專利名稱：一種抗腫瘤抗生素及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種新的抗腫瘤抗生素及其制備方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類生命和生活質量的世界性疾病，為僅次于心血管疾病的第二大死因。多年來已從微生物代謝產物中發現了為數眾多的抗腫瘤活性物質，大量來源于微生物的抗癌劑在制藥工業日益起著重要作用。放線菌是一類數量大、種類多、具有重要實用價值和開發潛力的微生物資源，是各種生理活性物質的重要產生菌。由放線菌產生的抗腫瘤抗生素，如阿霉素、絲裂霉素、博萊霉素、更生霉素等是目前腫瘤治療中常用的藥物，在腫瘤化學治療中占有重要地位。
我國抗生素的研究主要以跟蹤和仿制為主，自行開發、創制的能力和水平很低，具有自主知識產權的新化合物的報道很少。因此，具有自主知識產權的新化合物的研究，不僅直接為人類疾病的治療提供新品種，而且為新藥的研發提供活性先導化合物。
發明內容
本發明的目的是提供一種不同于已知吡喃萘醌類抗生素結構的新抗腫瘤抗生素，它對腫瘤細胞，特別是對人早幼粒白血病細胞有較強的抑制作用。
本發明的另一個目的是提供一種抗腫瘤抗生素的制備方法。
本發明的主要技術方案通過培養已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京；保藏日期2007年1月29日；保藏登記入冊編號為CGMCC No.1935的一株擬諾卡氏菌株(Nocardiopsis sp.)YIM 80133，再從其發酵液中分離純化提取物，得到一種新的抗腫瘤抗生素。
本發明的抗腫瘤抗生素是分子式為C21H20O10，分子量為432.38的化合物，該化合物具有如下結構
本發明的抗腫瘤抗生素的制備方法，包括以下步驟(1)菌種液體種子培養①液體種子培養基(g/l)的制備取酵母膏2.0～6.0g；葡萄糖2.0～6.0g；麥芽膏3.0～7.0g；復合維生素0.5～2.0ml；加水至1000ml，pH9.0，120℃滅菌30min；②發酵將菌株YIM 80133加到滅菌后的培養基中，28℃下于轉速為190～250轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵2天。
(2)菌種發酵培養①發酵培養基(g/l)的制備取大豆粉10.0～30.0g；甘露醇10.0～30.0g；加水至1000ml，pH9.0，120℃滅菌30min；②發酵將上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133種子液加到滅菌后的培養基中，加菌種量為發酵培養基重量的10％，28℃下于轉速為190～250轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵5～7天。
(3)發酵液處理①發酵液經2500～3500轉/分鐘離心，離心時間為15～25分鐘；②以等體積乙酸乙醋萃取4～6次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油狀物；③進行硅膠柱層析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脫，收集三氯甲烷∶甲醇為50∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種抗腫瘤抗生素；④將粗品一種抗腫瘤抗生素進行凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集活性組分，回收溶劑，得到一種抗腫瘤抗生素較純品；⑤將較純品一種抗腫瘤抗生素經過制備高效液相純化，收集活性峰段，回收溶劑，冷凍干燥，得到一種抗腫瘤抗生素純品。
在種子培養基的制備中最好是酵母膏為4.0g；葡萄糖為4.0g；麥芽膏為5.0g；復合維生素為1.0ml。
在發酵培養基的制備中最好是大豆粉為20.0g；甘露醇為20.0g。
搖瓶發酵時搖床轉數為220轉/分鐘為宜，發酵時間以6天為宜。
發酵液分離時，離心機轉速以3000轉/分鐘為宜，所述的離心時間為20分鐘為宜，所述的乙酸乙醋的萃取次數以5次為宜。
一種抗腫瘤抗生素純品經分析型HPLC檢測，色譜柱(250×4.6mm，5μm，Alltech，C18)；甲醇∶水7∶3等度洗脫，檢測波長254nm，流速1.0ml/min，證實一種抗腫瘤抗生素純品純度高于98％。
本發明抗腫瘤抗生素經常規MTT法實驗證明，它對人腫瘤細胞株有抑制作用，其抗腫瘤活性如表(1)所示。
表(1)本發明抗腫瘤抗生素的體外抗腫瘤活性
圖1為本發明抗生素的化學結構式；圖2為本發明抗生素的紫外吸收光譜；圖3為本發明抗生素的紅外吸收光譜；圖4為本發明抗生素的氫譜(DMSO)；圖5為本發明抗生素的碳譜(13C-NMR、DEPT)；圖6為本發明抗生素的HSQC(異核多量子相關)；圖7為本發明抗生素的HMBC(異核多鍵相關)；圖8為本發明抗生素的H-H COSY譜；圖9為本發明抗生素的NOESY譜；圖10為本發明抗生素的質譜。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明實施例1化合物(I)的制備(1)菌種液體種子培養①液體種子培養基(g/l)的制備取酵母膏4.0g；葡萄糖4.0g；麥芽膏5.0g；復合維生素1.0ml；加水至1000ml，pH9.0，120℃滅菌30min；②發酵將菌株YIM 80133加到滅菌后的培養基中，28℃下于轉速為220轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵2天。
(2)菌種發酵培養①發酵培養基(g/l)的制備取大豆粉20.0g；甘露醇20.0g；加水至1000ml，pH9.0，120℃滅菌30min；②發酵將上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133種子液加到滅菌后的培養基中，加菌種量為發酵培養基重量的10％，28℃下于轉速為220轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵6天。
(3)發酵液處理①發酵液經3000轉/分鐘離心，離心時間為20分鐘；②以等體積乙酸乙醋萃取5次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油狀物；③進行硅膠柱層析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脫，收集三氯甲烷∶甲醇為50∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種抗腫瘤抗生素；④將粗品一種抗腫瘤抗生素進行凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集活性組分，回收溶劑，得到一種抗腫瘤抗生素較純品；⑤將較純品一種抗腫瘤抗生素經過制備高效液相純化，收集活性峰段，回收溶劑，冷凍干燥，得到一種抗腫瘤抗生素純品。
如上所得的本發明化合物，具有下述理化性質1.性狀橙黃色結晶。
2.熔點170±1℃。
3.分子量分子量為432.38。
4.分子式分子式為C21H20O10。
5.元素分析C 58.32％、H 4.66％、O 37.02％。
6.紫外吸收光譜UVλmax256.3(甲醇溶劑)證明分子結構中含有苯環。
7.紅外吸收光譜中的特征官能團(KBr)IR(3129，1786，1730，1653cm-1波數)證明分子結構中有酚羥基，羧羰基，醌羰基。
8.綜合1H譜、13C譜、HSQC(異核多量子相關)、HMBC(異核多鍵相關)、NOESY譜、H-H COSY譜、質譜(ESI-MS)[M+Na]+＝455，[M-H]-＝431分析數據，確定了本發明抗腫瘤抗生素的分子量為432.38，分子式為C21H20O10，其結構如附圖1所示。
實施例2實施例1中制備的化合物(I)對腫瘤細胞的抑制活性測定采用常規MTT法。
實驗證明，化合物(I)對人腫瘤細胞株有抑制作用。
對人早幼粒白血病細胞株HL-60的IC50(ug/ml)為0.23。
對人肺腺癌細胞株AGZY的IC50(ug/ml)為19.58。
以上腫瘤細胞株均由昆明醫學院保存。
實施例3化合物(I)的制備(1)菌種液體種子培養①液體種子培養基(g/l)的制備取酵母膏2.0g；葡萄糖2.0g；麥芽膏3.0g；復合維生素0.5ml；加水至1000ml，pH9.0，120℃滅菌30min；②發酵將菌株YIM 80133加到滅菌后的培養基中，28℃下于轉速為190轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵2天。
(2)菌種發酵培養①發酵培養基(g/l)的制備取大豆粉10.0g；甘露醇10.0g；加水至1000ml，pH9.0，120℃滅菌30min；②發酵將上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133種子液加到滅菌后的培養基中，加菌種量為發酵培養基重量的10％，28℃下于轉速為190轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵5天。
(3)發酵液處理①發酵液經2500轉/分鐘離心，離心時間為15分鐘；②以等體積乙酸乙醋萃取4次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油狀物；③進行硅膠柱層析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脫，收集三氯甲烷∶甲醇為50∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種抗腫瘤抗生素；④將粗品一種抗腫瘤抗生素進行凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集活性組分，回收溶劑，得到一種抗腫瘤抗生素較純品；⑤將較純品一種抗腫瘤抗生素經過制備高效液相純化，收集活性峰段，回收溶劑，冷凍干燥，得到一種抗腫瘤抗生素純品。
實施例4化合物(I)的制備(1)菌種液體種子培養①液體種子培養基(g/l)的制備取酵母膏6.0g；葡萄糖6.0g；麥芽膏7.0g；復合維生素2.0ml；加水至1000ml，pH9.0，120℃滅菌30min；②發酵將菌株YIM 80133加到滅菌后的培養基中，28℃下于轉速為250轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵2天。
(2)菌種發酵培養①發酵培養基(g/l)的制備取大豆粉30.0g；甘露醇30.0g加水至1000ml，pH9.0，120℃滅菌30min；②發酵將上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133種子液加到滅菌后的培養基中，加菌種量為發酵培養基重量的10％，28℃下于轉速為250轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵7天。
(3)發酵液處理①發酵液經3500轉/分鐘離心，離心時間為25分鐘；②以等體積乙酸乙醋萃取6次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油狀物；③進行硅膠柱層析，以三氯甲烷∶甲醇80∶1到9∶1梯度洗脫，收集三氯甲烷∶甲醇為50∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種抗腫瘤抗生素；④將粗品一種抗腫瘤抗生素進行凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集活性組分，回收溶劑，得到一種抗腫瘤抗生素較純品；⑤將較純品一種抗腫瘤抗生素經過制備高效液相純化，收集活性峰段，回收溶劑，冷凍干燥，得到一種抗腫瘤抗生素純品。
權利要求
1.一種抗腫瘤抗生素，它具有如下結構
2一種抗腫瘤抗生素的制備方法，其特征是該方法包括如下步驟(1)菌種液體種子培養①液體種子培養基(g/l)的制備取酵母膏2.0～60g、葡萄糖2.0～6.0g、麥芽膏30～7.0g、復合維生素0.5～2.0ml、加水至1000ml，pH 9.0，120℃滅菌30min；②發酵將菌株YIM 80133加到滅菌后的培養基中，28℃下于轉速為190～250轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵2天。(2)菌種發酵培養①發酵培養基(g/l)的制備取大豆粉10.0～30.0g、甘露醇10.0～30.0g、加水至1000ml，pH 9.0，120℃滅菌30min；②發酵將上述方法(1)中得到的菌株YIM 80133種子液加到滅菌后的培養基中，加菌種量為發酵培養基重量的10％，28℃下于轉速為190～250轉/分鐘的搖床上搖瓶發酵5～7天。(3)發酵液處理①發酵液經2500～3500轉/分鐘離心，離心時間為15～25分鐘；②以等體積乙酸乙醋萃取4～6次，回收乙酸乙醋，得到具有活性部位的褐色油狀物；③進行硅膠柱層析，以三氯甲烷甲醇80∶1到9∶1梯度洗脫，收集三氯甲烷∶甲醇為50∶1的活性組分，回收溶劑，得到粗品一種抗腫瘤抗生素；④將粗品一種抗腫瘤抗生素進行凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集活性組分，回收溶劑，得到一種抗腫瘤抗生素較純品；⑤將較純品一種抗腫瘤抗生素經過制備高效液相純化，收集活性峰段，回收溶劑，冷凍干燥，得到一種抗腫瘤抗生素純品，所述抗腫瘤抗生素的結構為
3.根據權利要求2所述的一種抗腫瘤抗生素的制備方法，其特征是所述的酵母膏為4.0g、葡萄糖為4.0g、麥芽膏為5.0g、復合維生素為1.0ml。
4.根據權利要求2所述的一種抗腫瘤抗生素的制備方法，其特征是所述的大豆粉為20.0g、甘露醇為20.0g。
5.根據權利要求2所述的一種抗腫瘤抗生素的制備方法，其特征是所述的搖瓶轉速為220轉/分鐘，所述發酵時間為6天。
6.根據權利要求2所述的一種抗腫瘤抗生素的制備方法，其特征是所述的發酵液離心轉速為3000轉/分鐘，所述的離心時間為20分鐘，所述的乙酸乙醋的萃取次數為5次。
全文摘要
本發明是一種新的抗腫瘤抗生素，其特點是通過發酵培養保藏登記號為CGMCC No.1935的一株擬諾卡氏菌株(Nocardiopsis sp.)YIM 80133，再從其發酵液中分離、純化提取物，得到分子式為C
文檔編號A61P35/00GK101074234SQ20071006576
公開日2007年11月21日 申請日期2007年3月30日 優先權日2007年3月30日
發明者李一青, 文孟良, 李銘剛, 崔曉龍 申請人:云南大學