專利名稱：：抗阿片肽及其拮抗肽與該拮抗肽的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及肽段及其編碼基因與應用，特別是涉及一種具有拮抗嗎啡抗傷害作用的抗阿片肽及其拮抗肽，與該拮抗肽在制備增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷癥狀作用的藥物中的應用。技術背景眾所周知，在世界范圍內猖獗的販毒吸毒活動已成為危害社會的一個毒瘤，嚴重干擾了有序的經濟建設和社會安定，此外，靜脈吸毒還造成了艾滋病人群感染率的攀升。目前，各國政府雖都加大聯合打擊毒品走私的力度，但吸毒、販毒活動仍屢禁不止，其中一個重要的原因就是嗎啡耐受及依賴的原理尚未真正或完全被闡明，國際上尚無有效的戒毒手段。國外最先采用的"替代療法"是在戒毒過程中用美沙酮一類的藥代替阿片，這種療法將導致病人對美沙酮類藥物的耐受和依賴。在國內，寧波戒毒所楊國棟先生采用東莨菪鹼配合其它藥物戒毒，也未完全解決心癮問題。韓濟生教授采用針灸治療儀治療戒斷癥狀，試圖通過特定頻率的電脈沖刺激提高體內內源性阿片的合成來減輕癥狀，但它的最大缺陷是人群中針刺鎮痛的有效率有限而且持續地針刺也存在耐受問題。近來，石家莊中醫藥專家王巖對阿片戒斷癥狀進行辯癥施治，采用"金甲丸"治療戒斷綜合癥，正在經臨床進一步檢驗和完善。因此，迫切需要一種可從源頭上徹底消除嗎啡耐受及依賴，以及減弱或消除戒斷癥狀的戒毒藥物。
發明內容本發明的目的是提供一種具有拮抗嗎啡抗傷害作用的抗阿片肽。本發明所提供的抗阿片肽，命名為99A，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO:1;2)將序列表中SEQIDNO:1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加，具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。序列表中的SEQIDNO:1由86個氨基酸殘基組成。編碼本發明抗阿片肽99A的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO:11的DNA序列;2)編碼序列表中SEQIDNO:1的DNA序列；3)與序列表中SEQIDNO:11限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有拮抗嗎啡抗傷害作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNO:11限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為用O.1XSSPE(或O.IXSSC)，0.1%SDS的溶液，在65°C下雜交并洗膜。序列表中的SEQIDNO:11由258個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNO:1的氨基酸殘基序列的蛋白質。上述抗阿片肽99A的活性片段，可為下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO:2;2)序列表中的SEQIDNO:3;3)序列表中的SEQIDNO:4;4)將序列表中SEQIDNO:2-4的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。序列表中的SEQIDNO:2由14個氨基酸殘基組成，將具有SEQIDNO:2氨基酸殘基序列的抗阿片肽命名為99A-16;序列表中的SEQIDNO:3由19個氨基酸殘基組成，將具有SEQIDNO:3氨基酸殘基序列的抗阿片肽命名為99A-19;序列表中的SEQIDNO:4由14個氨基酸殘基組成，將具有SEQIDNO:4氨基酸殘基序列的抗阿片肽命名為DBI-16。編碼上述抗阿片肽活性片段的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO:12的DNA序列；2)序列表中SEQIDNO:13的DNA序列;3)序列表中SEQIDNO:14的DNA序列；4)編碼序列表中SEQIDNO:2-4的DNA序列；5)與序列表中SEQIDNO:12-14限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有拮抗嗎啡抗傷害作用中起重要作用的核苷酸序列；6)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNO:12-14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為用O.1XSSPE(或O.IXSSC)，0.1%SDS的溶液，在65°C下雜交并洗膜。序列表中的SEQIDNO:12由48個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNO:2的氨基酸殘基序列的蛋白質；序列表中的SEQIDNO:13由57個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNO:3的氨基酸殘基序列的蛋白質；序列表中的SEQIDNO:14由48個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNO:4的氨基酸殘基序列的蛋白質。上述抗阿片肽99A的拮抗肽也是本發明要保護的，可為下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO:5;2)序列表中的SEQIDNO:6;3)序列表中的SEQIDNO:7;4)將序列表中SEQIDNO:5-7的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受或/和減弱或消除戒斷癥狀作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。序列表中的SEQIDNO:5由21個氨基酸殘基組成，將具有SEQIDNO:5氨基酸殘基序列的抗阿片肽的拮抗肽命名為CP-99A-16+5;序列表中的SEQIDNO:6由19個氨基酸殘基組成，將具有SEQIDNO:6氨基酸殘基序列的抗阿片肽的拮抗肽命名為CP-99A-19;序列表中的SEQIDNO:7由19個氨基酸殘基組成，將具有SEQIDNO:7氨基酸殘基序列的抗阿片肽的拮抗肽命名為CP-DBI-16+5。編碼本發明抗阿片肽99A拮抗肽的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO:8的DNA序列；2)序列表中SEQIDNO:9的DNA序列;3)序列表中SEQIDNO:10的DNA序列；4)編碼序列表中SEQIDNO:5-7的DNA序列；5)與序列表中SEQIDNO:8-10限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且在增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受或/和減弱或消除戒斷癥狀中起重要作用的核苷酸序列；6)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNO:8-10限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為用O.1XSSPE(或O.IXSSC)，0.1%SDS的溶液，在65°C下雜交并洗膜。序列表中的SEQIDNO:8由63個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNO:5的氨基酸殘基序列的蛋白質；序列表中的SEQIDNO:9由57個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNO:6的氨基酸殘基序列的蛋白質；序列表中的SEQIDNO:10由63個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNO:7的氨基酸殘基序列的蛋白質。含有上述抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌以及擴增該基因中任一片段的引物也屬于本發明的保護范圍。上述抗阿片肽99A的拮抗肽可采用常規的人工合成方法直接獲得，如可用fmoc保護的固相合成法等方法人工合成，或可委托美聯(西安)生物科技有限公司或上海閃晶生物多肽合成有限公司等生物公司合成，此外，也可用利用微生物發酵表達的方法獲得。本發明還提供了一種表達上述抗阿片肽99A的拮抗肽的方法。本發明所提供的表達上述拮抗肽的方法，是將含有上述抗阿片肽99A的拮抗肽基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到抗阿片肽99A的拮抗肽。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優選為大腸桿菌。所述大腸桿菌可為Aco7iBL21(DE3)、Acoh'DH5a或￡coh'Topl0等。用于構建所述含有抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表達載體的出發載體可為任意一種可在大腸桿菌中表達外源基因的原核表達載體，如pET-22b、pET-llc、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c等。以pET-22b為出發載體，構建的含有抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表達載體為pET-CP-99A-16、pET-CP-99A-19或pET-CP-DBI-16。上述重組表達載體均可按照常規方法構建。將上述重組表達載體轉化宿主菌的方法可為生物工程領域中常用的轉化方法，如熱激法、電轉化法、接合轉化法或PEG介導的原生質體轉化法等。培養含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的宿主細胞的培養基和培養條件，均可為培養出發宿主的培養基和培養條件。其中，培養所述重組大腸桿菌宿主時需加入誘導劑，如IPTG等，所加入IPTG的濃度可為0.1-1.Ommol/L，優選為0.2mmol/L，誘導溫度可為14-37°C，優選為30'C，誘導時間可為2-4小時，優選為3小時。本發明的另一個目的是提供一種增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受或/和減弱或消除戒斷癥狀的藥物。本發明所提供的藥物的活性成分為上述抗阿片肽99A的拮抗肽；其中，所述抗阿片肽的拮抗肽選自以下氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO:5;2)序列表中的SEQIDNO:6;3)序列表中的SEQIDNO:7;4)將序列表中SEQIDNO:5-7的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受或/和減弱或消除戒斷癥狀作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的輔料，所述輔料包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑和穩定劑等。本發明的藥物可以制成注射液、干粉針劑、片劑或粒劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。上述藥物的成人用量一般為0.01-0.5mg/kg體重/次，可以一次或多次使用，療程一般為10至20天。本發明提供從豬腦中分離純化出一種抗阿片肽99A及其活性片段，它具有拮抗嗎啡抗傷害作用，吸毒過程伴隨著毒品劑量的增加可促使該蛋白的合成增加，導致嗎啡耐受及依賴的形成。本發明是利用蛋白質分子之間存在相互作用的原理，依照三個活性片段的序列，設計出了它們的拮抗肽。由于這些拮抗肽的分子量小于2000道爾頓，較容易通過血腦屏障，在中樞神經系統的相關部位起到抵消內源性抗阿片肽效應的作用。實驗證明人工合成的拮抗肽可作為內源性抗阿片肽的抑制劑，通過靜脈注射三個活性片段的拮抗肽，可達到增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和減弱或消除戒斷癥狀作用。該藥物具有以下優點1)療效顯著活性成分拮抗肽是通過消除吸毒者體內多余的內源性抗阿片肽及其效應來達到增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和消除或減弱吸毒者戒斷癥狀的目的，可從源頭上消除戒斷癥狀；2)獲得的拮抗肽都是一些氨基酸殘基殘基數量不超過25個的短肽，容易合成，便于開發研究；3)這些短肽進入體內容易被降解，不具備產生抗體的副作用，安全性高；4)用藥方便，可通過靜脈注射方式或舌下含片等多種方式給藥，以消除或減弱嗎啡戒斷的癥狀；本發明的抗阿片肽99A活性片段的拮抗肽將在醫學及戒毒藥物領域發揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。圖1為檢測狗腦提取物對電脈沖引起小鼠輸精管收縮效應的影響圖2為檢測側腦室內注入狗腦粗提物(AOS)對大鼠針刺鎮痛效應的影響圖3A和圖3B為抗阿片肽99A對嗎啡抗傷害作用的抑制效應的檢測結果圖4為嗎啡耐受小鼠側腦室內注入抗阿片肽99A的抗血清使對嗎啡的耐受被逆轉的檢測結果。圖5為免疫組化檢測小鼠腦片上抗阿片肽99A免疫陽性部位圖6為在大鼠韁核微量注射99A對由同側大腦導水管周圍灰質微量注射嗎啡所引起的嗎啡抗傷害作用影響的檢測結果圖7A-圖7D為抗阿片活性肽段99A-14、99A-19、DBI-16和DBI-19對嗎啡(20mg/kgi.P.)抗傷害作用影響的檢測結果圖8A和圖8B為99A—14、99A-19和DBI-16拮抗嗎啡抗傷害作用及DBI-19增強嗎啡抗傷害作用分別通過不同類型受體介導的鑒定結果圖9為NMDA受體和NOS在抗阿片肽99A及其活性片段拮抗嗎啡抗傷害作用中的影響的檢測結果圖10A-圖10C為拮抗肽CP-99A-16、CP-99A-19和CP-DBI-16對嗎啡抗傷害作用影響的檢測結果具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。下述實施例中所用實驗小鼠均為8-10周齡、體重20-22g的雄性昆明小鼠(購自科學院動物所)實施例1、抗阿片肽99A的獲得及其功能驗證一、豬腦抗阿片肽99A的獲得及其劑量依賴效應檢測1、抗阿片肽的發現在離體的小鼠輸精管標本，給以方波脈沖(0.1MS波寬，l次/秒)刺激可引起收縮(具體方法參見文獻J.Hughesetal(1975)EffectofmorphineonadrenergictransmissionintheMouseVasdeferens.AssessmentofagonistandantagonistpotenciesofNarcoticanalgesics53,371-381)，然后，先后在灌流液中加入鹽酸嗎啡(3.2nM)或狗腦提取物(AOS，200Pg/raL)(為狗腦提取濃縮液先后經S印hadexG-50凝膠(購自Pharmacia公司)過濾，羧甲基-纖維素(CM-C購自H.Reeve-Angel&.Co.Ltd公司)陽離子交換層析后，得到樣品)，觀察對電刺激小鼠輸精管引起收縮效應的影響。如圖l所示(M代表給嗎啡，MAP代表給狗腦提取物)，實驗發現在狗腦粗提物中，存在著可增強電刺激小鼠輸精管收縮的成分，且該樣品的增強收縮效應與嗎啡抑制電刺激小鼠輸精管收縮的效應恰恰相反，因此，將該狗腦粗提物注入小鼠側腦室內后，可觀察到嗎啡的抗傷害作用被顯著地抑制。此外，將上述狗腦粗提物注入針刺鎮痛有效大鼠(6只)的側腦室(400ug/20W/只)，以生理鹽水(Saline)為對照(6只)，IO分鐘后開始電針誘導，30分鐘后每間隔10分鐘觀察大鼠對傷害刺激的嘶叫反應。結果如圖2所示(I.C.V.代表通過預先埋藏于側腦室內的導管微量注射樣品，EA代表電針誘導針刺鎮痛；橫坐標為狗腦粗提物注射后時間，縱坐標為嘶叫閾的變化)，以生理鹽水(Saline)為對照，經針刺誘導后，大鼠出現針刺鎮痛效應；狗腦粗提物注射后，再進行針刺誘導，大鼠的針刺鎮痛效應則消失，對照組大鼠的針刺鎮痛效應仍存在，上述實驗結果提示腦內存在的抗阿片物質可能是針麻鎮痛不全的內在因素。2、豬腦抗阿片肽99A的獲得及其劑量依賴效應檢測從豬腦中分離純化抗阿片肽-99A的方法，同樣是參考楊樹長等人的方法并稍做改進(楊樹長等人(1997)，豬腦抗嗎啡鎮痛肽的分離純化及其抗血清對嗎啡耐受影響的初步研究，中國生物化學雜志11巻3期322-326)，具體方法為將新鮮豬全腦在0.lnM乙酸中勻漿提取，將豬腦提取物的濃縮液先后經S印hadex-G50凝膠過濾，S-sepharoseFastFlow離子交換層析(S-sepharoseFastFlow層析柱購自Pharmacia公司)分離后，取第l個洗脫峰的樣品，經Q-s印haroseFastFlow離子交換層析(Q-s印haroseFastFlow層析柱購自Pharmacia公司)分離，最后用HPLC純化，得到經純化的抗阿片肽物質。檢測純化的抗阿片物質對嗎啡的抗傷害作用的效應，方法為在腹腔注入20mg/kg嗎啡后10min，將純化的豬腦抗阿片物質分別經側腦室或尾靜脈途徑給小鼠進行注射，其中，側腦室的注射劑量分別為0.5、1.0、2.0nM/4W，尾靜脈的注射劑量分別為1.5、3.0、5.0mg/kg，以生理鹽水(Saline)為對照，然后檢測嗎啡的抗傷害作用。側腦室注射組的試驗結果如圖3A所示(橫坐標表示嗎啡注射后時間，縱坐標表示嘶叫閾的變化(％)，n為每組小鼠數量，i.p.表示腹腔注射，i.c.v.表示側腦室內注射)，尾靜脈注射組的試驗結果如圖3B所示，與對照組相比，兩組小鼠的嗎啡抗傷害作用都顯著地被豬腦內抗阿片物質所抑制，且這種抑制效應與劑量密切相關。將該由豬腦內提取的具有拮抗嗎啡抗傷害作用的蛋白稱為抗阿片肽99A(A0P-99A)，對該抗阿片肽進行全序列測定，測序結果表明該抗阿片肽具有序列表中SEQIDNO:l的氨基酸殘基序列，由86個氨基酸殘基組成，該序列與豬腸DBI的序列一致。編碼抗阿片肽99A的基因具有序列表中SEQIDNO:11的核苷酸序列，由258個堿基組成。二、抗阿片肽99A與嗎啡耐受及依賴關系的檢測1、制備抗阿片肽99A的單克隆抗體用步驟一提取并純化的抗阿片肽99A，按常規方法制備其單克隆抗體(制備方法參照文獻J.M.Davis,J.E.Pennington,A.MKubler.，J.F.Consiene(1982)Asimple,single-steptechniqueforselectingandcloninghybridomasforproductionofmonoclonalantibodies.J"ImmunolMethods50;141-；TerukoTuraura:HeinsBuer，ChriatianBirrandRudigerPipkom.(1983)AntibodiesagainstsyntheticpeptidesasatoolforfunctionanalysisofthetransformingproteinPP6°sreCell34587—596Sep.1983;XiGou.,AiWang.,XiLi.，Zh.Q.GouandY,Zhang(1991)Studiesonmonoclonalantibodyagainstrecombinantgranulocytecolony-stimulatingfactor.ChineseMedicalSciencesJournal(6)5:212-214)，但由于抗阿片肽99A的分子量約為10Kd，屬于弱抗原，免疫原性較差，因此，在制備抗體前，需要先將其與鑰孔槭血藍蛋白(KLH)載體偶聯作為抗原，然后，對Balb/C小鼠進行免疫(進行2次皮下多點注射免疫，中間間隔兩周)，細胞融合前3天，脾內注射13-20^抗原加強免疫。融合時，在無菌條件下，取出免疫小鼠的脾細胞與小鼠的SP2。細胞融合，應用半固體培養技術，經篩選、克隆得到能產生A0P-99A抗體的雜交瘤細胞，最后從收集的腹水中純化出單克隆抗體。2、抗阿片肽99A與嗎啡耐受及依賴關系的檢測選取20只健康小鼠，每天三次，皮下注射遞增劑量的鹽酸嗎啡，注射劑量由10mg/kg遞增至60mg/kg，持續10天形成對嗎啡耐受的小鼠。在嗎啡耐受及依賴的小鼠，腹腔注射嗎啡(50mg/kg)后，將步驟1獲得的含有抗阿片肽99A單克隆抗體的抗血清分別按1:100、1:10、l:l的比例進行稀釋，分別作側腦室內注射，注射劑量為每只12W(約含13mg抗體)，以非耐受小鼠作空白對照(Blank)，以未注射抗血清的嗎啡耐受鼠為對照(Control)，檢測嗎啡耐受小鼠側腦室內注入抗阿片肽99A抗血清對嗎啡耐受的逆轉作用。檢測結果如圖4所示(橫坐標為不同實驗組，縱坐標為嗎啡抗傷害曲線下的面積(單位cm2);**代表與耐受鼠對照組相比P<0.05，***代表與耐受鼠對照組相比P〈0.0D，與耐受鼠對照組相比，嗎啡耐受依抗阿片肽99A抗血清濃度的不同出現不同程度的逆轉，與非耐受的空白對照組相比，側腦室內注入99A的抗血清(1:1)可完全逆轉50毫克/公斤劑量嗎啡的耐受。可見只要抗阿片肽99A抗體的劑量足以與中樞內源性抗阿片肽99A結合，降低抗阿片肽99A水平，即可使嗎啡耐受得以逆轉。采用以下兩種方式檢測抗阿片肽99A的單克隆抗體對Naloxone(10mg/kg)誘發的戒斷效應-跳躍的治療作用。第一種方式是以遞增劑量嗎啡給小鼠做皮下注射，每天2次，持續20天形成對嗎啡的耐受及依賴，在最后一次注射嗎啡后6-8小時，經側腦室內注射上述獲得的抗阿片肽99A的單克隆抗體，注射劑量為每只12W(約含13ug抗體)，然后腹腔注射阿片拮抗劑Naloxone(10mg/kg)以誘發自發跳躍癥狀。結果如表1所示，在對照組(側腦室內注射12WPBS)，5只小鼠都出現自發跳躍癥狀;在治療組，5只小鼠全都未出現自發跳躍癥狀，說明抗阿片肽99A的單克隆抗體可消除由阿片拮抗劑Naloxone誘發的自發跳躍癥狀。表l抗阿片肽99A的單克隆抗體對Naloxone(10mg/kg)誘發戒斷效應-跳躍的治療作用的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>**以遞增劑量嗎啡作皮下注射，每天二次持續20天形成對嗎啡的耐受及依賴第二種方式是在嗎啡耐受及依賴小鼠的形成過程中，皮下注射劑量遞增嗎啡(注射劑量由10mg/kg遞增至80mg/kg，每天注射3次，持續12天)的同時，每天一次經側腦室內注射上述獲得的抗阿片肽99A的單克隆抗體，注射劑量為每只12W(約含13pg抗體)，如同上述試驗，在最后一次注射嗎啡后6-8小時，檢測用阿片拮抗劑(烯丙羥嗎啡酮)所誘發的自發跳躍癥狀。結果如表2所示，抗阿片肽99A的單克隆抗體可消除或減弱由阿片拮抗劑Naloxone(10mg/kgi.P.)所誘發的自發跳躍癥狀。表2抗阿片肽99A的單克隆抗體對Naloxone(10mg/kg)誘發戒斷效應-跳躍的治療作用的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>**以遞增劑量嗎啡作皮下注射，每天三次持續12天形成對嗎啡的耐受及依賴;★在每天注射遞增劑量嗎啡的同時，由側腦室注入抗阿片肽99A的單克隆抗體一次。.根據上述試驗結果推測，在嗎啡耐受及依賴形成的過程，隨著嗎啡劑量的增加，腦內抗阿片肽的合成可能增加，而嗎啡耐受的逆轉或和戒斷癥狀的消除或減弱，可能是腦內超常的內源性抗阿片肽99A被其單克隆抗體抵消的緣故。近來，KatsuraM.等(KatsuraM，HaraA,HigoA，TarumiC，HibinoY，OhkumaS.ContinuoustreatmentwithmorphineincreasesdiazepambindinginhibitormRNAinmousebrain.J.Neurochem1998dec.71(6)2638-41)及LiuX.B.等人報導[LiuX.B.，LiY.，ZhouL，ChenH.X.,Su.Zh.H.，HaoW.ConditionedplacepreferenceassociateswiththemRNAexpressionofdiazepambindinginhibitorinbrainregionsoftheaddictedratduringwithdrawal.Mol.BrainRes117(2005)47-54]，在藥物依賴時，腦內苯二氮卓結合抑制劑的信使RNA，即DBImRNA在腦內的表達量增加，從而證明上述推測是合理的，但由于抗阿片肽99A單克隆抗體的分子量約為13萬道爾頓，不可能通過血腦屏障，因而不具備臨床應用的前景。三、檢測小鼠腦內抗阿片肽99A拮抗嗎啡抗傷害作用的重要部位用免疫組化方法檢測抗阿片肽99A在小鼠腦部的分布從小鼠腦冠狀切片的免疫組化染色結果(如圖5所示)，觀察到在小鼠腦干的韁核(Hb)部位，抗阿片肽99A免疫陽性反應較強。已知韁核有神經元終止于中縫核，在鎮痛調節中它是下行性抑制的重要驛站。通過慢性埋藏于大鼠中腦導水管周圍灰質(PAG)(阿片受體分布集中的部位)的導管微量注入嗎啡2W(含20ug)，10分鐘后再經埋藏于同側韁核的導管微量注入不同劑量的抗阿片肽99A純品，注射劑量分別為l、2、5nM/4W，以生理鹽水(Saline)為對照。如圖6所示[參代表鹽水對照組，園代表99A-lnM劑量組，A代表99A-2nM劑量組，V代表99A-5nM劑量組，n為小鼠數量，縱坐標為嘶叫閾的變化(%)，橫坐標為注射嗎啡后的時間]，在大鼠韁核微量注射99A可顯著抵消由同側大腦導水管周圍灰質微量注射嗎啡所引起的嗎啡抗傷害作用，且嗎啡抗傷害作用依抗阿片肽99A注射劑量的不同而得到不同程度地抑制，說明韁核可能是抗阿片肽99A拮抗嗎啡抗傷害作用的重要部位。該結果也提示，如同阿片肽一樣，在中樞不同部位的抗阿片肽可能有不同的效應。四、抗阿片肽99A活性肽段99A-16，99A-19，DBI-16和DBI-19的獲得及其活性檢測步驟一對抗阿片肽99A全序列測定結果表明，其氨基酸殘基序列與豬腸DBI的氨基酸殘基序列一致，表明它們應屬于同一個家族，但它們的功能卻存在極大差異，如牛DBI與抗阿片肽99A/豬DBI對嗎啡抗傷害作用的效應則完全相反，前者牛DBI具有增強作用，而后者抗阿片肽99A/豬DBI則顯示拮抗作用。此外，豬腸DBI的效應還呈現抑制由葡萄糖誘發的胰島素的釋放。為揭示其中的奧秘，參考文獻(Zh.W.ChenetalIsolationandcharacterizationofporcinediazepam-bindinginhibitor,apolypeptidenotonlyofcerebraloccurrencebutalsocommoninintestinaltissuesandwitheffectsonregulationofinsulinreleaseEur.J.Biochem174，239-245(1988))將抗阿片肽99A用胰酶降解，經微量高效液相分離從中找到99A-16(序列表中SEQIDNO:2)和99A-19(序列表中SEQIDNO:3)兩個活性片段，它們在牛DBI對應的活性片段為DBI-16(序列表中SEQIDN0:4)和DBI-19肽段(序列表中SEQIDNO:15)。99A-16的編碼序列具有SEQIDNo:12的核苷酸序列，由48個堿基組成；99A-19的編碼序列具有SEQIDNo:13的核苷酸序列，由57個堿基組成；DBI-16的編碼序列具有SEQIDNo:14的核苷酸序列，由48個堿基組成。依照上述四個肽段在抗阿片肽99A及牛DBI序列所對應的氨基酸殘基，先后由美聯(西安)生物科技有限公司及上海閃晶生物多肽合成有限公司人工合成99A-16、99A-19、DBI-16和DBI-19這四個肽段。用與步驟一相同的方法檢測不同劑量的活性肽段99A-14(0.5-10nM)、99A-19(0.5-10nM)、DBI-16(10-40nM)和DBI-19(U-14nM)對嗎啡(20mg/kgi.P.)抗傷害作用的影響，以生理鹽水(Saline)為對照，活性檢測結果如圖7A-圖7D所示(橫坐標表示嗎啡注射后時間，縱坐標表示為嘶叫閾的變化(%)，n表示各組實驗小鼠數量)，由圖可以看出，除DBI-19在ll-14nM的有效劑量范圍內呈現出增強嗎啡抗傷害作用外(與牛DBI增強小鼠的嗎啡抗傷害效應的結果相符合)，99A-16、99A-19和DBI-16片段都顯示拮抗嗎啡抗傷害作用，但它們的有效劑量范圍不同，99A-16和99A-19的有效劑量為2.5-10nM，DBI-16的有效劑量為10-40nM。比較99A-16與DBI-16兩個肽段的氨基酸殘基序列，雖僅存一個氨基殘基的差異，但DBI-16拮抗嗎啡抗傷害作用的有效劑量范圍是99A-16的4倍。而99A-19和DBI-19肽段之間，雖然僅存在一個疏水性相反的氨基殘基，但對嗎啡抗傷害作用的影響則完全相反，從而揭示了造成抗阿片肽99A與牛DBI功能存在極大差異的原因。五、檢測介導拮抗嗎啡抗傷害作用和增強嗎啡抗傷害作用的受體參考文獻(M.Okubo,M.Kawaguchi(1998)Euro.J.Pharmacology359，243-249)先用苯二氮卓(BZ)受體的中樞型拮抗劑Flumazinal(購自Sigma，溶于1%Tween80中)，于嗎啡注射前30分鐘，對小鼠進行腹腔注射預處理(2.0mg/kgi.p.)，然后再用99A(2nM)、99A-16(10nM)、99A-19(10nM)和DBI-16(40nM)和DBI-19(11.6nM)檢測對嗎啡(20mg/kgi.P.)抗傷害效應的影響。以生理鹽水(Saline)為對照(Control)，同時以未用Flumazinal預處理的小鼠為對照，如圖8A所示(縱坐標為嗎啡抗傷害曲線下的面積，單位cm2;"1"代表未經處理的對照組，"2"代表經拮抗劑預處理的實驗組，n表示各組實驗小鼠數量)，結果僅觀察到DBI-19對嗎啡抗傷害作用的增強效應轉變為抑制效應，而其它三個肽段(99A-16、99A-19和DBI-16)的拮抗嗎啡抗傷害作用則不受影響。再用苯二氮卓受體的外周型拮抗劑PK11195(購自Sigma,溶于DMS0中)，于注射嗎啡前5分鐘，對小鼠進行尾靜脈注射預處理(10rag/kgi.v.)。隨后再用99A(2nM)、99A-16(10nM)、99A-19(10nM)和DBI-16(40nM)檢測對嗎啡(20mg/kgi.P.)抗傷害效應的影響。以生理鹽水(Saline)為對照(Control)，同時以未用PK11195預處理的小鼠為對照，結果如圖8B所示(縱坐標為嗎啡抗傷害曲線下的面積，單位cm2;"1"代表未經處理的對照組，"2"代表經拮抗劑預處理的實驗組，n表示各組實驗小鼠數量)，實驗顯示三個肽段(99A-16，99A-19和DBI-16)對嗎啡抗傷害作用的拮抗效應都被逆轉。上述實驗結果表明，99A-16，99A-19和DBI-16的拮抗嗎啡抗傷害作用是通過外周型BZ受體介導，而DBI-19增強嗎啡抗傷害作用則是通過中樞型BZ受體介導的。六、檢測NMDA受體和N0S在抗阿片肽99A及其活性片段拮抗嗎啡抗傷害作用中的作用研究表明，興奮性氨基酸醒DA受體和一氧化氮合成酶系統(N0S)在嗎啡耐受及依賴過程起到至關重要的作用，用NMDA受體拮抗劑或N0S抑制劑對小鼠進行預處理后，可抑制嗎啡耐受及依賴的形成，防止戒斷癥狀的出現。[AdamsML,KalickiJM，MeyerER，CiceroTJ(1993)Inhibitionofthemorphinewithdrawalsyndromebynitricoxidesynthaseinhibitor,NG-Nitro-L-argininemethylester.LifeSci52:PL245-PL249;CappendijkSL，VriesR,DzoljicMR(1993)Inhibitoryeffectofnitricoxide(NO)synthaseinhibitorsonnaloxone-precipitatedwithdrawalsyndromeinmorphine-dependentmice.NeurosciLett142:97—100;HermanBH,VocciF，BridgeP(1995)Theeffectof麗DAreceptorantagonistsandnitricoxidesynthaseinhibitorsonopioidtoleranceandwithdrawal.Neuropsychopharmacology11:269-293',VaupelDB，KimesAS,LondonED(1995b)Nitricoxidesynthaseinhibitors:preclinicalstudiesofpotentialusefortreatmentofopiateaddiction.Neuropsychopharmacology11:313-322;TrujilloK.A.Areviewofpreclinicalstudies:Are腿DAreceptorsinvolvedinopiate—inducedneuralandbehavioralplasticity*Psychopharmacology(2000)131:121-121;HeinzenEL,PollackG.M.(2004)Thedevelopmentofmorphineantinociceptivetoleranceinnitricoxidesynthase-deficientmice.Biochem.Pharmacologyvol67(4):735-741]。用與步驟五相似的方法分別用興奮性氨基酸NMDA受體拮抗劑MK-801(購自Sigma,0.lmg/kgi.p.)于注射嗎啡前15分鐘，或用一氧化氮合成酶NOS抑制劑L-NAME(購自Sigma，45mg/kgi.p.)于注射嗎啡前20分鐘，對小鼠進行預處理，然后再用99A(2nM)、99A-16(10nM)、99A-19(10nM)和DBI-16(40nM)檢測對嗎啡(20mg/kgi.P.)抗傷害效應的影響.以生理鹽水(Saline)為對照(Control)，同時以未用MK-801及L-NAME預處理的小鼠為對照，結果如圖9所示(縱坐標為嗎啡抗傷害曲線下的面積，單位cm2;"1"代表未經處理的對照組，"2"代表經NOS抑制劑預處理的實驗組，"3"代表經羅DA拮抗劑預處理的實驗組，n表示各組實驗小鼠數量)，抗阿片肽99A及99A-16、99A-19和DBI-16肽段對嗎啡抗傷害作用的拮抗作用被解除，說明抗阿片肽99A及其短肽拮抗嗎啡抗傷害作用需要麗DA受體和NOS的介導。由此推側，用麗DA受體拮抗劑及NOS抑制劑處理，可抑制嗎啡耐受及依賴的形成或可防止戒斷癥狀的出現，可能是因抗阿片肽的作用被阻斷的緣故。實施例2、抗阿片肽99A拮抗肽的獲得及其活性檢測一、99A-16、99A-19和DBI-16的拮抗肽的獲得根據蛋白質分子之間存在相互作用的原理，參考文獻(J.R.HealetalSpecificinteractionsbetweensenseandcomplementarypeptides:TheBasisfortheproteomiccodeChemBIOChem2002，3，114-131)設計出99A-16、99A-19和DBI-16三個短肽的拮抗肽，其中，將99A-16的拮抗肽命名為CP-99A-16+5，具有SEQIDNO:5的氨基酸殘基序列，由21個氨基酸殘基組成，其編碼序列具有序列表中的SEQIDNO:8的核苷酸序列，由63個堿基組成；將99A-19的拮抗肽命名為CP-99A-19，具有SEQIDNO:6的氨基酸殘基序列，由19個氨基酸殘基組成，其編碼序列具有序列表中的SEQIDNO:9的核苷酸序列，由57個堿基組成;將DBI-16的拮抗肽命名為CP-DBI-16+5，具有SEQIDNO:7的氨基酸殘基序列，由21個氨基酸殘基組成，其編碼序列具有序列表中的SEQIDNO:10的核苷酸序列，由63個堿基組成。二、99A-16、99A-19和DBI-16的拮抗肽的活性檢測選取正常昆明小鼠18只，分三組(每組6只，n=6)，分別在注射嗎啡(20mg/kgi.P.)后，由尾靜脈注入CP-99A-16+5(7.0mg/Kg)、CP-99A-19(6.6mg/Kg)和CP-DBI-16+5(22mg/Kg)，檢測對嗎啡抗傷害效應的影響，[以生理鹽水為對照(Control,Saline50Wi.V.)]，結果如圖10A-圖10C所示[橫坐標為嗎啡注射后時間(min)，縱坐標為嘶叫閾的變化(％)]，與對照組相比，注射CP-99A-16+5、CP-99A-19和CP-DBI-16+5后嗎啡的抗傷害作用顯著地增強，顯然這些拮抗肽起著抗阿片肽抑制劑的作用，抵消了內源性抗阿片肽的效應。此外，由于這些拮抗肽分子量小于2000道爾頓，由尾靜脈注入體內可通過血腦屏障進入中樞神經系統，奠定了拮抗肽CP-99A-16+5、CP-99A-19和CP-DBI-16+5具有臨床應用的前景。利用小鼠的嗎啡耐受和依賴模型，還進行了納絡酮(Naloxone)誘發的嗎啡戒斷效應實驗，方法為以遞增劑量的鹽酸嗎啡，每天三次，持續12天，對小鼠作皮下注射使小鼠形成對嗎啡的耐受和依賴，在第ll天最后一次注射嗎啡后6-8小時，給對照小鼠(『7)尾靜脈注射生理鹽水(Saline50Wi.V.)，腹腔注射Naloxone(10mg/kg，購自Sigma),結果全部小鼠都誘發出戒斷效應-跳躍，但給嗎啡耐受及依賴小鼠尾靜脈分別注射拮抗肽CP-99A-19(17mg/kg)，CP-99A-16+5(17.5mg/kg)和CP-DBI-16+5(65mg/kg)后，Naloxone誘發的戒斷效應-跳躍可被消除或明顯減弱(見表3和表4)。秩和檢驗表明與對照組相比，存在極顯著的差異，進一步證明本發明的拮抗肽CP-99A-16+5，CP-99A-19和CP-DBI-16+5具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和減弱或消除戒斷癥狀作用的藥物作用，展現出臨床應用的前景。表3尾靜脈注射拮抗肽CP-99A-16+5，CP-99A-19和CP-DBI-16+5對納絡酮(Naloxone10mg/kgi.P.)誘發嗎啡戒斷癥狀--跳躍的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>**秩和檢驗表明與對照組相比，差異顯著(P=l-0.05=0.95).序列表<140>15<210>1<211>86<212>PRT<211>野豬屬豬(5""sscro/aob歷eWca5ris5W7)〈400〉1SerGinAlaGluThrLysProAla20GinAlaThrVal35LeuLysGlyLys50SerLysGluAsp65LysLysLysTyrPheGluLysAlaAlaGluGluValLysAsnLeuLys51015AspAspGluMetLeuPhelieTyrSerHisTyrLys2530GlyAsplieAsnThrGluArgProGlylieLeuAsp4045AlaLysTrpAspAlaTrpAsnGlyLeuLysGlyThr5560AlaMetLysAlaTyrlieAsnLysValGluGluLeu707580Glylie85<210>2〈211〉16<212>PRT<211>人工序列<220><223〉〈400〉2ThrLysProAlaAspAspGluMetLeuPhelieTyrSerHisTyrLys151015〈210>3<211>19<212〉PRT<211>人工序列〈220〉〈223〉<400>3AlaLysTrpAspAlaTrpAsnGlyLeuLysGlyThrSerLysGluAsp151015AlaMetLys〈210〉4<211>16<212>PRT<211>人工序列<220>〈223〉<400〉4ThrLysProAlaAspGluGluMetLeuPhelieTyrSerHisTyrLys151015<210>5<211>16〈212〉PRT〈211〉人工序列〈220〉<223>〈400〉5SerUuArgSerValValLeuHisGluGluAspValArgValValLeu15-1015〈210〉6<211>19<212>PRT<211〉人工序列〈220〉<223〉<400〉6GlyLeuProValGlyProValAlaGinLeuAlaGlyAlaLeuLeuVal151015GlyHisLeu<210〉7〈211〉16<212>PRT〈211〉人工序列〈220〉〈223〉<400〉7SerLeuArgSerValLeuLeuHisGluGluAspValArgValValLeu151015〈210〉8<211〉63<212>DNA<211>人工序列<220〉<223〉〈400〉8agcctgagaagcgtggtgctgcacgaggaggacgtgagagtggtgctgagcagcggcagc60age63〈210〉9〈211〉57<212>DNA<211>人工序列〈220〉<223〉<400〉9gggctcccagtcgggccagtcgctcagctcgctggggctctcctcgtcgggcatctc5了<210〉10<211>63<212〉DNA<211〉人工序列〈220><223>〈400〉10agcctgagaagcgtgctgctgcacgaggaggacgtgagagtggtgctgagcagcggcagc60age63<210>11<211〉258〈212〉DNA<211>人工序列〈220〉〈223〉<400>11tctcaggcgggatgatg卿acagaacggcctgaaagggeiaaga^aaa^tagtttgagaaagctgctgaggaagttaagaaccttaagaccaaaccagca60tgctgttcatctacagccactacaaacaagcgaccgtgggtgacataaat120ctggaattttggacctcaaaggcaaggccaagtgggatgcctggaatggg180cttccaaggaagatgccatgaaagcgtatatcaacaaagtagaagaacta2403tgg3ata258〈210〉12<211〉48<212〉DNA〈211〉人工序列<220〉〈223〉<400〉12accaagcccgccgacgacgagatgctgttcatctacagccactacaag48<210〉13〈211〉57〈212〉DNA<211〉人工序列<220〉<223〉〈400〉13gccaagtgggacgcctggaacggcctgaagggcaccagcaaggaggacgccatgaag57〈210〉14<211〉48<212>DNA<211〉人工序列<220><223>〈400〉14accaagcccgccgacgaggagatgctgttcatctacagccactacaag48<210〉15〈211〉19<212〉PRT<211>人工序列<220><223〉〈400〉15AlaLysTrpAspAlaTrpAsnTyrLeuLysGlyThrSerLysGluAsp151015AlaMetLys權利要求1、一種抗阿片肽，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO1；2)將序列表中SEQIDNO1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。2、編碼權利要求1所述的抗阿片肽的基因。3、根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO:11的DNA序列；2)編碼序列表中SEQIDNO:1的DNA序列;3)與序列表中SEQIDNO:11限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有拮抗嗎啡抗傷害作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNO:11限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、權利要求1所述的抗阿片肽的活性片段，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO:2;2)序列表中的SEQIDNO:3;3)序列表中的SEQIDNO:4;4)將序列表中SEQIDNO:2-4的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。5、編碼權利要求4所述的抗阿片肽活性片段的基因。6、根據權利要求5所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO:12的DNA序列；2)序列表中SEQIDNO:13的DNA序列;3)序列表中SEQIDNO:14的DNA序列;4)編碼序列表中SEQIDNO:2-4的DNA序列;5)與序列表中SEQIDNO:12-14限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有拮抗嗎啡抗傷害作用的核苷酸序列；6)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNO:12-14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。7、權利要求1所述的抗阿片肽的拮抗肽，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO:5;2)序列表中的SEQIDNO:6;3)序列表中的SEQIDNO:7;4)將序列表中SEQIDNO:5-7的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷癥狀作用的多肽。8、編碼權利要求7所述的抗阿片肽拮抗肽的基因。9、根據權利要求8所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一:1)序列表中SEQIDNO:8的DNA序列;2)序列表中SEQIDNO:9的DNA序列;3)序列表中SEQIDNO:10的DNA序列；4)編碼序列表中SEQIDNO:5-7的DNA序列；5)與序列表中SEQIDNO:8-10限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且在激增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷癥狀中起重要作用的核苷酸序列；6)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNO:8-10限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。10、含有權利要求2、3、5、6、8或9所述基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。11、以權利要求7所述的抗阿片肽的掊抗肽為活性成分的增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷癥狀作用的藥物；其中，所述抗阿片肽的拮抗肽選自以下氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO:5;2)序列表中的SEQIDNO:6;3)序列表中的SEQIDNO:7;4)將序列表中SEQIDNO:5-7的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷癥狀作用的多肽。全文摘要本發明公開了一種抗阿片肽及其拮抗肽與應用。該抗阿片肽是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO1；2)將序列表中SEQIDNO1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。其拮抗肽是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO5-7；2)將序列表中SEQIDNO5-7的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強嗎啡鎮痛、逆轉嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷癥狀作用的多肽。本發明的抗阿片肽及其活性片段與拮抗肽將在醫學及戒毒藥物的制備領域發揮重要作用，應用前景廣闊。文檔編號A61P25/00GK101323641SQ20071010038公開日2008年12月17日申請日期2007年6月11日優先權日2007年6月11日發明者吳才宏,紅曲,陳玉珍申請人:北京大學