行第二次免疫，免疫劑量為1ml。免疫14天后，用血凝抑制試驗對卵黃進行效價測定，當效價低于1∶128時，進行第三次免疫，免疫劑量為1ml，14天后收集免疫卵，其后抗細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法同實施例1。
用上述方法制備疫苗、免疫、IgY提取與純化，IgY的得率達95％以上，活性不受任何影響，5毫升卵黃混合液中提取后可獲得IgY26毫克以上，一個免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。該制劑噴霧干燥成粉劑后IgY的活性不變。
細小病毒感染犬，每次按每公斤體重0.5ml，口服生物制劑不少于1ml，連用3天，能有效治愈病犬，細小病毒病幼犬的治愈率達95％以上，或制備成寵物保健品，或用于治療犬細小病毒病的藥物中。
權利要求
1.一種抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，采集診斷為細小病毒感染的病死犬的腸道及內容物按重量比1∶1加生理鹽水研磨，離心去除沉渣，上清液離心去除微小顆粒；步驟二，在去除微小顆粒后的上清液中加入氯仿，劇烈振蕩，離心去除脂溶性物質；步驟三，取去除脂溶性物質后的上清液，加入醛化、洗滌后的豬紅細胞，搖勻放置進行病毒吸附，離心沉淀豬紅細胞，加入高滲鹽水后放置進行病毒釋放，離心去除豬紅細胞，取病毒釋放液，測HA效價，達1∶4096有效；步驟四，取上述病毒釋放液經甲醛滅活后加入褐藻多糖，制備成油乳劑犬細小病毒疫苗，將制備的犬細小病毒疫苗免疫20周齡以上經產母雞，用血凝抑制試驗進行效價測定，當卵黃中HI效價達1∶256以上時收集免疫卵，效價低于1∶128時進行第三次免疫；步驟五，收獲卵黃用無菌蒸餾水對倍稀釋，用乳酸液進行酸處理去除雜蛋白、凍融去脂，抽濾液經硫酸銨鹽析提取IgY，除鹽后稀釋封裝安培瓶中，放水浴箱處理，經口服安全性檢驗及微生物檢驗合格后即成口服生物制劑。
2.根據權利要求1所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟一中，所述上清液離心去除微小顆粒，是指上清液在20000rpm離心60分鐘去除微小顆粒。
3.根據權利要求1所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟二中，所述加入氯仿，是指按去除微小顆粒后的上清液總體積的10％加入氯仿。
4.根據權利要求1所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟三中，所述醛化，是指用體積百分比為2.5％的戊二醛對豬紅細胞進行醛化；所述搖勻放置進行病毒吸附，是指搖勻4℃放置2小時進行病毒吸附。
5.根據權利要求1或4所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟三中，所述加入高滲鹽水后放置，是指加入體積比為4％的鹽水配成體積比10％的紅細胞懸液，在37℃放置2小時。
6.根據權利要求1所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟四中，所述褐藻多糖，其使用量為每毫升釋放病毒液體含4毫克褐藻多糖。
7.根據權利要求1所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟五中，所述用乳酸液進行酸處理去除雜蛋白，是指用乳酸液調pH4.4進行酸處理去除雜蛋白。
8.根據權利要求1或7所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟五中，所述凍融去脂，是指-40℃凍融處理2次去除脂質。
9.根據權利要求1或7所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟五中，所述經硫酸銨鹽析提取IgY，采用的硫酸銨飽和度為35％；所述稀釋，是指用無菌水稀釋成每毫升加入褐藻多糖后的釋放病毒液體含2毫克IgY。
10.根據權利要求1或7所述的抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，其特征是，步驟五中，所述放水浴箱處理，是指放65℃水浴箱處理20分鐘。
全文摘要
一種抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，采集診斷為細小病毒感染的病死犬病料，離心去除沉渣，上清液離心，取上清液加入氯仿，劇烈振蕩，離心取上清液加入醛化洗滌后的豬紅細胞，搖勻放置，離心取沉淀，加入鹽水后放置，離心取病毒釋放液測HA效價，達14096有效；取上述病毒釋放液經甲醛滅活后加入褐藻多糖制備成油乳劑犬細小病毒疫苗，將該疫苗免疫經產母雞后用血凝抑制試驗測定免疫卵HI效價，達標后收獲卵黃用無菌蒸餾水對倍稀釋，用乳酸液進行酸處理去除雜蛋白、凍融去脂，抽濾液進行鹽析，除鹽后調整IgY的濃度分裝，放水浴箱處理，即成口服生物制劑，其IgY的得率達95％以上，活性不受任何影響，一個免疫卵一般可得IgY 70－100mg。
文檔編號A61P31/00GK101062413SQ20071004047
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月10日 優先權日2007年5月10日
發明者劉永德, 唐峰, 葉陳梁, 汪毅 申請人:上海交通大學