在宿主微生物中產生目的蛋白質的方法
【專利摘要】在宿主微生物中產生目的蛋白質的方法，所述方法包括步驟：a)構建包含用于目的蛋白質的基因和功能性frr基因且無抗生素抗性基因的載體，b)用a)中獲得的載體轉化具有失活的染色體frr基因的宿主生物，c)在允許目的基因于宿主生物中表達的條件下培養b)中獲得的經轉化的宿主生物，和d)分離目的蛋白質。
【專利說明】在宿主微生物中產生目的蛋白質的方法
[0001]本發明涉及在宿主微生物中重組產生目的蛋白質的新方法，所述新方法無需用于載體DNA存在和維持的抗生素選擇壓力。它也包括經轉化的宿主細胞，其中已失活了染色體frr基因并且其包含含有功能性frr基因的載體。
現有技術
[0002]載體、特別地高拷貝數載體的穩定維持對于DNA的制備和自其表達的蛋白質的制備是重要的。包含克隆的基因并已經導入宿主如細菌中的克隆載體如質粒在細菌的培養期間易于丟失。這是因為在細胞分裂時載體不受控制地分配到子細胞。另外，對于細菌宿主而言，載體是代謝負擔。與負荷有質粒的細菌比較，丟失了質粒的細菌通常生長得更好并表現在數量上有更多細菌。
[0003]無質粒分離體的積聚代表了用于克隆和表達目的的基礎復制子質粒的問題，因為它們不攜帶任何用于有序分配至宿主子細胞的基因系統。這代表了在大規模培養期間于宿主細菌中維持表達質粒的主要工業問題。已經嘗試了許多方法，以克服克隆質粒的分離不穩定性。
[0004]使用將某種抗生素抗性基因插入載體并添加相應的抗生素至生長培養基代表了用于質粒維持的最常見的選擇壓力。除了抗生素的經濟上花費之外，在工農業廢棄物中來自抗生素本身和抗性基因的潛在環境公害是明顯的。沒有完全地阻止無質粒分離體的出現，因為用于質粒選擇的抗生素濃度在長期培養期間作為稀釋和/或酶促降解的結果往往降低了。
[0005]US 2004/0234984涉及用于在宿主細胞中缺失抗生素抗性和/或創建載體穩定的方法。根據本發明，產生了新穎的載體，它對攜帶這種載體的宿主細胞給出總選擇。這種特性通過缺失必需基因的染色體拷貝并用質粒中的代替它來獲得。作為僅攜帶質粒的細胞能夠生長的結果，使得宿主完全依賴于質粒。優選地使用小基因如基因infA。基因infA編碼翻譯起始因子I(IFl)，其是小的胞內因子且對于細胞存活是必需因子。所述質粒不包含任何抗生素基因并且抗生素選擇因此不是必需的，這提供了在培養期間相當大的好處并消除了顯著的環境擔憂。對于待安置于溫室和自然環境中的轉基因植物而言，如果考慮到無需淘汰宿主，所述方法通過植物細菌中的載體來穩定化是尤其有利的。
[0006]Janosi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.91，pp4249_4253，1994年5月)描述了核糖體釋放因子一大腸桿菌中frr基因的產物-對于細菌生長是必需的。
[0007]Weixlbaumer等人(Nature Structural and Molecular B1logy,第14卷，第8期，第733-737頁，2007年8月)描述了結合至核糖體的核糖體再循環因子的晶體結構。
[0008]本發明的一個任務是提供用于在宿主微生物中重組產生目的蛋白質的方法，無需用于載體DNA存在和維持的抗生素選擇壓力。本發明的又一個任務是將宿主生物的生長與宿主生物中載體的存在以非常靈敏的方式關聯，目的在于立即停止那些丟失了其載體的宿主生物生長。
[0009]發明描述
[0010]本發明的一個實施方案是用于在宿主微生物中產生目的蛋白質的方法，所述方法包括步驟:
[0011]a)構建包含用于目的蛋白質的基因和功能性frr基因且無抗生素抗性基因的載體，
[0012]b)用a)中獲得的載體轉化具有失活的染色體frr基因的宿主生物，
[0013]c)在允許目的基因于宿主生物中表達的條件下培養b)中獲得的經轉化的宿主生物，和
[0014]d)分離目的蛋白質。
[0015]本發明涉及在微生物中重組產生蛋白質。
[0016]對于本公開的發明，目的蛋白質(PoI)是10至約1000個，例如20至700個和特別地
50至500個氨基酸通過肽鍵連接的氨基酸鏈。肽可以包含任何α-氨基酸，特別地蛋白原性氨基酸。
[0017]這些PoI可以是酶或非酶蛋白質。酶的實例是脂肪酶、脫氫酶、氧化酶、蛋白酶。非酶蛋白質的實例是具有抗微生物活性、特異結合某些表面、在結晶過程和粒子形成中的成核特性、晶體結構的控制、結合金屬或金屬離子、表面活性劑特性、乳化特性、穩定泡沫特性、影響細胞吸附的那些蛋白質。
[0018]目的蛋白質的基因(PoI基因)是編碼PoI的多核苷酸序列。該多核苷酸序列可以通過已知的技術分離自基因組或通過DNA合成法合成。術語PoI基因廣義地理解為除了編碼PoI的部分之外還包括調節部分如啟動子，其與PoI在它的原始遺傳背景的表達相關。
[0019]適用于本發明的微生物宿主系統原則上是能夠使本發明的核酸表達的任何生物。宿主生物是指例如細菌。
[0020]原核表達生物的非限制性例子是大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subti I i s )、巨大芽抱桿菌(Baci I Ius mega ter ium )、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)等。
[0021]本發明涉及表達構建體，其包含在調節核酸序列遺傳控制下的編碼目的蛋白質的核酸序列，并涉及包含至少一個所述表達構建體的載體。本發明的此類構建體優選地包含特定編碼序列5’上游的啟動子和3’下游的終止子序列，以及任選地其他常見調節元件，其在每種情況下均與編碼序列有效連接。
[0022]〃有效連接〃是指啟動子、編碼序列、終止子和任選地其他調節元件以每一所述調節元件在編碼序列表達期間能夠實施其目的功能的方式有序排列。可有效連接的序列的實例是靶向序列和增強子、多腺苷酸化信號等。其他調節元件包含選擇標記、擴增信號、復制起點等。例如Goeddel ,Gene Express1n Technology:Methods in Enzymology 185 ,Academic Press,San Diego,California(1990)中描述了合適的調節序列。
[0023]除了人工調節序列之外，天然調節序列仍可存在于實際結構基因的上游。該天然調節可以任選地通過遺傳修飾關閉，由此增加或降低基因表達。但是，基因構建體也可以具有更簡單的結構，即，結構基因上游沒有插入額外的調節信號，且沒有去除天然啟動子及其調節。取而代之的是，突變天然調節序列使得不再發生調節，且增加或減少基因表達。基因構建體可以包含核酸序列的一個或多個拷貝。
[0024]可使用的啟動子的例子是:cos、tac、trp、tet、trp_tet、Ipp、lac、lpp-lac、Iaclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL啟動子，它們有利地用在革蘭氏陰性細菌中；以及革蘭氏陽性啟動子amy和SP0.sub.2。給出的特別優選是使用可誘導的啟動子，例如，光可誘導的和特別地是溫度可誘導的啟動子，如P.sub.rP.sub.1啟動子。原則上，可以使用任一天然啟動子和它們的調節序列。此外，也可以有利地使用合成啟動子。
[0025]所述調節序列旨在使得核酸序列和蛋白質以特定方式表達。取決于宿主生物，例如這可以意味著基因僅在誘導后表達或過量表達，或意味著基因立即表達和/或過量表達。
[0026]本文中給出的優選是能夠積極地影響并由此增加或減少表達的調節序列或因子。因此，通過使用強的轉錄信號如啟動子和/或〃增強子〃可能在轉錄水平有利地增強調節元件。此外，但是，也可能例如通過提高mRNA的穩定性來增強翻譯。
[0027]通過融合合適的啟動子至合適的編碼核苷酸序列和終止或多腺苷酸化信號制備表達盒。為此目的，使用熟悉的重組和克隆技術，如使用例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual , Cold Spring HarborLaboratory , Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，以及 T.J.Silhavy，M.L.Berman 和L.ff.Enquist,Experiments with Gene Fus1ns,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor，N.Y.(1984)，以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularB1logy ,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience( 1987)所述的重組和克隆技術。
[0028]為了在合適的宿主生物中表達重組核酸構建體或基因構建體，有利地將其插入宿主特異的載體，這使得基因在宿主中最佳地表達。載體為本領域技術人員熟知，并且可以在例如"Cloning Vectors^(PouweIs P.H.等人編輯，Elsevier ,Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。將載體理解為除了質粒外，還包括本領域技術人員已知的任何其他載體，如噬菌體、轉座子、IS元件、粘粒、和線性或環狀DNA。
[0029]可以提及的合適的表達載體的實例是:常規的融合表達載體如pGEX(PharmaciaB1tech Inc;Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67:31-40)，pMAL(New EnglandB1labs,Beverly,Mass.)和pRIT 5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，其中谷I光甘肽S轉移酉每(GST)、麥芽糖E結合蛋白和蛋白A分別融合至重組靶蛋白。
[0030]非融合蛋白表達載體是如pTrc(Amann等人，(1988)Gene69:301-315)和pET Ild(Studier等人，Gene Express1n Technology:Methods in Enzymology 185,AcademicPress,San Diego,Calif.(1990)60-89)。
[0031]核糖體再循環因子(frr)是在細菌細胞以及真核細胞器，特別地線粒體和葉綠體中發現的蛋白質。它發揮完成蛋白質合成后再循環利用核糖體的功能。最近的證據提議frr可能通過分裂核糖體為亞基，由此釋放結合的mRNA來實現核糖體的再循環。在細菌(特別地大腸桿菌)中，喪失編碼核糖體再循環因子的基因frr是有害的。
[0032]功能性frr基因是指能夠在生物中互補失活或缺失的frr基因的功能的基因。它可以是宿主微生物的同源frr基因或是異源的frr基因或突變的frr基因。
[0033]失活的或被失活的基因尤其是被失活的frr基因是指不以功能性基因產物表達、尤其是不以核糖體再循環因子表達的基因，尤其是frr基因。能夠以不同方式實現frr基因的失活，即，完全地或部分地缺失染色體中的frr基因或通過將額外的核苷酸或多核苷酸插入frr基因，以破壞該基因的可讀框。失活基因的另一個可能性是導入終止密碼子至可讀框或缺失基因的控制元件如啟動子區。本領域存在熟知的通過敲除或插入誘變來失活基因的方法。
[0034]大腸桿菌的frr基因編碼185aa蛋白質。多肽序列可在NCBI(蛋白質)G1:16128165中找到。
[0035]具有功能性frr基因的用于轉化宿主微生物的載體不具有抗生素抗性基因，因為無需抗生素抗性來選擇攜帶該載體的宿主生物。
[0036]轉化意指導入DNA如載體或輔助質粒至宿主微生物。能夠通過已知的技術如磷酸鈣沉淀或電穿孔來實現轉化。
[0037]在微生物大腸桿菌中的重組工程能夠如Zhang等人(Nature Genetics , 20 ,123-128，1998)所述實施。
[0038]可以根據已知的方法培養和發酵重組微生物。例如，可將細菌在TB或LB培養基在20至40°C和pH 6至9繁殖。合適的培養條件在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)中有詳細描述。
[0039]如果目的蛋白質(Pol)不分泌入培養基，隨后將細胞破環并從裂解物中通過已知的蛋白質分離方法回收產物。可以任選地通過高頻率超聲波、通過高壓例如在法式壓力小室中高壓、通過滲透裂解(osmolysis)、通過去污劑、裂解酶或有機溶劑的作用、通過勻漿器或通過組合多種所列的方法破壞細胞。
[0040]可以使用已知的色譜法如分子篩色譜(凝膠過濾)如Q-瓊脂糖凝膠色譜、離子交換色譜和疏水色譜和通過其他常規方法如超濾、結晶、鹽析、透析和天然凝膠電泳純化Pol。例如在Cooper，F.G.，B1chemische Arbeitsmethoden[原來的標題:The Tools ofB1chemistry]，Verlag Walter de Gruyter, Ber I in, New York 或在 Scopes，R.,ProteinPurificat1n,Springer Verlag1New York,Heidelberg,Berlin中描述了合適的方法。
[0041]此外，例如可以使用載體系統或寡核苷酸分離重組的Pol，其中所述寡核苷酸通過特定的核苷酸序列延伸cDNA并因此編碼用于更簡單純化的經修飾的多肽或融合蛋白質。合適的此類修飾的實例是作為錨的〃標簽(tags)"，例如已知為6個組氨酸錨的修飾或能夠被抗體識別為抗原的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D.，1988 ,Antibodies: A LaboratoryManual ,Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)中描述。這些銷可以例如用于將蛋白質固定至固相支持物，例如，可被導入例如層析柱或可被用在微量滴定板或另一支撐物上的聚合物基質。
[0042]同時，這些錨也可以用于識別蛋白質。蛋白質還可通過使用常規的標志物如熒光染料、在底物反應后形成可檢測反應產物的酶標志物、或放射性標志物來識別，所述常規的標志物單獨使用或與所述錨組合使用，以衍生蛋白質。
[0043]本發明的另一實施方案是用于在宿主微生物中產生目的蛋白質的方法，所述方法包括步驟:
[0044]a)構建包含用于目的蛋白質的基因和功能性frr基因且無抗生素抗性基因的載體，
[0045]b)用a)中獲得的載體轉化具有失活的染色體frr基因且攜帶包含功能性frr基因和標志基因的輔助質粒的宿主生物，
[0046]c)用a)中獲得的載體轉化后，選擇缺乏輔助質粒的宿主生物，
[0047]d)在允許目的基因于宿主生物中表達的條件下培養c)中獲得的經轉化的宿主生物，和
[0048]e)任選地分離目的蛋白質。
[0049]該實施方案的優點是具有失活的染色體frr基因的宿主生物是存活的，因為輔助質粒的互補作用。
[0050]當使用攜帶目的基因和功能性frr基因的新載體轉化該宿主時，宿主在轉化后即刻攜帶兩種不同的載體:(i)輔助質粒和(ii)攜帶目的基因的載體，這兩種載體能夠互補失活的染色體frr基因。由于輔助質粒除了攜帶功能性frr基因之外還攜帶標志基因，這允許篩選標志物的缺乏或者存在，對該標志物或針對該標志物進行選擇或反選擇是可能的。因此，選擇僅攜帶載體a)和不再有輔助質粒的經轉化宿主生物是可能的。
[0051]本發明的另一實施方案是經轉化的微生物宿主細胞，特征在于其染色體frr基因是失活的，且在于它包含含有至少一個功能性frr基因拷貝和目的基因的載體，和在于它不包含任何用于抗生素抗性的基因。
[0052 ]權利要求書中描述了本發明的其他實施方案。
【主權項】
1.在宿主微生物中產生目的蛋白質的方法，所述方法包括步驟: a)構建包含用于目的蛋白質的基因和功能性frr基因且無抗生素抗性基因的載體， b)用a)中獲得的載體轉化具有失活的染色體frr基因的宿主生物， c)在允許目的基因于宿主生物中表達的條件下培養b)中獲得的經轉化的宿主生物，和 d)分離目的蛋白質。2.根據權利要求1的方法，其中具有失活的染色體frr基因的宿主生物攜帶包含功能性frr基因和標志基因的輔助質粒，和在用a)中獲得的載體轉化后，選擇缺乏輔助質粒的宿主生物。3.根據權利要求1的方法，其中載體上的frr基因與宿主生物是同源的。4.根據權利要求1的方法，其中宿主生物是大腸桿菌。5.根據權利要求1的方法，其中宿主生物中失活的染色體frr基因是通過基因缺失實現的。6.經轉化的微生物宿主細胞，特征在于其染色體frr基因是失活的，且在于它包含含有至少一個功能性frr基因拷貝和目的基因的載體，和在于它不包含任何用于抗生素抗性的基因。
【文檔編號】C12N15/64GK105849267SQ201480068581
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月12日
【發明人】S·耶內維因, M·F·菲勒, J·勒耶特
【申請人】巴斯夫歐洲公司