專利名稱：地烏提取物單體在制備中藥制劑原料藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及地烏提取物中的4個單體成分在制備中藥制劑原料藥中的應用。
背景技術：
地烏系毛茛科銀蓮花屬植物林蔭銀蓮花(Anemone flaccida Fr.Schmidt)的干燥根莖，在《貴州民間藥物》、《浙江天目山藥植志》等書中均有記載，其性溫，味辛微苦，具有祛風濕、強筋骨、消腫止痛之功效，善治風濕疼痛、跌打損傷。(中藥大辭典，上海上海科學技術出版社，2002802)本所(湖北中醫學院中藥研究所)由地烏中得到地烏提取物，制成地烏風濕安膠囊，用于治療類風濕性關節炎(RA)，于2004年9月2日獲國家5類中藥新藥的臨床研究批件，現處于臨床實驗階段。已申報的相關專利有“地烏提取物的主要成分、制備方法及應用”(申請號200510019169.2)，“一種地烏總皂苷的制備方法”(申請號200510075306.4)，“一種地烏總皂苷提取物”(申請號200610033184.7)，“一種地烏提取物及其用途”(申請號200610033185.1)。
本所由地烏提取物中進一步分離純化得到了5個主要單體成分，暫定名W0a、W0b、W1、W2、W3。其中W3擬作為風濕安中藥制劑的原料藥，應用于風濕類疾病的治療；已獲證書的專利有“風濕安中藥制劑及制備和應用”(專利號ZL200510018364.3)和“從林蔭銀蓮花提取的地烏皂苷W3標準品及制備工藝”(專利號ZL200510018363.9)。其它4個單體W0a、W0b、W1和W2的來源、化學名稱、結構、分子式、圖譜鑒定等在申報的專利“地烏提取物的主要成分、制備方法及應用”中已予以說明。
發明內容
本發明的目的在于提供地烏提取物中的4個單體成分W0a、W0b、W1和W2(統稱為地烏提取物單體)在制備中藥制劑原料藥中的新應用。
本發明涉及地烏提取物單體作為制備治療或預防系統性紅斑狼瘡、多肌炎/皮肌炎、系統硬化癥的中藥制劑原料藥中的應用。
本發明涉及地烏提取物單體作為制備治療或預防骨性關節炎、強直性脊柱炎、骨質疏松癥的中藥制劑原料藥中的應用。
本發明涉及地烏提取物單體作為制備治療或預防雷諾病的中藥制劑原料藥中的應用。
本發明涉及地烏提取物單體作為制備治療預防銀屑病的中藥制劑原料藥中的應用。
本發明涉及地烏提取物單體作為制備治療中醫病癥中的風濕寒性關節痛、風濕性關節炎、增生性關節炎、肩關節周圍炎的中藥制劑原料藥中的應用。
本發明的中藥制劑應用于治療上述自身免疫性疾病。本中藥制劑在治療上述自身免疫病時，是通過針對機體特定的免疫調節狀態來調節免疫，避免非特異性免疫抑制及藥物的毒性作用，具有療效顯著、毒副作用小的優點。
本發明的有益效果是，對已知地烏提取物單體發掘出新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。
圖1是W0a，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；圖2是W0b，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；圖3是W1，3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-齊墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；圖4是W2，3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖-齊墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
具體實施例方式
實施例一地烏提取物單體的制備取地烏提取物，用甲醇溶解，加入2倍質量的硅膠G混勻，水浴揮去溶劑，得到樣品；按樣品∶硅膠G＝1∶30的重量比例上硅膠干柱，通過氯仿∶甲醇∶水＝20∶10∶1(體積)系統洗脫，粗分成I、II、III、IV、V5段；經薄層檢查，取II段以甲醇洗脫，洗脫液濃縮至干，得濃縮物；將濃縮物與2倍質量的硅膠G混勻，水浴揮去溶劑，按樣品∶硅膠G＝1∶30的重量比例上硅膠干柱，以氯仿∶甲醇∶水＝7∶4∶1(體積)系統洗脫，將其分成II-1、II-2、II-3、II-4、II-5、II-6六段。
收集II-2段，以甲醇洗脫，洗脫液濃縮至干，濃縮物以40％～80％甲醇溶解，以Rp-18柱進行制備分離，以甲醇-水系統洗脫，經紫外檢測分離得W0a和W0b；收集II-3段，同前述II-2段方法處理，經紫外檢測分離得W1；收集II-4段，同前述II-2段方法處理，制備分離以乙腈-水系統洗脫，經紫外檢測分離得W2。
本發明中除另有說明之外乙醇百分濃度均是指容量百分濃度，化合物百分含量是指質量百分含量。
實施例二中藥制劑的制備上述4個單體成分W0a、W0b、W1、W2，純度≥90wt％，作為原料藥制成中藥制劑，劑型包括粉劑、丸劑、滴劑、片劑等。口服，用于治療自身免疫病。
實施例三地烏提取物單體對系統性紅斑狼瘡(SLE)樣小鼠作用的實驗研究1方法1.1SLE樣癥狀小鼠模型的制備密度梯度離心法無菌分離BALB/c小鼠胸腺和脾臟淋巴細胞，60C0照射(劑量6Gy)，誘導85％左右細胞發生凋亡(丫啶橙染色法觀察凋亡率)。照射后淋巴細胞繼續在37℃、5％CO2環境下孵育4h。將獲得的凋亡細胞成分分別于0、7、14天皮下途徑免疫小鼠，每只小鼠107個淋巴細胞。第一次免疫用完全弗氏佐劑(CFA)，第二次、第三次重復免疫采用不完全弗氏佐劑(IFA)[1，2]。
1.2動物分組與給藥以同齡同性別未經照射未輸入淋巴細胞懸液的F1代雜交小鼠作為正常對照。將F1代小鼠隨機分為6組，①正常對照組；②W0a組208mg/kg；③W0b組208mg/kg；④W1組208mg/kg；⑤W2組208mg/kg；⑥模型對照組。灌胃給藥，每日1次。正常對照組和模型對照組給予等體積生理鹽水。
1.3標本收集(1)血清制備采用毛細吸管經后眼眶靜脈叢取血約0.2ml/次，第1次于輸注前。輸注后每2周1次，共7次。離心分離血清，保存于-30℃低溫冰箱，統一測定。(2)尿液收集取尿前小鼠禁食12h，只給飲水，然后收集尿液約0.5ml，當即檢測。第1次于輸注前。輸注后每2周1次，共7次。(3)組織檢查輸注后至第14周結束時，放血處死小鼠，取出脾臟和腎臟做脾指數測定和腎臟組織學檢測。
1.4標本檢測1.4.1參照文獻方法[1]，使用ELISA法檢測抗dsDNA抗體及抗組蛋白抗體。
1.4.2尿蛋白測定用尿蛋白試紙比色法測定新鮮尿液的蛋白質含量，分-(＜1mg％)、±(1mg％～10mg％)、+(10mg％～30mg％)、++(30mg％～100mg％)、+++(100mg％～300mg％)、++++(＞300mg％)共6個等級。
1.4.3脾指數測定小鼠處死前稱其重量(g)。放血處死小鼠取出脾臟，以濾紙吸干表面血污，測其重量(mg)。脾指數＝脾重(mg)數×10/體重(g)數。
1.4.4病理檢測常規HE染色取出腎組織后，以10％的中性福爾馬林溶液固定，按常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、做HE染色、固封、鏡檢。免疫熒光檢查取新鮮小鼠腎組織，冰凍切片，厚約3μm，室溫干燥1h，純丙酮固定20min，用0.01M PH7.2的PBS洗滌3次，略干燥，滴加1∶40稀釋的免抗小鼠IgG-FITC于切片上，37℃孵育1h，沖洗，風干，于萬能顯微鏡下觀察IgG沉積及分布情況。
1.4.5統計學處理自身抗體水平以均數±標準差(X±S)表示，多組間用單因素方差分析，以P＜0.05作為差異顯著的標準。尿蛋白水平依-、±、+、++、+++、++++分別記為0、5、10、20、30、40分，多組間差異統計用Ridit分析。
2結果2.1自身抗體(抗dsDNA抗體、抗組蛋白抗體)的變化模型組與正常組相比較，抗dsDNA抗體，誘導后第4周末至第14周末明顯高于正常組，差異顯著(P＜0.05)，且于第10周末達到峰值(P＜0.01)；抗組蛋白抗體，誘導后第2周末至第14周末模型組高于正常組，差異顯著(P＜0.05)，且于第8周末達到峰值(P＜0.01)。模型組與各用藥組相比較，誘導后第6周末至第14周末，各用藥組的自身抗體水平較模型組低，差異顯著(P＜0.05)。各用藥組14周自身抗體平均水平無顯著性差異(P＞0.05)。見表1、表2。
表1藥物對誘導后第8周末抗組蛋白抗體變化的影響(X±S)
注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表2藥物對自身抗體平均水平的影響(X±S)
注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2尿蛋白水平變化誘導后第6周末模型組較正常組和各用藥組高(P＜0.05)，持續到第14周末，于第14周末達到峰值(P＜0.01)。各用藥組之間無顯著性差異(P＞0.05)，見表3。脾指數見表4。
表3藥物對尿蛋白總體變化的影響(X±S)
表4藥物對脾指數變化的影響(X±S)
注與模型組比較，**P＜0.01。
2.3組織學檢查模型組可見部分腎小球萎縮或增生，大小不均勻，間質細胞增生，毛細血管壁有增厚的跡象，間質血管充血及少量淋巴細胞浸潤。正常組未見明顯改變。用藥各組腎小球輕度增生，數量較少，間有萎縮。免疫熒光檢查可見，IgG熒光抗體沉積于腎小球基底膜及間質毛細血管內皮區域，呈顆粒狀。各用藥組僅見部分腎小球有大量熒光抗體沉積，強度較弱，正常組未發現陽性結果。
3參考文獻[1]林晨.同種異體淋巴細胞誘導的SLE樣小鼠模型[J].上海免疫學雜志，1980，9(2)73-76. 高春芳.青蒿琥酯對系統性紅斑狼瘡樣小鼠模型的影響[J].中華皮膚科雜志，1995，28(1)17-19.
實施例四地烏提取物單體治療骨質疏松癥的實驗研究1方法取體重230g-270g的雌性大鼠60只，乙醚麻醉下手術，其中50只行雙側卵巢摘除術，剩余10只為正常對照組，做單純腹腔開關手術。術后室溫下分籠飼養。術后2周，將摘除卵巢的大鼠隨機分為5組，分別為模型組、W0a組、W0b組、W1組、W2組，各用藥組劑量為144mg/kg，正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水。灌胃給藥，每天1次，連續120天。末次給藥后24h將動物處死，取股骨分別測定骨密度(BMD)、骨重、骨長、骨直徑、骨強度和骨鈣含量，并做病理組織學檢查。
2結果W0a、W0b、W1及W2各組均可增加骨質疏松大鼠骨的重量、長度、強度及骨鈣的含量。因此W0a、W0b、W1、W2對去勢大鼠骨質疏松均有治療作用。結果見表5。
表5藥物對去勢大鼠BMD、骨重、骨長、骨強度和骨鈣含量的影響(X±S)
注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
實施例五地烏提取物單體對兔骨性關節炎影響的實驗研究1方法1.1兔骨性關節炎模型的制備[1]選用日本大耳白兔36只，體重2.0-2.5kg，雌雄各半，隨機分成6組，正常對照組、模型組、W0a組、W0b組、W1組、W2組。除正常對照組外，其余各組每兔用石膏繃帶制動左側膝關節。制動兩周后，按10mL/kg體重開始灌胃給藥，各用藥組劑量為75mg/kg，正常對照組和模型組給予等體積的蒸餾水，每日給藥1次，連續6周。末次給藥后12h，將各組動物解除制動進行各項指標的測定。
1.2動物膝關節活動范圍的測定[1]將兔膝關節伸展，再回縮膝關節，用量角器測量伸展至回縮的角度，即為膝關節活動范圍。
1.3血液Ca、P檢測及Ca/P比值的計算動物心臟采血，全自動生化分析儀檢測。
1.4關節滑膜厚度的測定切取完整的膝關節，立即打開膝關節腔，用螺旋測微器測定關節滑膜厚度。
1.5關節滑膜中蛋白含量及SOD活力的測定[2]用銳利刀片切取膝前正中部的滑膜組織200mg，用冰凍的生理鹽水沖洗血液，濾紙拭干，放入2mL冰生理鹽水中。將滑膜組織塊取出剪碎，倒入玻璃勻漿管中冰生理鹽水下勻漿，制成10％的組織勻漿，以3000r/min離心10min，取上清液。按照考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒及SOD測定試劑盒的說明書依次進行檢測。
1.6滑膜液炎性細胞計數取膝關節滑膜液涂片計數炎性細胞，光鏡下觀察記錄。每張涂片隨機觀察5個視野(10×40倍)，計算每一視野平均炎性細胞數。計數標準-細胞數為0個/視野(HP)；+細胞數＜10個/HP；++細胞10～20個/HP；+++細胞數＞20個/HP。
1.7病理組織學觀察記錄[3]膝關節標本用10％福爾馬林(包含1％的醋酸與7％的EDTA)脫鈣、石蠟包埋后切片(切片部位脛骨平臺取前外象限的1/2交界處，股骨髁標本取外象限中央點處；沿股骨內、外髁最底位的冠狀面常規制片)，蘇木素和伊紅染色觀察形態學。膝關節分級標準為0級示滑膜完整，細胞排列整齊，無充血水腫，無炎性細胞浸潤；關節軟骨完整，無剝離，無壞死；潮線清晰可見。I級示滑膜血管充血水腫，表層細胞增生；骨膜增生，骨質疏松；潮線間斷。II級示滑膜細胞顯著增生，滑骨質疏松；潮線間斷。III級示滑膜細胞顯著增生，滑膜內血管增生，肉芽組織形成；關節軟骨糜爛；潮線消失。IV級示滑膜內肉芽組織纖維化；關節軟骨有灶性壞死。
2結果2.1W0a、W0b、W1、W2對兔膝關節活動范圍的影響各用藥組對模型兔膝關節活動范圍有明顯的改善作用，與模型組比較有明顯的改善作用；關節滑膜厚，各組與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)；Ca/P比值也明顯升高(P＜0.01)。說明W0a、W0b、W1、W2各組對模型兔膝關節滑膜厚度腫脹有顯著抑制作用(P＜0.01)。結果見表6。
表6藥物對兔膝關節活動范圍、關節滑膜厚度和Ca/P比值的影響(X±S，n＝6)
注與模型組比較，**P＜0.01。
2.2W0a、W0b、W1、W2對兔滑膜蛋白含量及SOD活力的影響與模型組比較，W0a、W0b、W1、W2各組能明顯增強滑膜組織SOD的活性(P＜0.01)，具有清除氧自由基增強機體抗氧化的能力。結果見表7。
表7藥物對兔滑膜蛋白含量及SOD活力的影響(X±S，n＝6)
注與模型組比較，**P＜0.01。
2.3W0a、W0b、W1、W2對兔膝關節滑膜液炎性細胞計數的影響模型組細胞計數以++、+++為主，給藥組以+、++為主，與模型組比較，W0a、W0b、W1、W2各組能明顯減少滑膜液炎性細胞數，療效顯著。結果見表8。
表8藥物對兔膝關節滑膜液炎性細胞計數的影響(X±S，n＝6)
注與模型組比較，*P＜0.05。
2.4W0a、W0b、W1、W2對兔滑膜與關節病理改變的影響模型組病變以II、III級為主，用藥組以I、II級為主。與模型組比較，各用藥組能夠抑制滑膜內血管增生和肉芽組織形成，減輕關節軟骨糜爛或壞死，對制動后膝關節內滑膜及軟骨的病理變化有顯著的改善。見表9。
表9藥物對兔滑膜與關節病理改變的影響(X±S，n＝6)
注與模型組比較，*P＜0.05。
3參考文獻[1]王耶，劉建宇，宋艷，等.丹參和透明質酸鈉注射液對骨性關節炎治療作用的實驗研究[J].中國生化藥物雜志，1998，19(5)248-251. 張吉力，張聞生，鄒季.風濕骨痛藥酒藥槌外治法治療兔膝關節骨關節炎的實驗研究[J].中醫正骨，2001，13(7)9-11. 華英匯，顧湘杰，陳世蓋，等.威靈仙注射液對骨關節炎影響的實驗研究[J].中國運動醫學雜志，2003，22(4)420-422.
實施例六地烏提取物單體治療銀屑病的實驗研究(藥物局部外用對雌激素周期小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響)
1方法取60只小鼠，隨機分為正常組、模型組、W0a組、W0b組、W1組、W2組。實驗開始第1、2、3d正常組腹腔注射生理鹽水0.1mL/只，其他組腹腔注射已烯雌酚0.1mL/只，使小鼠陰道上皮處于雌激素周期。第4、5、6d，各用藥組陰道灌注藥物0.01mL/只，正常組和模型組陰道灌注等體積生理鹽水，1次/d。第7d上午正常組腹腔注射生理鹽水0.01mL/只，其他各組均腹腔注射秋水仙堿0.05mg/只(秋水仙堿能使細胞有絲分裂周期停滯在中期便于進行計算)。1h后，再次給藥。6h后，處死小鼠并切取陰道上皮組織，做常規組織切片，HE染色，在光學顯微鏡下計數，300個小鼠陰道上皮基底細胞中所出現的有絲分裂數，即有絲分裂指數。比較各組小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂指數，進行統計學處理。
2結果模型組小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂明顯高于正常組，兩組比較具有極顯著性異(P＜0.01)，證明造模成功，小鼠屬于雌激素周期的陰道上皮。W0a、W0b、W1、W2各組小鼠陰道上皮細胞有絲分裂明顯少于模型組，與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)。結果見表10。
表10藥物對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂指數的影響(X±S)
從實施例三～實施例六可以看出，由地烏提取物單體制備而成的中藥制劑可用于治療或預防自身免疫性疾病，如上述提到的系統性紅斑狼瘡、多肌炎/皮肌炎、系統硬化癥骨性關節炎、強直性脊柱炎、骨質疏松癥、雷諾病、銀屑病、風濕寒性關節痛、風濕性關節炎、增生性關節炎、肩關節周圍炎。
權利要求
1.地烏提取物單體作為制備治療或預防系統性紅斑狼瘡、多肌炎/皮肌炎、系統硬化癥的中藥制劑原料藥中的應用。
2.地烏提取物單體作為制備治療或預防骨性關節炎、強直性脊柱炎、骨質疏松癥的中藥制劑原料藥中的應用。
3.地烏提取物單體作為制備治療或預防雷諾病的中藥制劑原料藥中的應用。
4.地烏提取物單體作為制備治療或預防銀屑病的中藥制劑原料藥中的應用。
5.地烏提取物單體作為制備治療中醫病癥中的風濕寒性關節痛、風濕性關節炎、增生性關節炎、肩關節周圍炎的中藥制劑原料藥中的應用。
全文摘要
本發明公開了地烏提取物中的4個單體成分W
文檔編號A61K36/71GK101036664SQ20071005195
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月24日 優先權日2007年4月24日
發明者廖一帆, 張國斌, 邴飛虹 申請人:廖一帆