專利名稱：源自蜂王漿的抗氧化肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗氧化作用的肽，具體而言涉及通過將蜂王漿中含有的蛋白質水解所獲得的抗氧化肽。
背景技術：
現在，蜂王漿廣泛地應用于保健食品、醫藥品、化妝品等領域，報告顯示其具有擴張血管、降低血壓、抗菌等各種藥理作用及營養生理作用。
蜂王漿是由蜜蜂的唾液腺合成、由位于頭部的大顎腺分泌的乳狀物質，是工蜂為了培育蜂王而喂食蜂王幼蟲巢中的幼蜂的物質。蜂王漿均衡地富含蛋白質、維生素、礦物質，一生都食用蜂王漿的蜂王的壽命是工蜂的40倍，并且具有一天產卵2000個的能力。對蜂王漿的有效成分的研究，一直以10-羥基-2-癸烯酸(デセン酸)為代表的脂肪酸、氨基酸、維生素等低分子化合物為中心而進行。
另一方面，雖然蜂王漿一般含有10％以上的蛋白質，但是對與該蛋白質分子結構、生理作用相關的研究一直比較落后。并且，制造含有蜂王漿的化妝品、保健藥水(ドリンク剤)等時，進行醇提取，蛋白質作為沉淀物被分離，但現階段沒有實現對該蛋白質的有效利用。
關于蜂王漿蛋白質的蛋白酶處理物，為人所知的是其具有鈣吸收促進作用(仲佐輝子、食品と開発、34，5(1999))、降低血糖值作用(上田修一郎、Food Style、21，6，5(2002))，并且也有關于其抗氧化作用的報道((社)日本全國蜂王漿公平貿易理事會(全國ロ一ャルゼリ一公正取引協議會)「ロ一ャルゼリ一(Royal Jelly)に関する研究」平成13年度研究報告書)，但其效果不如維生素E。
本發明的目的在于提供具有強抗氧化作用的天然物質。
發明內容
針對上述課題，經過反復的研究，結果本發明人發現通過將蜂王漿用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶進行酶處理，可以獲得具有和維生素E同等程度的強抗氧化能力的抗氧化肽。
即，本發明涉及如下所示的發明1.具有以下(1)～(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
2.以上述1所述的抗氧化肽作為有效成分的抗氧化劑。
3.含有上述1所述的抗氧化肽的食品。
4.具有以下(1)～(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽的制造方法(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp，其特征在于，用蛋白酶將源自蜂王漿的蛋白質水解。
5.含有上述1所述的抗氧化肽的化妝品。
圖1表示通過硫氰酸鐵法進行的抗氧化作用的測定結果。圖1中，“none”表示沒有蛋白質的對照，“Chymom”表示用胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶處理所獲得的分解物(Chymo級分)，“S.I”表示表示用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及小腸酶處理所獲得的分解物(S.I級分)，“V.E”表示維生素E。
圖2表示陽離子交換色譜分析法的色譜圖、及各級分的抗氧化試驗的結果。
具體實施例方式
本發明的抗氧化肽具有如下的氨基酸序列。
Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu(以下簡稱為“肽1”)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln(以下簡稱為“肽2”)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp(以下簡稱為“肽3”)肽1～肽3是新的肽，其抗氧化作用通過本發明首次得到明確。
本發明的抗氧化肽也可以通過基因重組或化學合成獲得，并且，也可以通過使胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自豬的小腸酶作用于蜂王漿本身(生蜂王漿、干蜂王漿等)或者源自蜂王漿的蛋白質級分來獲得。并且，只要可以獲得肽1～肽3，也可以使用由胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自豬的小腸酶等水解酶將蜂王漿以外的蛋白質原料水解而得到的物質。
作為用于通過蛋白質的酶分解制造本發明的抗氧化肽的酶可以舉出胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小腸酶等，這些酶是可以將源自微生物、包括哺乳動物在內的動物、植物、酵母、真菌等任意的生物的肽鍵水解的酶的例子，優選胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自豬的小腸酶。例如，通過將源自蜂王漿的蛋白質在37℃左右的溫度下和源自各種生物的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小腸酶同時進行約1～約48小時的處理，可以獲得本發明的任意一種抗氧化肽。
本發明的肽可以從源自蜂王漿的蛋白質的酶分解物中進行分離、提純后使用，也可以將包括本發明的抗氧化肽和其他多種肽的蛋白分解物組合物(根據需要去除鹽類、糖類或者高分子蛋白質等的物質)作為抗氧化肽用于食品、化妝品等各種用途。
例如，含有蜂王漿的保健藥水是通過將向蜂王漿添加約70～約95％(v/v)的醇、優選乙醇后沉淀的蛋白質除去而制造的，該含水醇中不溶性的源自蜂王漿的蛋白質可以作為酶處理的原料蛋白質使用。作為化學合成法，可以通過肽合成器進行合成，也可以通過固相合成或者液相合成，階段性地通過肽鍵將氨基酸延長來制造。
本發明的抗氧化肽基于其抗氧化作用，可以適合添加到由活性氧引起的各種疾病的預防及治療用的食品中。本發明的抗氧化肽具有和維生素E同等程度的抗氧化能力，通過作為食品每天攝取約1μg～約1000mg，可以預防或者治療由活性氧引起的各種疾病。作為食品，可以添加到飲料、保健藥水等液狀食品、膠狀食品(包括營養輔助食品、下咽困難者用的食品)，也可以作為輔助物、功能性食品等以藥片、顆粒等固形食品的形式攝取。并且，也可以用于準醫藥品(口中清涼劑、護齒、護膚、毛發用劑、洗浴用劑、爽身粉類(てんか粉類)、保健藥水、健胃清涼劑等)、動物用食品(寵物食品等)、動物用飼料、植物用肥料等。
本發明的抗氧化肽通過添加到對氧化不穩定的食品中，可以作為穩定劑使用。
并且，本發明的抗氧化肽也可以添加到化妝品中。作為化妝品，例如適用于洗劑、化妝水、乳狀液、口紅、霜劑、凝膠、面膜(パック)、粉底霜等主要用于皮膚或粘膜等的物質。
以下對本發明通過實施例進行詳細說明。
實施例1(1)抗氧化肽級分的調制將醇變性蜂王漿蛋白質凍干之后，溶解到5倍量的蒸餾水中。通過進行透析去除低分子的糖、雜質，獲得純度更高的醇變性蜂王漿蛋白質。將該蛋白質溶液用1N HCl調整到pH2.8，在最初用1/500重量比的胃蛋白酶進行處理。將其分解物依次用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(シグマ公司制造)、源自豬的小腸酶進行處理。對于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，添加后在37℃下進行24小時溫育，對于小腸酶，添加后在37℃下進行1小時溫育。在反應停止時，如果是胃蛋白酶，用1N NaOH調整到pH8.0以使酶失活，如果是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小腸酶時，添加4倍量的99.7％乙醇，以3,000×g進行20分的離心分離，去除未反應的蛋白質及酶。將通過小腸酶處理所獲得的上清液用蒸發器進行濃縮干燥固化后，溶解到蒸餾水中，作為醇變性蜂王漿蛋白質的蛋白酶分解物。將這樣所獲得的胃蛋白酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶分解物(Chymo級分)、胃蛋白酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶分解物/小腸酶分解物(S.I級分)作為樣本使用。肽的濃度測定通過Lowry法進行。標準蛋白質使用牛血清白蛋白。
此外，作為“醇變性蜂王漿蛋白質”使用通過將蜂王漿用醇(本實施例中為70％v/v含水乙醇)沉淀處理，將所獲得的蜂王漿蛋白質凍干而得到的物質。
(2)抗氧化作用的測定(2-1)氧化模型體系氧化模型體系是將Chen等的方法(14)加以改良后進行的。向管形瓶中加入5mg亞麻酸、1ml的0.2M磷酸鉀緩沖液(K-phosphatebuffer)(pH7.0；1％TritonX-100)，作為氧化促進劑添加0.05mM氯化鐵(II)和蒸餾水，在40℃下進行4分鐘的超音波處理，做成乳化液。加入樣本(0.2％)和蒸餾水使最終容量為1ml，，在40℃的恒溫槽中加熱60分鐘，并振動。對于加熱前及加熱后的反應液的過氧化脂質的量盡快地通過硫氰化鐵法進行測定。對于抗氧化作用的評價，通過對加熱前后的過氧化脂質的增加量的比較來進行。
(2-2)硫氰酸鐵法根據大澤等的方法(23)進行。向0.05ml的反應液中加入99.5％的乙醇2.25ml、30％硫氰酸銨水溶液0.05ml、0.1ml的1N HCl以及0.1ml的0.02MFeCl2/3.5％HCl，進行充分攪拌后，測定500nm下的吸光度。測定時使用Jasco、V-530UV分光光度計。S.I級分、Chymo級分、維生素E(VE)及無蛋白質對照(none)的比較結果如圖1所示。另外，各肽以0.2％的濃度添加。這是因為一般情況下食品添加物的使用濃度是0.1％左右，所以使用與該濃度相近的值。可以看出，S.I樣本顯示出和α-生育酚(維生素E)同等的抗氧化作用。
(3)抗氧化肽的分離、鑒定(3-1)陽離子交換色譜分析法S.I級分溶解到0.05M的乙酸銨緩沖液(pH6.0)中，并使其吸附到用該緩沖液平衡化的AG50WX2(H+型，50-100目，BioRad)柱上。將非吸附物質用同樣的緩沖液清洗后，將吸附的級分用0.2M的NH4OH洗脫。將洗脫的吸附級分凍干，獲得堿性肽級分。陽離子交換色譜分析法的色譜圖、以及各級分的抗氧化試驗結果如圖2所示。圖2中具有最高抗氧化活性的級分V進一步用HPLC提純。
(3-2)HPLC為了分離級分V中存在的抗氧化肽，進行使用反相柱的高效液體色譜分析法(HPLC)。其中柱使用ODS柱(Pegasil-3000DS，SenshuScientific Co.)，洗脫時使用從0.1％TFA水溶液到含有0.085％TFA的60％乙腈溶液的60分鐘的濃度梯度法(1％/min)。肽的洗脫位置用220nm下的吸光度進行了確認。并且，再次進行HPLC時，使用從含有0.1％TFA的20％乙腈溶液到含有0.085％TFA的40％乙腈溶液的40分鐘的濃度梯度法(0.5％/min)。對于通過用反相柱的HPLC分離的抗氧化肽的氨基酸序列，使用蛋白質定序儀(プロティンシ一クェンサ一)G-1005A(ヒュ一レット·パッカ一ド社)進行分析。其結果是獲得了肽<p>(6)將經步驟(5)處理的復合材料薄膜，單向疊層，放入模具中真空熱壓，真空度0.08Mpa左右，熱壓溫度160℃左右，壓力60Mpa左右，然后脫模、精修、滅菌、包裝。得到實施例1.a組分復合材料試件。
實施例1中，b、c、d、e各組復合材料的制備工藝與a組相同(僅配比不同)。
(7)將經步驟(6)處理的復合材料試件，在MTS-810材料試驗機上測試彎曲強度、彎曲模量、剪切強度和壓縮強度，實驗結果見表1表1 CPG/PLLA/PDLLA復合材料力學性能(重量比)
復合材料電鏡掃描照片CPG/PLLA/PDLLA單向長纖維復合材料拉伸斷口形貌(見圖1)、CPG/PLLA/PDLLA單向復合材料橫向拉伸斷口的SEM照片(見圖2)，纖維分布均勻界面粘結交好。
(8)降解實驗將復合材料試樣真空干燥后，放入盛有人工降解液(Ringer’s生理鹽液)的試管中(固液比1∶50)，在恒溫37℃下降解，經一定時間取出，觀察試樣表面變化、烘干、稱重和測試力學性能。宏觀表面觀察發現a、e兩組試件，表層均有裂紋。
降解過程中，力學性能衰減規律見表2表2 CPG/PLLA/PDLLA復合材料降解性能
制劑例3健康食品(片劑)配合以下各成份，按照通常的方法調制成片劑。
淀粉15重量％乳糖25重量％羥丙基纖維素4重量％硬脂酸鎂1重量％蟲膠(シェラック)5重量％砂糖45重量％實施例1所獲得的蜂王漿蛋白質酶分解物 5重量％根據本發明，可以獲得源自天然物質的、安全性高的抗氧化肽，并可廣泛地應用于食品、化妝品等領域。
序列表<110>株式會社山田養蜂場(YAMADA APICULTURE CENTER，INC.)<120>源自蜂王漿的抗氧化肽<130>SPI050357-25<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>蜂王漿<400>1Tyr Tyr Ser Pro Leu5<210>2<211>8<212>PRT<213>蜂王漿<400>2
Asn Tyr Pro Phe Asp Val Asp Gln58<210>3<211>8<212>PRT<213>蜂王漿<400>3Ser Leu Pro Ile Leu His Glu Trp58
權利要求
1.具有以下(1)～(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
2.以權利要求1所述的抗氧化肽的任意一種作為有效成分的抗氧化劑。
3.含有權利要求1所述的抗氧化肽的任意一種的食品。
4.具有以下(1)～(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽的制造方法(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp，其特征在于，用蛋白酶將源自蜂王漿的蛋白質水解。
5.含有權利要求1所述的抗氧化肽的化妝品。
全文摘要
本發明提供具有以下(1)～(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽(1)Tyr－Tyr－Ser－Pro－Leu；(2)Asn－Tyr－Pro－Phe－Asp－Val－Asp－Gln；(3)Ser－Leu－Pro－Ile－Leu－His－Glu－Trp。
文檔編號C07K7/00GK1680429SQ20051000942
公開日2005年10月12日 申請日期2005年2月16日 優先權日2004年2月16日
發明者西村敏英, 田邊創一, 雜賀愛 申請人:株式會社山田養蜂場