抑制多重耐藥菌的化合物、其制備方法及應用與流程

本發明涉及藥物化學技術領域，尤其涉及一類抑制多重耐藥菌的化合物、其制備方法及應用。

背景技術：

由于世界范圍的抗生素的大規模使用和濫用，各種“多重耐藥細菌”不斷出現，對人類的健康提出了嚴峻的挑戰，已經成為全球公共健康最大的威脅之一。然而，抗生素新藥的研發進展非常緩慢，尤其缺乏具有全新抗菌機理的抗生素新藥，在過去的30年內沒有一種具有新的抗菌機理的抗菌藥物出現在市場上，人類即將面臨沒有抗生素可用的重大危機。

抗菌肽是宿主防御體系中天然免疫的一個重要組成部分，它廣泛分布于自然界中。抗菌肽是由12～80個氨基酸組成的陽離子肽，含有大約50％的非極性氨基酸殘基，具有兩親性特征。抗菌肽是通過靜電作用吸附在細菌細胞膜上，使得細胞磷脂膜結構發生改變，滲透性增強，在細胞膜上形成孔洞，引起胞內物質泄漏，從而殺死細菌。由于其獨特的抗菌機制，顯示出抗菌譜廣、不易產生耐藥性、特異性強等優點，有望成為具有巨大發展潛力的新型抗菌藥物。

目前抗菌肽的數量多，種類繁雜，結構也復雜多變。但是天然抗菌肽在生物體中含量極低，提取工藝繁雜，而化學合成抗菌肽的成本較高。另外，許多抗菌肽對宿主細胞的毒副作用大，且容易造成紅細胞溶血。抗菌肽存在于水溶液時，其分子結構易被破壞，影響其生物活性。微生物直接表達抗菌肽時存在產量低、純化困難的難題，這些因素成為制約抗菌肽進入實際應用的最大障礙。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一類抑制多重耐藥菌的化合物、其制備方法及應用，其為柔性結構，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有好的抗菌效果。

本發明提供了一類抑制多重耐藥菌的化合物，具有式ⅰ所示結構，或其藥學上可接受的鹽：

其中，a、g、e獨立的選自c或n。

d為nh、o或s。

r1為h、c1～c5的烷基，c1～c5的烷氧基或c1～c5烷基取代的羥基。

n為1～7的整數；在本發明的某些具體實施例中，其為2、3、4、5或6。

m為c2～c12的烷基、含氧烷基、含氮烷基或含硫烷基；優選的，m選自以下任一結構：

q選自以下任一結構：

其中，x、y各自取1～12的正整數。

在本發明的某些具體實施例中，所述化合物具有以下任一結構：

本發明中，上述結構式中的彎線表示連接鍵，單鍵“——”表示甲基。

上述藥學上可接受的鹽優選為鹽酸鹽、醋酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽等中的任意一種或多種。

本發明還提供了上述化合物的制備方法，包括以下步驟：

a)將化合物1和化合物2在水體系中進行反應，得到化合物3；

b)將化合物4和化合物5，在堿的作用下進行反應，得到化合物6；

c)將化合物6和化合物3，在堿的作用下進行反應，得到化合物7；

其中，a、g、e獨立的選自c或n；

d＇為nh2、oh或sh；

d為nh、o或s；

r1為h、c1～c5的烷基，c1～c5的烷氧基或c1～c5烷基取代的羥基；

n為1～7的整數；

m為c2～c12的烷基、含氧烷基、含氮烷基或含硫烷基；

q為cl。

上述步驟a)和b)沒有先后順序之分。

所述步驟a)中，所述反應的溫度優選為30～70℃。

所述步驟b)中，反應的溫度優選為0～5℃。本發明對反應中添加的堿并無特殊限定，可以為本領域技術人員熟知的堿性化合物，本發明優選為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、三乙胺、n，n-二異丙基乙胺。所述反應的溶劑優選為乙腈、丙酮、四氫呋喃等。

所述步驟c)中，反應的溫度優選為50～90℃。本發明對反應中添加的堿并無特殊限定，可以為本領域技術人員熟知的堿性化合物，本發明優選為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、三乙胺、n，n-二異丙基乙胺。所述反應的溶劑優選為水/乙腈、水/丙酮、水/四氫呋喃等混合溶劑。

當q不為cl，而是選自以下任一時：

其中，x、y各自取1～12的正整數。

所述制備方法還包括：

對化合物4、6或7中，a、g之間的c原子連接的cl原子進行取代反應的步驟。

即所述方法的反應路線如下：

具體包括如下步驟：

a)將化合物1和化合物2在水體系中反應，得到化合物3；

b)將化合物4溶于合適溶劑中，在堿的作用下，與化合物5發生反應，得到化合物6＇；

c)化合物6＇與kq在混合溶劑中反應，得到化合物7＇；

d)堿的作用下，化合物3與化合物7＇在混合溶劑中反應，得到化合物8＇。

或者反應路線如下：

具體包括如下步驟：

a)將化合物1和化合物2在水體系中反應，得到化合物3；

b)將化合物9與kq在混合溶劑中反應，得到化合物10；

c)將化合物10溶于合適溶劑中，在堿作用下，與化合物11發生反應，得到化合物12；

d)堿的作用下，化合物3與化合物12在混合溶劑中反應，得到化合物13。

或者反應路線如下：

具體包括如下步驟：

a)將化合物1和化合物2在水體系中反應，得到化合物3；

b)在堿作用下，化合物14與化合物15在混合溶劑中反應，得到化合物16；

c)化合物16與kq在合適溶劑中反應，得到化合物17；

d)堿的作用下，化合物3與化合物17在混合溶劑中反應，得到化合物18。

上述各步驟的反應條件同上，在此不再贅述。

本發明還提供了上述化合物的另外一種制備方法，包括以下步驟：

a)將化合物1和化合物2在水體系中進行反應，得到化合物3；

b)將化合物4和化合物3，在堿的作用下進行反應，得到化合物8；

c)將化合物8和化合物5，在堿的作用下進行反應，得到化合物7；

其中，a、g、e獨立的選自c或n；

d＇為nh2、oh或sh；

d為nh、o或s；

r1為h、c1～c5的烷基，c1～c5的烷氧基或c1～c5烷基取代的羥基；

n為1～7的整數；

m為c2～c12的烷基、含氧烷基、含氮烷基或含硫烷基；

q為cl。

上述各步驟的反應條件同上，在此不再贅述。

當q不為cl，而是選自以下任一時：

其中，x、y各自取1～12的正整數。

所述制備方法還包括：

對化合物4、6或7中，a、g之間的c原子連接的cl原子進行取代反應的步驟。

即反應路線如下：

具體包括以下步驟：

a)將化合物1和化合物2在水體系中反應，得到化合物3；

b)將化合物19與kq在混合溶劑中反應，得到化合物20；

c)在堿的作用下，化合物3與化合物20在混合溶劑中反應，得到化合物22；

d)將化合物22溶于合適溶劑中，在堿作用下，與化合物21發生反應，得到化合物23。

或者反應路線如下：

具體包括以下步驟：

a)將化合物1和化合物2在水體系中反應，得到化合物3；

b)化合物3與化合物24在混合溶劑中反應，得到化合物25；

c)化合物25與kq在合適溶劑中反應，得到化合物26；

d)在堿作用下，化合物26與27在混合溶劑中反應得到化合物28。

或者反應路線如下：

具體包括以下步驟：

a)將化合物1和化合物2在水體系中反應，得到化合物3；

b)化合物3與化合物29在混合溶劑中反應，得到化合物30；

c)在堿作用下，化合物30與31在混合溶劑中反應得到化合物32；

d)化合物32與kq在合適溶劑中反應，得到化合物33。

上述kq，可以根據q的不同，而自行選擇，在本發明的某些具體實施例中：

當q為時，kq為nh4oh；

當q為時，kq為nan3；

當q為時，kq為naoh；

當q為時，kq為kscn；

當q為時，kq為nacn；

當q為時，kq為na2s；

當q為時，kq為nh2nh2；

當q為咪唑基時，kq為咪唑。

所述取代反應的溫度是本領域技術人員所公知的，優選溫度為0～100℃。所述反應的溶劑為本領域技術人員所公知的，優選為水/乙腈、水/丙酮、水/四氫呋喃、水/二氧六環等混合溶劑。

本發明還提供了上述化合物或上述制備方法制備的化合物在制備抗菌劑中的應用。

所述抗菌劑優選為抗革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌，在本發明的某些具體實施例中，所述抗菌為抗金黃色葡萄球菌、耐藥性金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、耐藥性屎腸球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌中的任意一種或幾種。

上述應用可以為日化領域，作為抗菌添加劑，由于此類小分子合成方法簡單，成本低，抗菌效果好，可以作為抗菌添加劑用于各類衛生護理用品，有效阻斷多重耐藥細菌的傳播，從而預防多重耐藥細菌導致的感染性疾病。

或應用于畜牧業中，作為抗生素添加于獸藥中。

本發明還提供了一種抗菌劑，包括上述化合物或上述制備方法制備的化合物。

本發明還提供了一種抗菌添加劑，包括上述化合物或上述制備方法制備的化合物，應用于日常化學用品中。

本發明還提供了一種獸藥，包括上述化合物或上述制備方法制備的化合物，作為抗生素應用于畜牧業中。

與現有技術相比，本發明提供了一類抑制多重耐藥菌的化合物，具有式ⅰ所示結構，或其藥學上可接受的鹽。本發明打破抗菌肽及其模擬物剛性的分子結構，提供了一類柔性非肽類抗菌肽模擬物，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有好的抗菌效果。具有高抗菌活性、低溶血活性和低毒性，水溶性和穩定性優良，原料廉價易得，合成路線短且成本低、合成條件易于控制等優勢，從而為設計抗菌藥物提供了一種新的思路，為應對全球性的多重耐藥細菌問題作出貢獻。

附圖說明

圖1為本發明實施例1制備的d6e1n3的核磁共振氫譜圖；

圖2為本發明實施例1制備的d6e1n3對常見革蘭氏陽性菌和格蘭氏陰性菌的抗菌效果；

圖3為本發明實施例1制備的d6e1n3對細胞的殺死效果。

具體實施方式

為了進一步說明本發明，下面結合實施例對本發明提供的抑制多重耐藥菌的化合物、其制備方法及應用進行詳細描述。

以下核磁共振譜(nmr)用brukeravance-400型核磁共振儀記錄，化學位移δ的單位為ppm。高分辨質譜圖用watersq–tofpermier型質譜儀記錄。極性較大化合物的分離提純用全自動制備色譜儀(iscocombiflashrf+)。柱層析用硅膠(200～300目)為青島海洋化工分廠生產，薄層層析硅膠板(hsgf254型)為煙臺江友硅膠開發有限公司生產。所用溶劑為分析純試劑。

實施例1化合物d6e1n3的制備(參照以下反應式)

步驟a：雙六甲基三胺(1.0804g,5mmol，1eq)和o-甲基異脲硫酸鹽(1.4825g,12.5mmol，2.4eq)溶解在h2o(7ml)中，50℃反應6h，反應完畢。放置于4℃冰箱，析出白色固體，過濾，依次用冰水、乙醇洗滌，干燥即得到化合物n,n-二(己基胍基)二甲胺(dig6)。

步驟b：三聚氯氰(2.05g，11mmol，2eq)溶于乙腈(25ml)中，冷卻至0℃，2,2'-氧雙(乙胺)(0.56ml，5.4mmol，1eq)和nahco3(1.83g,22mmol,4eq)依次加入上述溶液中，0℃反應2h，反應完畢。減壓旋蒸溶劑，用ch2cl2溶解，過濾掉不溶物，濾液用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，得到化合物2,2'-氧雙(乙胺)基-4,4',6,6'-四氯-1,1',3,3',5,5'-雙三嗪(ecl2)。

步驟c、d：化合物ecl2(210mg，0.53mmol，1eq)溶于乙腈(5ml)中，在冰水浴加入nan3(70mg，1.08mmol，2eq),室溫攪拌1h，然后加熱至35℃攪拌1h，用高效液相色譜跟蹤，原料已經轉化完全。向上述反應液中加入溶解了n,n-二(己基胍基)二甲胺(440mg，1.1mmol，2.1eq))和nahco3(180mg，2.2mmol，4eq)的水溶液，75℃反應3h，反應完畢。濃縮，用全自動制備色譜儀分離，減壓蒸除溶劑，經凍干獲得化合物d6e1n3。

將實施例1制備得到的化合物進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和高分辨率質譜表征，氫譜圖如圖1所示，其數據如下：

¹hnmr(400mhz,d2o):δ3.65-3.57(m,4h),3.54-3.37(m,12h),3.03(m,8h),1.60-1.38(m,16h),133-1.13(m,16h)。

¹³cnmr(100mhz,d2o):δ166.13,160.51,159.86,156.67,67.90,48.28,41.06,40.39,27.79,27.02,26.60,25.76,25.57。

hrms-esim/z(％):mfc38h74n28omw938.6600.[m+3h]³⁺calcdfor313.8940,found:313.8948.[m+2h]²⁺calcdfor470.3373,found:470.3378。

實施例2化合物d3e1n3的制備

除了3,3'-二氨基二丙基胺代替雙六甲基三胺以外，其余與實施例1相同。

¹hnmr(400mhz,d2o):δ3.60(m,12h),3.53(m,4h),3.12(m,8h),1.83(m,8h)。

¹³cnmr(100mhz,d2o):δ161.50,159.92,156.63,155.28,68.20,45.49,45.30,40.49,39.75,39.59,26.07,25.76。

hrms-esim/z(％):mfc26h50n28omw770.4722.[m+3h]³⁺calcdfor257.8314,found:257.8320.[m+2h]²⁺calcdfor386.2434,found:386.2438。

實施例3化合物d6e1nh2的制備

除了nh4oh代替nan3以外，其余與實施例1相同。

實施例4化合物d6e2n3的制備

除了二乙二醇代替2,2'-氧雙(乙胺)以外，其余與實施例1相同。

實施例5化合物d6e1scn的制備(參照以下反應式)

步驟a、b與制備化合物d6e1n3中的步驟a、b相同。

步驟c、d：化合物ecl2(210mg，0.53mmol，1eq)溶解在乙腈(5ml)中，依次加入n,n-二(己基胍基)二甲胺(435mg，1.07mmol，2eq))和nahco3(180mg，2.2mmol，4eq)的水溶液，室溫攪拌1h，然后加熱至40℃攪拌2h，用高效液相色譜跟蹤，原料已經轉化完全。向上述反應液中加入kscn(124mg，1.26mmol，2.4eq)85℃反應5h，反應完畢。濃縮，用全自動制備色譜儀分離，減壓蒸除溶劑，經凍干獲得化合物d6e1scn。

¹hnmr(400mhz):δ3.51(m,4h),3.30(m,12h),3.10(m,2h),2.96(m,8h),1.38(m,16h),1.16(m,16h)。

¹³cnmr(100mhz):δ161.50,159.92,156.63,155.28,68.20,45.49,45.30,40.49,39.75,39.59,26.07,25.76。

hrms-esim/z(％):mfc40h74n24os2mw970.5919.[m+4h]⁴⁺calcdfor243.6552,found:243.6570.[m+3h]³⁺calcdfor324.5379,found:324.5397.[m+2h]²⁺calcdfor486.3032,found:486.3051。

實施例6化合物d3e1n3的制備

除了3,3'-二氨基二丙基胺代替雙六甲基三胺以外，其余與實施例5相同。

實施例7柔性非肽類抗菌肽模擬物的抑菌實驗

下述實施例中的病原菌來自美國microbiologics公司的atcc標準菌株，其中，金黃色葡萄球菌(25923)、耐藥性金黃色葡萄球菌(baa-44)、屎腸球菌(35667)、耐藥性屎腸球菌(baa-2320)、大腸桿菌(25922)、銅綠假單胞菌(baa-2110)。

最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)為檢測不到細菌生長的孔和與之相鄰的有細菌生長孔樣品濃度之和的平均值作為樣品最小抑菌濃度。采用二倍稀釋法測定柔性非肽類抗菌肽模擬的抗菌活性，每組實驗設立3組平行實驗，具體方法如下：

細菌接種于tsa固體培養基上，37℃培養箱中倒置培養。待菌落長出后，用接種環挑取單克隆菌落轉接到tsb液體培養基中，37℃培養箱震蕩培養至對數生長期。在酶標儀上檢測菌落od600，根據1od600＝1×10⁹cfu/ml將菌落用液體tsb培養基稀釋至10⁶cfu/ml。

柔性抗菌肽模擬物預先配置成1.0mg/mlpbs溶液，抑菌實驗的濃度梯度設置為：0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/ml。在無菌培養管中預先分別加入1.0mltsb液體培養基，然后每個培養管中依次對應加入0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μl柔性抗菌肽模擬物溶液和1.0ml已稀釋好的菌液，混勻后于37℃緩慢震蕩培養16小時，用96孔板測定600nm處的光吸收值，并計算結果。結果如表1和表2所示。

表1柔性抗菌肽模擬物對金黃色葡萄球菌和耐藥性金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度

表2柔性抗菌肽模擬物d6e1n3對細菌的最低抑菌濃度

注：linozolid，ceftadime，vacomycin和polymyxinb作為對照藥物。

由檢測結果可知，柔性抗菌肽模擬物d6e1n3對所常見的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌顯示出極強的殺死作用(尤其是針對革蘭氏陽性細菌)，比如對金黃色葡萄球菌、耐藥性金黃色葡萄球菌、屎腸球菌和耐藥性屎腸球菌的μic值分別為0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml和0.4μg/ml，結果如圖2所示。

實施例8柔性非肽類抗菌肽模擬物d6e1n3的細胞毒性實驗

ic50為抑制50％細胞生長的濃度。選取293t細胞和a594細胞采用mtt方法進行細胞毒性實驗，具體方法如下：

常規培養293t細胞，采用dmem培養基加入10％的血清，37℃培養至對數期，胰酶消化，進行細胞計數，用dmem培養基稀釋至1×10⁵/ml，鋪96孔板，細胞密度為1×10⁴/孔，37℃培養12h。

a594細胞接種的方法相同。

將柔性非肽類抗菌肽模擬物用pbs配制成5mg/ml的母液，然后按照二倍稀釋法配制2倍濃度的柔性非肽類抗菌肽模擬物液(pbs配制)，濃度分別為10、20、40、80、160、320μg/ml，將配好的柔性非肽類抗菌肽模擬物液100μl加入到96孔板的小孔內，使與細胞作用的柔性非肽類抗菌肽模擬物濃度為5、10、20、40、80、160μg/ml，對照組為pbs，本實驗每個濃度的樣品重復6孔，至少3次完全獨立實驗。

將96孔板放置在37℃的培養箱內培養12h，然后將樣品孔中的液體用移液槍吸出，再加入預熱好的無色dmem培養基100μl，將預先配制好的5mg/mlmtt母液取出，每孔加入10μl，37℃避光處理4h，吸去上清液，加入150μldmso溶解，37℃震蕩20min至顯色，酶標儀495nm波長下測定吸光度，細胞存活率＝實驗組/對照組，計算ic50值。結果如圖3和表3所示。

表3柔性抗菌肽模擬物d6e1n3對細胞的毒性

注：a549是腺癌人類肺泡基底上皮細胞，屬于癌細胞系；293t是人源胚胎腎細胞，屬于正常細胞系。

實施例9柔性非肽類抗菌肽模擬物的溶血活性測定

利用柔性非肽類抗菌肽模擬物對紅細胞的溶血性來評價對正常哺乳動物細胞的殺傷作用。

采集新鮮的人血液，通過離心分析新鮮血液中的紅細胞，用0.9％的生理鹽水洗三次后用0.9％的生理鹽水重懸，將紅細胞分裝到96孔板中(100μl/孔)，加入100μl不同濃度的柔性非肽類抗菌肽模擬物溶液，另外部分孔作為100％溶血和0％的實驗對照組分別加入100ml0.1％的tritonx-100和0.9％的生理鹽水。輕微震蕩后于37℃水浴溫育1h，離心后，取上清液至新的96孔板中，使用酶標儀測定od540值。溶血活性的計算公式如下：

溶血活性＝[(od實驗組-od生理鹽水)/(odtritonx100-od生理鹽水)]×100％

最后計算得到柔性抗菌肽模擬物d6e1n3對人體紅細胞的ec50為100μg/ml。

以上試驗表明，柔性非肽類抗菌肽模擬物d6e1n3即使在100μg/ml的高濃度下也不會引起人血發生溶血現象，表明上述柔性非肽類抗菌肽模擬物具有作為藥物前體開發和利用的價值。

實施例10柔性非肽類抗菌肽模擬的小鼠毒性實驗

選取昆明小鼠作為研究對象，采取灌胃法(intragastricinjection)給藥方式。

將灌胃針連接在注射器上，吸入一定量的藥液。用左手固定小鼠，使其頭頸部充分伸直，右手拿起連有小鼠灌胃針的注射器，將針頭小心自口角插入口腔，順著上顎部插入咽部，順咽后壁輕輕往下推，灌胃針會順著食管滑入小鼠的胃內，用右手食指將針栓慢慢往下壓，將注射器中的藥液灌入小鼠的胃中。

操作時應避免灌胃針插入氣管。插入時遇有阻力應抽出再試，如錯插入氣管注藥時可立即死亡。

最終確定，通過灌胃給藥的半致死劑量ld50>300mg/kg，屬于低毒的范圍。

由上述實施例可知，本發明提供的柔性非肽類抗菌肽模擬物具有優良的抗菌效果以及低溶血活性和低毒性。

以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。