專利名稱：抗sars冠狀病毒的卵黃抗體及其制備方法和液體制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體及其制備方法和液體制劑。
背景技術：
2002年11月份開始在我國廣東地區出現的以發熱、肺部感染為特征的疾病，國際上稱為嚴重急性呼吸綜合征(Severe Acute RespiratorySyndrome，簡稱SARS)。截止2003年5月26日止，全球已有31個國家發現了SARS病例，全球累計病例數達到8202例，我國內地有25個省市自治區有該病流行，累計病例數達到5316例。該病的流行對各國的經濟和社會穩定都產生了非常嚴重的影響。
SARS病毒屬于冠狀病毒科，病毒粒子多呈圓形，有囊膜，外周有冠狀排列的纖突，病毒直徑在80-120nm之間。該病毒散在分布于細胞漿中，呈圓形，直徑多在90nm左右。感染病毒的細胞線粒體腫脹，部分線粒體外膜或嵴溶解。
SARS冠狀病毒為單鏈單節段(+)RNA病毒，全長29.725kb，具有11個ORF(Open Reading Frames)，分別編碼依賴于RNA的RNA聚合酶、4種結構蛋白(S，E，M，N蛋白)、5種未知蛋白，與其它宿主來源冠狀病毒的序列比較，進化分析，呈一單獨的分支。該病毒在增殖過程中雖沒有逆轉錄過程，但RNA聚合酶沒有矯正機制，變異較大，現已知SARS病毒至少有6個變種。這給治療SARS帶來了巨大困難。
經過序列測定并比較，SARS病毒基因組與其他冠狀病毒的結構相似。SARS病毒基因組初步的基因組注釋在NCBI(Genebank Accession No.NC 004718)完成，預測得到的主要蛋白質有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a，1b)，S蛋白(spike protein)，M蛋白(matrix protein)，N蛋白(nucleocapsidprotein)、E(small envelope protein)蛋白等。
SARS的流行病學特點及臨床過程與以往的冠狀病毒感染有極大的不同，大多數SARS發生在青壯年。SARS的最常見的傳染途徑為密切接觸，包括傳染性的飛沫以及直接與傳染性體液接觸。
截至目前，人們還沒有找到很好的預防和治療SARS病毒的方法。目前常用的預防SARS病毒的消毒劑主要有含氯消毒液和過氧乙酸消毒劑，以及最新研發出來的新型的含溴消毒劑，這些消毒劑盡管可以有效的殺滅冠狀病毒，但同時它們對人體有比較強烈的刺激性和腐蝕性，因此只能用于日常物品的消毒，無法對人體進行消毒保護。在治療SARS方面，目前人們還沒有非常好的治療手段，基本上都是針對出現的體征，進行對癥治療。
發明內容
本發明所要解決的技術問題之一是克服現有技術上的不足，提供一種方便、高效、無毒副作用、可對人體進行消毒的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體。
本發明所要解決的技術問題之二是提供一種所述抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法。
本發明所要解決的技術問題之三是提供一種使用方便的可預防和治療SARS冠狀病毒引起的嚴重急性呼吸綜合征的液體制劑。
本發明所采用的技術方案是一種抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，它按照非變性聚丙烯凝膠電泳進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶；或按照變性聚丙烯凝膠電泳進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法，它包括以下步驟(1)、制備單一抗原或復合抗原①、基因重組法利用基因工程的方法，構建含有SARS冠狀病毒的S蛋白、M蛋白、E蛋白的表達質粒，在大腸桿菌宿主中進行表達，然后分離并純化表達產物作為單一蛋白抗原；取上述分離純化后的表達產物二種或二種以上進行組合可得所述的復合蛋白抗原。
②、多肽合成法利用多肽合成儀合成SARS冠狀病毒S蛋白或M蛋白或E蛋白的以下任一抗原表位的多肽，作為單一多肽抗原。所述S蛋白的抗原表位分別為PepS1(dvqapnytqhtssmrg)PepS2(stgnynykyrylrhgklrp)PepS3(psskrfqpfqqfg)PepS4(vrdpktseildispc)PepS5(aaeqdrntrevfa)PepS6(lpdplkptkrsfi)PepS7(psqernfttapaic)
PepS8(peldsfkeeldk)PepS9(qelgkyeqyikwp)PepS10(snfrvvpsgdvvrfp)PepS11(ctdvstaihadqltpa)PepS12(keeldkyfk nhtspdvd)所述M蛋白的抗原表位分別為PepM1(madngtitveelkq)PepM2(ysnrnrflyiik)PepM3(artrsmwsfnpetn)PepM4(aviirghlrmaghslgrc)PepM5(gasqrvgtdsgf)PepM6(nyklntdhagsndniallvq)所述E蛋白的抗原表位分別為PepE1(mysfvseetgt)PepE2(vkptvyvysrv)PepE3(knlnssegvpdllv)任取上述21種單一多肽抗原中的二種或二種以上進行組合可得所述的復合多肽抗原。
③、多肽抗原偶聯法其步驟是，a、取1mg KLH或BSA于1.5ml離心管中，用100μl的PH10.0硼酸緩沖液充分溶解，10000rpm離心1分鐘，將上清轉移到干凈的離心管；
b、稱上述方法②制得的22個抗原表位之一的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸緩沖液溶解；c、將步驟a制得的KLH或BSA溶液逐滴加到多肽溶液中；d、邊震蕩邊緩慢加入新鮮配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室溫作用2小時，中間倒轉試管數次；e、加入1M甘氨酸25μl，反應30min；f、以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜，換液一次，繼續透析不少于4小時。
按上述步驟對方法②制得的21個抗原表位的多肽偶聯后的抗原作為單一多肽抗原，任取上述二種或二種以上單一多肽抗原進行組合可得所述的復合多肽抗原。
④、野生型毒株全病毒滅活法a、SARS冠狀病毒的培養取新鮮的SARS冠狀病毒懸液，接種于Vero E6細胞，在33～35℃的CO2培養箱內培養5～9天后，收集病變細胞的上清液。
b、SARS冠狀病病毒的滅活向步驟a所制得的病毒上清液中，加入甲醛溶液使其終濃度為0.1～3％，37℃作用24～96小時，使SARS冠狀病毒完全滅活。
c、SARS冠狀病毒的濃縮將經過步驟b滅活的病毒懸液超濾后得到濃縮的滅活SARS冠狀病毒。
按照上述步驟所得到的滅活的SARS冠狀病毒作為單一抗原。
(2)、制備抗體①、佐劑的選用
初次免疫選用弗氏完全佐劑與所述單一抗原或復合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑與所述單一抗原或復合抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。
②、對產卵母雞的免疫及取卵選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。
③、卵黃抗體的提取卵黃抗體的提取可采用以下四種方法之一a、用水稀釋法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，以去離子純水稀釋，適當調節PH值，4℃攪拌4小時，離心后棄去沉淀，將上清濃縮、冷凍干燥，即得抗體。
b、采用PEG沉淀法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，加入3倍蛋黃體積的4％的PEG進行稀釋，充分攪拌混勻后4℃，1300rpm離心10分鐘，取上清，然后向上清內逐滴滴加1/6上清體積40％的PEG后充分攪拌混勻后4℃，1300rpm離心10分鐘，收集沉淀，冷凍干燥，即得抗體。
c、膜過濾法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，以去離子水稀釋，4℃靜置12小時后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD～200KD的蛋白物質，冷凍干燥即得抗體。
d、硫酸銨沉淀法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，提取3次以等體積的生理鹽水稀釋收集到的蛋黃并混合均勻后，緩慢滴加2倍體積的50％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，于4℃，13000rpm離心10分鐘，棄上清，用生理鹽水溶解沉淀，同步加入2/3體積的40％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，于4℃，13000rpm離心10分鐘，棄上清，用生理鹽水溶解沉淀，同步加入1/2體積的33％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，將沉淀直接冷凍干燥即得抗體。
④、通過上述步驟采用單一抗原進行免疫后所得到的抗體作為單一抗體；或通過上述步驟采用復合抗原進行免疫后所得到的抗體作為復合抗體；或將所述單一抗體和復合抗體中的任意兩種或兩種以上抗體混合所得到的抗體作為組合抗體。
一種所述抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的液體制劑，它包含所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體。
本發明的有益效果是本發明利用基因工程的方法構建含有SARS冠狀病毒S蛋白或M蛋白或E蛋白的表達質粒，在大腸桿菌宿主中進行表達，然后分離并純化表達產物作為抗原，或特選代表SARS冠狀病毒的S蛋白或M蛋白或E蛋白的抗原表位，利用多肽合成儀合成S、M或E的多肽，偶聯后作為抗原，免疫健康產蛋的母雞，提取卵黃中的活性成分——抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體(抗SARS冠狀病毒IgY)，該抗體是一種天然的免疫球蛋白，可以有效地抑制和清除SARS冠狀病毒。采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度，經過體外抑菌實驗檢測，單一抗體濃度在0.5～20mg/ml時可以明顯抑制SARS冠狀病毒對人體的侵入。它具有使用方便、高效、無毒副作用，可對人體進行消毒的特點，可用于預防SARS冠狀病毒引起的嚴重急性呼吸綜合癥；本發明中抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法簡單、快速，提取效率高、成本低、產量高，易于產業化；本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的液體制劑，可有效地預防SARS冠狀病毒引起的嚴重急性呼吸綜合征。
以下通過實驗例說明本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的有益效果實驗例所述抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體病毒中和實驗抗SARS冠狀病毒卵黃抗體(Anti-SARS IgY)(5μg～250μg/ml)與SARS冠狀病毒在無菌條件下1∶1混合，37℃培養3小時后，取200ul上清加入Vero-E6細胞中培養，發現其濃度在100μg～1000μg/ml可以有效抑制SARS冠狀病毒對Vero-E6細胞的感染。
圖1是抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體非變性聚丙烯凝膠電泳圖譜；圖2是抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體變性聚丙烯凝膠電泳圖譜；圖3是本發明抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法主要工藝流程圖。
具體實施例方式
圖1為抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體非變性聚丙烯凝膠電泳圖譜；圖2為抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體變性聚丙烯凝膠電泳圖譜；
圖3為本發明抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法主要工藝流程圖。
實施例1本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，它按照非變性聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶(如圖1)；或按照變形聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，WesternBlotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶(如圖2)；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法是采用以下步驟完成的(1)、基因重組法制備復合抗原利用基因工程的方法，構建含有SARS冠狀病毒S蛋白、M蛋白和E蛋白的表達質粒，在大腸桿菌宿主中分別進行表達，然后分離并純化表達產物進行組合即得所述的復合蛋白抗原。
(2)、制備抗體①、佐劑的選用初次免疫選用弗氏完全佐劑(Freund′s Adjuvant complete)與所述復合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑(Freund′s Adjuvant incomplete)與所述復合抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。
②、對產卵母雞的免疫及取卵
選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。
③、用水稀釋法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，以去離子純水稀釋，適當調節PH值，4℃攪拌4小時，離心后棄去沉淀，將上清濃縮、冷凍干燥，即得復合抗體。
實施例2本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，它按照非變性聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶(如圖1)；或按照變形聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，WesternBlotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶(如圖2)；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法是按以下步驟完成(1)、多肽合成法制備復合抗原利用多肽合成儀合成代表SARS冠狀病毒S蛋白、M蛋白、E蛋白的以下各抗原表位的多肽，所述S蛋白的抗原表位分別為PepS1(dvqapnytqhtssmrg)PepS2(stgnynykyrylrhgklrp)
PepS3(psskrfqpfqqfg)PepS4(vrdpktseildispc)PepS5(aaeqdrntrevfa)PepS6(lpdplkptkrsfi)PepS7(psqernfttapaic)PepS8(peldsfkeeldk)PepS9(qelgkyeqyikwp)PepS10(snfrvvpsgdvvrfp)PepS11(ctdvstaihadqltpa)PepS12(keeldkyfk nhtspdvd)所述M蛋白的抗原表位分別為PepM1(madngtitveelkq)PepM2(ysn rnrflyiik)PepM3(artrsmwsfnpetn)PepM4(aviirghlrmaghslgrc)PepM5(gasqrvgtdsgf)PepM6(nyklntdhagsndniallvq)所述E蛋白的抗原表位分別為PepE1(mysfvseetgt)PepE2(vkptvyvysrv)PepE3(knlnssegvpdllv)取上述21種多肽中的二種或二種以上進行組合即得所述的復合抗原。
(2)、制備抗體①、佐劑的選用初次免疫選用弗氏完全佐劑(Freund′s Adjuvant complete)與所述復合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑(Freund′s Adjuvant incomplete)與所述復合抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。
②、對產卵母雞的免疫及取卵選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。
③、用PEG沉淀法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，加入3倍蛋黃體積的4％的PEG進行稀釋，充分攪拌混勻后4℃，1300rpm離心10分鐘，取上清，然后向上清內逐滴滴加1/6上清體積40％的PEG后充分攪拌混勻后4℃，1300rpm離心10分鐘，收集沉淀，冷凍干燥，即得復合抗體。
實施例3本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，它按照非變性聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶(如圖1)；或按照變形聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，WesternBlotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶(如圖2)；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法是按以下步驟完成(1)、抗原偶聯法制備復合抗原其步驟是，d、取1mg KLH(KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN，鑰孔嘁血藍素)或BSA(BOVINE SERUM ALBUMIN，牛血清白蛋白)于1.5ml離心管中，用100μl的PH10.0硼酸緩沖液充分溶解，10000rpm離心1分鐘，將上清轉移到干凈的離心管；e、稱上述實施例2制得的22個抗原表位之一的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸緩沖液溶解；f、將步驟a制得的KLH(KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN，鑰孔嘁血藍素)或BSA(BOVINE SERUM ALBUMIN，牛血清白蛋白)溶液逐滴加到多肽溶液中；g、邊震蕩邊緩慢加入新鮮配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室溫作用2小時，中間倒轉試管數次；h、加入1M甘氨酸25μl，反應30min；i、以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜，換液一次，繼續透析不少于4小時。
按上述步驟對實施例2制得的22個抗原表位的多肽偶聯，取偶聯后的抗原進行組合即得所述的復合抗原。
(2)、制備抗體①、佐劑的選用
初次免疫選用弗氏完全佐劑(Freund′s Adjuvant complete)與所述復合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑(Freund′s Adjuvant incomplete)與所述復合抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。
②、對產卵母雞的免疫及取卵選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。
③、用PEG沉淀法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，加入3倍蛋黃體積的4％的PEG進行稀釋，充分攪拌混勻后4℃，1300rpm離心10分鐘，取上清，然后向上清內逐滴滴加1/6上清體積40％的PEG后充分攪拌混勻后4℃，1300rpm離心10分鐘，收集沉淀，冷凍干燥，即得復合抗體。
實施例4本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，它按照非變性聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶(如圖1)；或按照變形聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，WesternBlotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶(如圖2)；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法是按以下步驟完成(1)、野生型毒株全病毒滅活法制備抗原a、SARS冠狀病毒的培養取新鮮的SARS冠狀病毒懸液，接種于Vero E6細胞，在33～35℃的CO2培養箱內培養，每天對細胞病變效應進行觀察并記錄，培養5～9天后，收集病變細胞的上清液。
b、SARS冠狀病病毒的滅活向步驟a所得到的病毒上清液中，加入甲醛溶液使其終濃度為0.1～3％，37℃作用24～96小時，使SARS冠狀病毒完全滅活。
c、SARS冠狀病毒的濃縮將經過步驟b滅活的病毒懸液超濾后得到濃縮的滅活SARS冠狀病毒。
按照上述步驟所得到的滅活的SARS冠狀病毒作為單一抗原。
(2)、制備抗體①、佐劑的選用初次免疫選用弗氏完全佐劑(Freund′s Adjuvant complete)與所述單一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑(Freund′s Adjuvant incomplete)與所述單一抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。
②、對產卵母雞的免疫及取卵選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。
③、膜過濾法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，以去離子水稀釋，4℃靜置12小時后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD～200KD的蛋白物質，冷凍干燥即得單一抗體。
實施例5本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，它按照非變性聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶(如圖1)；或按照變形聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，WesternBlotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶(如圖2)；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法是按以下步驟完成(1)、基因重組法制備單一抗原利用基因工程的方法，構建含有SARS冠狀病毒M蛋白的表達質粒，在大腸桿菌宿主中分別進行表達，然后分離并純化表達產物分別作為單一抗原；(2)、制備抗體①、佐劑的選用初次免疫選用弗氏完全佐劑(Freund′s Adjuvant complete)與所述單一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑(Freund′s Adjuvant incomplete)與所述單一抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。
②、對產卵母雞的免疫及取卵選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。
③、膜過濾法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，以去離子水稀釋，4℃靜置12小時后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD～200KD的蛋白物質，冷凍干燥即得單一抗體。
實施例6本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，它按照非變性聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶(如圖1)；或按照變形聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，WesternBlotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶(如圖2)；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法是按以下步驟完成(1)、多肽合成法制備單一抗原利用多肽合成儀合成SARS冠狀病毒的S蛋白的抗原表位為PepS1(dvqapnytqhtssmrg)的多肽作為單一抗原。
(2)、制備抗體
①、佐劑的選用初次免疫選用弗氏完全佐劑(Freund′s Adjuvant complete)與所述單一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑(Freund′s Adjuvant incomplete)與所述單一抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。
②、對產卵母雞的免疫及取卵選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。
③、硫酸銨沉淀法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，提取3次以等體積的生理鹽水稀釋收集到的蛋黃并混合均勻后，緩慢滴加2倍體積的50％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，于4℃，13000rpm離心10分鐘，棄上清，用生理鹽水溶解沉淀，同步加入2/3體積的40％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，于4℃，13000rpm離心10分鐘，棄上清，用生理鹽水溶解沉淀，同步加入1/2體積的33％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，將沉淀直接冷凍干燥即得單一抗體。
實施例7本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，它按照非變性聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶(如圖1)；或按照變形聚丙烯凝膠電泳(分離膠濃度為6.0％)進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，WesternBlotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶(如圖2)；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法是按以下步驟完成(1)、制備單一抗原先利用多肽合成儀合成SARS冠狀病毒的M蛋白的抗原表位為PepM2(ysnrnrflyiik)的多肽，再按以下步驟進行多肽偶聯，a、取1mg KLH(KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN，鑰孔嘁血藍素)或BSA(BOVINE SERUM ALBUMIN，牛血清白蛋白)于1.5ml離心管中，用100μl的PH10.0硼酸緩沖液充分溶解，10000rpm離心1分鐘，將上清轉移到干凈的離心管；b、稱上述抗原表位為PepM2(ysnrnrflyiik)的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸緩沖液溶解；c、將步驟a制得的KLH(KEYHOLE LIMPETHEMOCYANIN，鑰孔嘁血藍素)或BSA(BOVINE SERUMALBUMIN，牛血清白蛋白)溶液逐滴加到多肽溶液中；d、邊震蕩邊緩慢加入新鮮配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室溫作用2小時，中間倒轉試管數次；e、加入1M甘氨酸25μl，反應30min；f、以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜，換液一次，繼續透析不少于4小時。
按上述步驟進行多肽偶聯后的溶液作為單一抗原。
(2)、制備抗體①、佐劑的選用初次免疫選用弗氏完全佐劑(Freund′s Adjuvant complete)與所述單一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑(Freund′s Adjuvant incomplete)與所述單一抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。
②、對產卵母雞的免疫及取卵選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。
③、硫酸銨沉淀法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，提取3次以等體積的生理鹽水稀釋收集到的蛋黃并混合均勻后，緩慢滴加2倍體積的50％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，于4℃，13000rpm離心10分鐘，棄上清，用生理鹽水溶解沉淀，同步加入2/3體積的40％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，于4℃，13000rpm離心10分鐘，棄上清，用生理鹽水溶解沉淀，同步加入1/2體積的33％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，將沉淀直接冷凍干燥即得單一抗體。
實施例8取通過實施例1所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法制得的復合抗體與通過實施例4所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法制得的單一抗體混合得到組合抗體。
實施例9取通過實施例1和實施例2所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法制得的兩種復合抗體與通過實施例4和實施例6所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法制得的兩種單一抗體混合得到組合抗體。
實施例10取通過實施例5和實施例6所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法制得的兩種單一抗體混合得到組合抗體。
實施例11取通過實施例8所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法制得的組合抗體400mg與磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)4.45g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)3.40g、山梨酸鉀2g、氯化鈉4.22g和蒸餾水98.643g混合制得抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的液體制劑1000g，它可以作為噴霧劑用于預防SARS冠狀病毒引起的嚴重急性呼吸綜合征。
實驗例1取通過實施例7所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法制得的組合抗體按照如下步驟進行酶聯免疫吸附實驗檢驗抗體的活性1、抗原包埋將ELISA板的A1、A2孔為空白對照。利用SARS滅活病毒作為抗原，并用包被液稀釋抗原，使其濃度為10ug/ml。將稀釋后的抗原加入酶標板，每孔200ul，放于4℃過夜。
2、封閉及抗原抗體的反應①、取出酶標板倒去包被液，然后在干凈紙巾上拍干酶標板。
②、以300ul的PBST加入酶標板各孔中，室溫放置3分鐘后，倒去PBST，將酶標板倒置于紙巾拍干，重復此步驟兩次。
③、向每孔加入200ul PBST-BSA封閉，室溫放置1.5小時。
④、倒掉封閉液，在干凈紙巾上拍干酶標板。
⑤、以300ul的PBST加入酶標板各孔中，室溫放置3分鐘后，倒去PBST，將酶標板倒置于紙巾拍干，重復此步驟兩次。
⑥、依次吸取稀釋后的一抗(PBST稀釋1000倍)加入相應孔中，每孔200ul，室溫放置1.5小時。
⑦、棄去一抗稀釋液，在干凈紙巾上拍干酶標板。
⑧、以300ul的PBST加入酶標板各孔中，室溫放置3分鐘后，倒去PBST，將酶標板倒置于紙巾拍干，重復此步驟兩次。
⑨、吸取稀釋后的二抗(PBST稀釋20000倍)加入相應孔中每孔200ul，室溫放置1.5小時。
⑩、棄去二抗稀釋液，在干凈紙巾上拍干酶標板。以300ul的PBST加入酶標板各孔中，室溫放置3分鐘后，倒去PBST，將酶標板倒置于紙巾拍干，重復此步驟三次。
3、顯色①、以0.4mg/ml的濃度，用低物緩沖液溶解鄰苯二胺，并按0.1ul/ml的比例加入30％的H2O2。
②、依次向每孔中加入200ul底物溶液，同時開始計時3～5分鐘。
③、向每孔加入50ul的4M硫酸終止反應。
④、室溫放置5分鐘后，打開酶標儀及打印機，設定酶標儀的程序測492nm處的O.D.值，并將結果打印出來。
4、實驗結果
5、結論該抗體的綜合效價為8×106/g。
實驗例2取通過實施例4所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法制得的抗體按照如下步驟進行中和實驗，用以檢驗所得到的卵黃抗體體外拮抗SARS冠狀病毒生物活性的效果1、將實施例4所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體作系列倍比稀釋，使之成為1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000。
2、將培養好的SARS冠狀病毒按照每106的Vero E6細胞的1/2接種量中含100TCID50進行稀釋3、試驗組將不同稀釋度抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體與等量SARS冠狀病毒(病毒滴度為100TCID50)相加；對照組用無菌的Hanks液替代抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體與等量SARS冠狀病毒相加；混勻后放入37℃作用1小時，分別接種至含有106的Vero E6細胞中，37℃培養箱中培養，逐日在普通顯微鏡下觀察細胞病變情況。
結果實施例4所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體能保護50％VeroE6細胞不發生病變的抗體稀釋度，在1∶100與1∶1000之間。對照組則無明顯的保護效果。
結論實施例4所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體能夠有效的抑制SARS冠狀病毒對Vero E6細胞的侵襲。
權利要求
1.一種抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，其特征在于它按照非變性聚丙烯凝膠電泳進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現單一條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約170～190KD處發現一條單一的特異性酶染條帶；或按照變性聚丙烯凝膠電泳進行檢測，經過考馬斯亮藍R250染色后，圖譜呈現兩條條帶，Western Blotting檢測可以在分子量約65KD和25KD處發現兩條特異性酶染條帶；采用紫外分光光度法測定蛋白質濃度為0.5～20mg/ml；經過酶聯免疫吸附實驗測定其效價為1∶50-1∶100000。
2.一種生產權利要求1所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟(1)、制備單一抗原或復合抗原①、基因重組法利用基因工程的方法，構建含有SARS冠狀病毒的S蛋白、M蛋白、E蛋白的表達質粒，在大腸桿菌宿主中進行表達，然后分離并純化表達產物作為單一抗原；取上述分離純化后的表達產物二種或二種以上進行組合可得所述的復合抗原。②、多肽合成法利用多肽合成儀合成SARS冠狀病毒S蛋白或M蛋白或E蛋白的以下任一抗原表位的多肽作為單一抗原，所述S蛋白的抗原表位分別為PepS1(dvqapnytqhtssmrg)PepS2(stgnynykyrylrhgklrp)PepS3(psskrfqpfqqfg)PepS4(vrdpktseildispc)PepS5(aaeqdmtrevfa)PepS6(lpdplkptkrsfi)PepS7(psqemfttapaic)PepS8(peldsfkeeldk)PepS9(qelgkyeqyikwp)PepS10(snfrvvpsgdvvrfp)PepS11(ctdvstaihadqltpa)PepS12(keeldkyfk nhtspdvd)所述M蛋白的抗原表位分別為PepM1(madngtitveelkq)PepM2(ysnmrflyiik)PepM3(artrsmwsfnpetn)PepM4(aviirghlrmaghslgrc)PepM5(gasqrvgtdsgf)PepM6(nyklntdhagsndniallvq)所述E蛋白的抗原表位分別為PepE1(mysfvseetgt)PepE2(vkptvyvysrv)PepE3(knlnssegvpdllv)任取上述21種單一抗原中的二種或二種以上進行組合可得所述的復合抗原。③、抗原偶聯法其步驟是，a、取1mg KLH或BSA于1.5ml離心管中，用100μl的PH10.0硼酸緩沖液充分溶解，10000rpm離心1分鐘，將上清轉移到干凈的離心管；b、稱上述方法②制得的22個抗原表位之一的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸緩沖液溶解；c、將步驟a制得的KLH或BSA溶液逐滴加到多肽溶液中；d、邊震蕩邊緩慢加入新鮮配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室溫作用2小時，中間倒轉試管數次；e、加入1M甘氨酸25μl，反應30min；f、以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜，換液一次，繼續透析不少于4小時。按上述步驟對方法②制得的21個抗原表位的多肽偶聯后的抗原作為單一抗原，任取上述二種或二種以上單一抗原進行組合可得所述的復合抗原。④、野生型毒株全病毒滅活法a、SARS冠狀病毒的培養取新鮮的SARS冠狀病毒懸液，接種于Vero E6細胞，在33～35℃的CO2培養箱內培養5～9天后，收集病變細胞的上清液。b、SARS冠狀病病毒的滅活向步驟a所得到的病毒上清液中，加入甲醛溶液使其終濃度為0.1～3％，37℃作用24～96小時，使SARS冠狀病毒完全滅活。c、SARS冠狀病毒的濃縮將經過步驟b滅活的病毒懸液超濾后得到濃縮的滅活SARS冠狀病毒。按照上述步驟所制得的滅活的SARS冠狀病毒作為單一抗原。(2)、制備抗體①、佐劑的選用初次免疫選用弗氏完全佐劑與所述單一抗原或復合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作為免疫抗原；所有的加強免疫均選用弗氏不完全佐劑與所述單一抗原或復合抗原重量比為1∶1混合乳化后作為免疫抗原。②、對產卵母雞的免疫及取卵選用健康的白種來行母雞隔離飼養并進行雞肌肉多點注射所述免疫抗原，此為初次免疫，隔2周后開始加強免疫，以后每隔一周加強免疫一次，共免疫三次。從初次免疫后算起，第三十天開始收集雞卵，4℃儲存備用。③、卵黃抗體的提取卵黃抗體的提取可采用以下四種方法之一a、用水稀釋法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，以去離子純水稀釋，適當調節PH值，4℃攪拌4小時，離心后棄去沉淀，將上清濃縮、冷凍干燥，即得抗體。b、采用PEG沉淀法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，加入3倍蛋黃體積的4％的PEG進行稀釋，充分攪拌混勻后4℃，1300rpm離心10分鐘，取上清，然后向上清內逐滴滴加1/6上清體積40％的PEG后充分攪拌混勻后4℃，1300rpm離心10分鐘，收集沉淀，冷凍干燥，即得抗體。c、膜過濾法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，以去離子水稀釋，4℃靜置12小時后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD～200KD的蛋白物質，冷凍干燥即得抗體。d、硫酸銨沉淀法提取卵黃抗體從收集的免疫的雞卵中分離得到蛋黃，提取3次以等體積的生理鹽水稀釋收集到的蛋黃并混合均勻后，緩慢滴加2倍體積的50％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，于4℃，13000rpm離心10分鐘，棄上清，用生理鹽水溶解沉淀，同步加入2/3體積的40％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，于4℃，13000rpm離心10分鐘，棄上清，用生理鹽水溶解沉淀，同步加入1/2體積的33％飽和硫酸銨，于4℃作用3小時，將沉淀直接冷凍干燥即得抗體。④、將通過上述步驟采用單一抗原進行免疫后所得到的抗體作為單一抗體；或通過上述步驟采用復合抗原進行免疫后所得到的抗體作為復合抗體；或將所述單一抗體和復合抗體中的任意兩種或兩種以上抗體混合所得到的抗體作為組合抗體。
3.一種實現權利要求1所述抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體的液體制劑，其特征在于，它包含所述的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體。
全文摘要
本發明公開了一種抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體及其制備方法和液體制劑。本發明主要以健康產卵的母雞為免疫動物，利用基因工程的方法重組基因蛋白S、M或E作為抗原；或特選代表SARS冠狀病毒的S蛋白或M蛋白或E蛋白的抗原表位，利用多肽合成儀合成S、M或E的多肽作為抗原，或偶聯后作為抗原；或野生型毒株全病毒滅活后作為抗原，通過初次免疫、加強免疫、收集雞卵并從卵黃中提取抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體，該抗體還可制成液體制劑。本發明的抗SARS冠狀病毒的卵黃抗體及其液體制劑可用于預防因SARS冠狀病毒引起的嚴重急性呼吸綜合征。
文檔編號C07K16/08GK1556113SQ200410015020
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月7日 優先權日2004年1月7日
發明者葉志海, 丁波, 王文, 夏魯全 申請人:珠海百奧生物技術有限公司