負調節Osteoprotegerin配體活性的方法

專利名稱：：負調節Osteoprotegerin配體活性的方法負調節Osteoprotegerin配體活性的方法本申請為申請日為1999年9月13日、申請號為99810872.3(國際申請號為PCT/DK99/00481)、發明名稱為"負調節Osteoprotegerin配體活性的方法"的發明專利申請的分案申請。發明領域本發明涉及對骨質疏松癥和其它以骨組織持續性減少為特征的疾病的治療和預防的改進。更明確地說，本發明提供了一種通過促使骨質疏松癥患者或處于患病危險的個體中抗Osteoprotegerin配體(OPGL)抗體的產生從而負調節OPGL的方法。本發明也提供了生產在此方法中有用的被修飾的OPGL的方法以及被修飾的OPGL。本發明也包括編碼被修飾的OPGL的核酸片段、摻入這些核酸片段的載體以及用其轉化的宿主細胞和細胞系。本發明還提供了一種在本發明的方法中有用的鑒定OPGL類似物的方法，以及一種包含被修飾的OPGL或包含編碼OPGL類似物的核酸的組合物。本發明背景骨質疏松癥是全世界范圍內主要的并且日益增長的健康問題。它影響到美國、歐洲和日本大約7500萬人民的健康。因此，在世界上的工業化國家中，它是最常見的全身性骨骼疾病。骨質疏松癥影響到四分之一的絕經后婦女和大多數老年人，其中包括相當數量的男性老年人。美國1500萬受骨質疏松癥影響的人在1984年全年花費在此疾病上的錢估計是3.8億美圓。以此外推，全世界范圍內花費在此疾病上的錢至少是20億美圓。骨質疏松癥是一種以低骨質和骨組織的細微結構退化、骨脆性增加并且易于骨折為特征的全身性骨疾病。盡管它影響到全身的骨骼，但以脊柱、腕骨和髖骨的骨折最為典型和最為普遍。隨年齡增長，發展成為骨質疏松的危險性增大，并且女性的危險性大于男性。其病因學似乎存在于發生在絕經后婦女和年齡較大的所有個體中的某種加速骨質的正常損失的機制中。骨質在人大約35歲時達到峰值。到達峰值后，由于在骨重塑中的不平衡，骨質隨年齡增長而下降。骨骼失去其礦物質和有機基質但仍保留其基本結構。骨包含一個由一系列蛋白和蛋白聚糖構成的礦物質化的細胞外基質部分；其基本成分是I型膠原蛋白。細胞外基質的外殼中的礦物質是羥基磷灰石(Ca3(P04)2Ca(OH)2)。骨在生長和發育過程中不停地塑造并且終生隨物理的和化學的信號而重塑。骨的生長、發育和保持是高度調節的過程，在細胞水平涉及骨形成細胞(成骨細胞)和骨再吸收細胞(破骨細胞)的協同調節。骨質的水平反映出骨形成和再吸收的平衡。成骨細胞起源于間充質干細胞并且在骨發育過程中、受到損傷后和終生發生的重塑中產生骨基質。破骨細胞從單核巨噬細胞系的造血前體細胞分化產生并且再吸收骨基質。成骨細胞和破骨細胞功能的不平衡導致以骨質增加(骨硬化病)和骨質減少(骨質疏松癥)為特征的骨骼異常。在突變小鼠中對骨硬化病的研究發現，在破骨細胞發育、成熟和/或活化中的遺傳缺損導致骨再吸收降低并且均造成嚴重的硬骨病(Marks,1989)。而且，至今對在生理性調節破骨細胞發育中起作用的可溶性因子知之甚少。但是，最近描述和鑒定了兩種參與此調節過程的蛋白質(Simonet等，1997;Lacey等，1998)。這兩種蛋白質是Osteoprotegerin和Osteoprotegerin酉己f本。Osteoprotegerin是腫瘤壞死因子受體家族中的一個新的、分泌性的成員。在體外，Osteoprotegerin以一種劑量依賴的方式阻斷破骨細胞的形成。表達Osteoprotegerin的轉基因小鼠顯示出骨密度的普遍增加(骨硬化病)同時伴隨破骨細胞的減少。給正常小鼠施與重組的Osteoprotegerin產生相似的效果，并且在大鼠中可保護卵巢切除相關的骨損失(Simonet等，1997)。此外，出生時正常的Osteoprotegerin缺陷鼠(基因敲除鼠)發展成為早期骨質疏松癥和動脈硬化(Bucay等，1998)。這些觀察結果強有力地指出Osteoprotegerin阻斷了破骨細胞-----最主要的如果不是唯一的骨再吸收細胞類型的話…-的分化，暗示它可以作為骨再吸收中的體液調節因子來起作用。Osteoprotegerin是WO97/23614的主題。據推測Osteoprotegerin可能通過與一個刺激破骨細胞發育的因子結合并且中和其活性而起作用，從而抑制了破骨細胞的成熟(Simonet等，1997)。Osteoprotegerin配體(OPGL)是存在于膜上和以可溶形式存在的細胞因子腫瘤壞死因子家族的新成員。OPGL與Osteoprotegerin結合，其結合親和性為4nM。在體外，在CSF-1存在的情況下，OPGL激活成熟的破骨細胞并且調節骨髓前體細胞形成破骨細胞。已經證明在CSF-1處理的骨髓中OPGL與破骨細胞前體細胞的表面結合。但是，這些造血細胞前體細胞上OPGL的受體尚不明確。在體內，重組的可溶性OPGL是骨再吸收的一種有效的誘導劑(Lacey等，1998)。對OPGL的描述OPGL是作為一個包含317個氨基酸殘基(人，見SEQIDNO:2)或316個氨基酸殘基(鼠，見SEQIDNO:4和6)的II型跨膜蛋白而合成的。對兩氨基酸序列的比較顯示在87%的同源位置發現了相同的氨基酸。在OPGL氨基酸序列的N端49位氨基酸殘基和69位氨基酸殘基之間推定的跨膜區之后包含一個短的胞質結構域。根據其與腫瘤壞死因子a的同源性，暗示OPGL的細胞外部分由兩個功能域組成一個是從70位氨基酸殘基延伸到157位氨基酸殘基的柄狀區域；和一個從158位氨基酸殘基延伸到C末端的活性配體部分。與OPGL關系最密切的蛋白質似乎是誘導凋亡的細胞因子TRAIL,它們之間相同的氨基酸殘基少于25%。最近在其它文獻中也克隆出了OPGL，并且分別叫做TRANCE(Wong等，1997，生物化學雜志，272:25190-25194)和RANKL(Anderson等，1997，自然，390:175-179)。此蛋白也被認為是破骨細胞分化因子。已經在大腸桿菌中表達和純化了幾種鼠源OPGL的N端缺失突變體。這些突變體分別由75-316，128-316，137-316和158-316位氨基酸殘基組成。根據圓二色性研究，三個最短的突變體具有相同的P折疊結構，并且都能與Osteoprotegerin結合。但更重要的是這三個突變體在體外分析中都是有活性的(Lacey等，1998)。對最短的突變體研究得最深入。與腫瘤壞死因子a類似，這個OPGL突變體在溶液中以三聚體的形式存在，并且當其與Osteoprotegerin—起孵育時形成3:3的復合體。研究發現其結合的親和性為4nM。這種突變體在體內誘導小鼠的血鈣離子顯著增高(高血,丐)。若同時施與Osteoprotegerin則顯著減輕了OPGL的這種高血鈣效應。OPGL的最長的突變體(75-316位氨基酸殘基)不與Osteoprotegerin結合并且它不具備任何生物學活性。在構建OPGL的N端缺失突變體時，并不知道其天然切割位點。在人成纖維細胞293中表達全長的OPGL導致產生了起始于鼠蛋白第139位氨基酸殘基或人蛋白同源的第140位氨基酸殘基的可溶性的OPGL。這些表達研究同時也顯示在人類細胞系中表達產生的可溶性OPGL是糖基化的。所以在鼠和人OPGL的C末端配體結構域含有三個潛在的N-糖基化位點并不另人'驚奇。我們并不知道血液中和組織中Oste叩rotegerin的濃度，但我們知道Oste叩rotegerin在濃度達到lng/ml時具有顯著的生物學活性。OPGL的生物學活性當與CSF-1結合時，OPGL是一種有效的破骨細胞分化因子。這兩種組分的任何之一單獨都不能誘導前體細胞分化成為破骨細胞OPGL是成熟的破骨細胞的一種有效的激活劑。在只有OPGL存在的情況下，OPGL就可以激活成熟的破骨細胞進行骨的再吸收。在這些實驗中，并未觀察到OPGL以破骨細胞生長因子或破骨細胞存活因子的方式起作用。由于鼠OPGL在人外周血單核細胞培養中也可以誘導破骨細胞形成，所以OPGL的作用似乎無物種限制性。本發明目的本發明的目的是對以骨再吸收過度為特征的癥狀如骨質疏松等提供新的治療手段。本發明更進一步的目的是開發抗OPGL的自身疫苗，以獲得一種對骨質疏松癥和其它涉及骨再吸收過度的病理性異常的新的治療方法。本發明概述我們發現上述的數據暗示了OPGL的一種病理生理學的作用。體內的證據是不完全的或是間接的，但在我們的觀點中它是令人信服的，尤其是結合直接證據的情況下。我們認為對小鼠注射重組的OPGL的C末端導致了嚴重的高轉血癥的觀測結果直接指出了其病理生理學的作用。間接證據來自出生時正常但隨后發展為骨質疏松癥的Osteoprotegerin缺陷鼠(基因敲除鼠)。這表明除去一個與OPGL結合并中和其效應的蛋白質導致了骨質疏松。我們得出結論認為其最可能的原因是由于OPGL引起的破骨細胞成熟和活化的增加。其它兩件間接證據是Osteopmtegerin轉基因小鼠和注射Osteoprotegerin的小鼠都發展成為骨質疏松癥。這表明一個結合OPGL并中和其效應的非天然的、高水平的蛋白質導致了骨質疏松。我們得出結論認為其原因是由于OPGL的中和引起破骨細胞的成熟和活化的降低。因此我們提出一種模型，在此模型中OPGL和Osteoprotegerin分別作為破骨細胞發育的正和負調節因子起作用。換一句話說，OPGL促進骨再吸收而Osteoprotegerin抑制骨再吸收。所以，在骨質疏松中OPGL可被認為是一種促進骨再吸收并最終導致骨質疏松的"致病因子"，同樣Oste叩rotegerin可被視為通過中和其活性而抗"致病因子"的"治療劑"。因此，我們提出通過在體內產生能中和OPGL的抗體來負調節破骨細胞分化/成熟/形成和破骨細胞的激活，從而提供了一種安全有效的治療/緩解和/或預防骨質疏松和其它以骨形成速度大于骨再吸收速度為特征的疾病的方法。因而，從其最寬廣的和最普通的范圍來說，本發明涉及一種在動物—-包括人一-體內負調節Osteoprotegerin配體(OPGL)活性的方法，這種方法包含以免疫學有效量向動物的免疫系統呈遞以下物質……至少一種已被配制的OPGL多肽或其亞序列，從而用此OPGL多肽或其亞序列免疫動物誘導抗OPGL多肽抗體的產生，和/或，……至少一種在OPGL多肽上引入修飾的OPGL類似物，從而用此免疫動物可誘導抗OPGL多肽抗體的產生。與涉及頻繁(例如每天)施與Osteoprotegerin或與OPGL類似物具有結合親和性的分子的方法相比，本發明方法最具吸引力的特征是例如通過階段性的但不很頻繁的免疫可控制骨質疏松。預期每年注射免疫原成分1至4次將會足以獲得所需效果，然而若施與Osteoprotegerin或OPGL活性的其它抑制劑則需每天給藥。本發明也涉及OPGL類似物以及編碼這些類似物的核酸片段。包含類似物或核酸片段的免疫原性組合物也是本發明的一部分。最后，本發明涉及一種治療骨質疏松癥和以骨再吸收過度為特征的疾病的方法，其中施與一種可阻斷OPGL與其在破骨細胞上的受體相互作用的非OPGL分子(典型的是抗體)。本發明的詳細描述定義為闡明本發明的邊界和范圍，下面將詳細定義和解釋在本說明書和權利要求書中用到的一些術語。術語"T淋巴細胞"和"T細胞"可互換使用指來源于胸腺的淋巴細胞，它們在體液免疫應答中負責各種細胞介導的免疫應答和輔助細胞活性。同樣，"B淋巴細胞"和"B細胞"可互換使用指產生抗體的淋巴細胞。術語"OPGL多肽"在此表示具有上面所討論的人或鼠OPGL蛋白質氨基酸序列的多肽(或與完整的OPGL共享大部分B細胞表位的截短的部分)，而且此術語也包含與分離自其它物種的這兩種蛋白質的類似物具有相同的氨基酸序列的多肽。使用如酵母或其他非哺乳動物真核表達系統具有不同的糖基化特征的形式和在原核系統中制備的非糖基化的OPGL形式也在本術語包括的范圍之內。但是，當使用術語"一個OPGL多肽"時，其意思是當呈遞給待治療的動物時，該多肽通常是非免疫原性的。換句話說，此OPGL是一種自身蛋白或是一個通常情況下不引起動物產生抗OPGL免疫應答的自身蛋白的類似物。術語"OPGL的類似物"是一種已經改變其一級結構的OPGL多肽。這種改變可以是例如一種OPGL多肽與一適合的融合配偶體融合的形式(即初級結構的改變專門涉及在C和/或N末端添加氨基酸殘基)和/或在OPGL多肽的氨基酸序列中插入和域缺失和/或取代的形式。本術語也包含OPGL衍生的分子，見下面對OPGL修飾的討論。需注意的是在人體內作為疫苗使用人OPGL的異種類似物(例如狗或豬的類似物)可以想象其可產生預期的抗OPGL的免疫應答。這種應用異種類似物的免疫也是本發明的一部分。術語"多肽"在本文中指2至10個氨基酸殘基的短肽，從11到100個氨基酸殘基的寡肽和大于100個氨基酸殘基的多肽。而且，本術語也包括蛋白質，即包含至少一個多肽的功能性的生物分子；當包含至少兩種多肽時，它們可能形成共價連接或非共價連接的復合物。蛋白質中的多肽可被糖基化和/或脂質化和/或包含輔基。術語"亞序列"指任何直接衍生于天然發生的OPGL的氨基酸序列或核酸序列的至少3個氨基酸或至少3個核苷酸的一段連續序列。術語"動物"在本文中普遍表示一種動物物種(優選哺乳動物)，例Hcwosop/e附，Cam'scfowe^ciw等，并且不僅僅指一個動物。但是，本術語也表示某一動物物種的一個群體，因為考慮到使用同樣的免疫原來免疫動物根據本發明的方法被免疫個體都完全懷有同一種OPGL非常重要。例如，如果在不同群體中存在OPGL的遺傳突變體，為了在每一群體中打破對OPGL的自身耐受，就很有必要在不同的群體中使用不同的免疫原。本領域熟練技術人員都很清楚地知道本文中的動物是一個具有免疫系統的生命體。此動物優選是脊椎動物如哺乳動物。術語"體內負調節OPGL活性"在此指在活的生物體中降低OPGL與其(未知)受體(或OPGL和其他可能的生物學上很重要的結合此分子的配偶體)之間的相互作用。可以通過幾種原理獲得負調節在這些原理當中，使用抗體結合OPGL的活性位點是最簡單的。但是，由于抗體結合而導致的游走細胞(例如巨噬細胞和其他吞噬細胞)去除OPGL也在本發明的范圍之內。"向免疫系統呈遞..."意指動物的免疫系統以一種可以控制的方式受到免疫原的攻擊。正如將要在下文中出現的一樣，有很多方法可以實現這種對免疫系統的攻擊，在這些方法中最重要的是使用含多肽的"藥物疫苗"(一種接種后可以治療或緩解進行中的疾病的疫苗)接種或核酸"藥物疫苗"接種。對于本發明中的創造性的想法，所要達到的最重要的結果是免疫感受態細胞以一種免疫學有效的方式對抗抗原，但是，達到此效果的精確方式不很重要。術語"免疫學有效量"具有其在本領域中的普遍含義，即能夠誘導免疫應答并能和與此免疫原共享免疫學特征的致病因子明顯地作用的一定數量的免疫原。表達法OPGL已被"修飾"在此指對構成OPGL骨架的多肽的化學改變。這種修飾可以是例如衍生化(如烷基化)OPGL序列中的某些氨基酸殘基，但是正如將要在下文中所描述的那樣，優選的修飾包含對OPGL氨基酸序列一級結構的改變。在討論到"對OPGL的自身耐受"時，可以理解為既然OPGL在待免疫的群體中是一種自身蛋白，此群體中的正常個體并不產生抗OPGL的免疫應答。但并不能排除在一動物群體內某一偶然的個體可以產生抗自身OPGL的抗體，例如作為自身免疫紊亂的一部分。在任何情況下，一個動物通常只對其自身的OPGL自身耐受，但這并不能排除此動物對來自其他物種動物或來自具有不同OPGL表型的另一群體動物的OPGL類似物也產生耐受。術語"外源T細胞表位"(或"外源T淋巴細胞表位")是一個能在動物物種中結合MHC分子并能剌激T細胞的肽。本發明優選的外源T細胞表位是"混棲"表位，即在一動物物種或群體中能夠結合大部分的某一特定類別MHC分子的表位。目前僅知道非常有限的這種混棲T細胞表位，下面將會詳細討論它們。必須注意的是為了能夠盡可能讓本發明所用的免疫原在大部分的動物群體中有效，它必須(1)在同一OPGL類似物中插入幾個外源的T細胞表位，或(2)制備幾種OPGL類似物，每種類似物中插入不同的混棲表位。還必須注意的是外源T細胞表位的概念也包含使用隱藏的T細胞表位，即來自一自身蛋白并且只有在單獨存在而不是自身蛋白一部分之時才表現免疫學行為的表位。術語"外源T輔助淋巴細胞表位"(外源的Th表位)是一個與MHCII類分子結合并能與MHCII類分子一起被呈遞在抗原呈遞細胞(APC)表面的外源T細胞表位。(生物)分子的"功能性部分"在本文中指至少負責由此分子發揮的生物化學的或生理學效應之一的分子部分。在本領域眾所周知的是，許多酶和其他效應分子都具有一個負責由此分子發揮的效應的活性位點。此分子的其他部分可能起增加穩定性或可溶性的作用，并且如果這些作用與本發明的某一實施方案無關的話，可以舍棄這些部分。例如在OPGL中可能利用某種細胞因子作為修飾部分(見下面的詳細討論)，并且在此種情形下，既然與OPGL的偶聯提供了必需的穩定性，穩定性問題就無關緊要了。術語"佐劑"具有其在疫苗
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的普遍含義，即一種物質或其某一種成分，它(1)自身不能產生抗疫苗免疫原的特異的免疫應答，但是它(2)可以增強抗免疫原的免疫應答。或者，換句話說，僅僅用佐劑免疫不能引起針對免疫原的免疫應答，用免疫原免疫或許可以或許不能增加抗免疫原的免疫應答，但免疫原和佐劑組合使用所引起的抗免疫原的免疫應答比僅用免疫原所引起的免疫應答要強的多。分子"導向"在本文中指一個分子一旦被引入動物就會優先出現在某些組織或優先與某些細胞或細胞類型有關的情況。通過許多方式可以達到這種效果，包括將此分子形成組合物促進"導向"或在分子引入促進"導向"的基團。下面將會很詳細地討論這個問題。術語"刺激免疫系統"指某一物質或組合物顯示出一種普遍的、非特異性的免疫刺激效應。許多佐劑和推定的佐劑(如某些細胞因子)具有刺激免疫系統的能力。使用免疫剌激劑的結果是免疫系統的"警覺性"增加，意味著與單獨用免疫原免疫相比，同時或隨后用免疫原免疫誘導一個更為有效的免疫應答。對OPGL活性負調節的優選實施方案在本發明的方法中優選的用做免疫原的OPGL多肽是一個在OPGL氨基酸序列上至少存在一個改變的被修飾的分子，因為那種方式大大促進了獲得非常重要的破壞針對OPGL的自身耐受的機會。應該注意的是這并不排除在配制品中使用這種進一步促進了破壞針對OPGL的自身耐受的被修飾的OPGL的可能，例如包含佐劑的配制品。已經報道(Daluml等,1996，免疫學雜志，157:4796-4804)在正常個體中生理性地存在潛在的自身反應性的B淋巴細胞識別的自身蛋白。但是，為了誘導這些B淋巴細胞通常產生的與相關的自身蛋白反應的抗體，需要產生細胞因子的T輔助淋巴細胞的幫助(Th細胞或TH淋巴細胞)。由于T淋巴細胞通常情況下并不識別來自自身蛋白的由抗原呈遞細胞(APCs)所呈遞的T細胞表位，所以正常情況下T淋巴細胞并不提供這種幫助。但是，通過在自身蛋白內提供一個"外源"成分(即通過引入一個免疫學上顯著的修飾)，一旦識別APC細胞(例如，首先，單核細胞)表面的外源表位，識別外源成分的T細胞就被激活。能夠識別經修飾的自身蛋白上的自身表位的多克隆B淋巴細胞(也是APCs)也攝入抗原并隨后呈遞其外源T細胞表位，激活的T淋巴細胞隨后提供細胞因子幫助這些自身反應性的多克隆B淋巴細胞。由于由這些多克隆B淋巴細胞所產生的抗體可以與被修飾的多肽上不同的表位包括那些呈現在天然多肽上的表位反應，從而誘導產生了可以與非修飾的自身蛋白交叉反應的抗體。總之，T淋巴細胞可被引導正如多克隆B淋巴細胞已經識別完全的外源抗原一樣作用，而實際上僅僅插入的表位對宿主來說是外源的。通過這種方式，誘導產生了能與未經修飾的自身抗原交叉反應的抗體。本領域已經知道幾種為打破自身耐受而對自身抗原肽進行修飾的方法。根據本發明，對修飾總結為—…引入了至少一個外源的T輔助淋巴細胞表位(Th表位)，和域_——引入了至少一個實現被修飾的分子定向至抗原呈遞細胞(APC)或B淋巴細胞的第一部分，和/或……引入了至少一個能刺激免疫系統的第二部分，和/或_一…引入了至少一個能優化被修飾的OPGL多肽呈遞給免疫系統的第三部分。但是，由于B淋巴細胞對天然分子的識別因此而加強了，在引入這些修飾的同時應保持OPGL中大多數的原始B淋巴細胞表位不變。在一個優選的實施方案中，共價或非共價引入側基團(以外源T細胞表位或以上提到的第一、二和三部分的方式)。這意味著在未改變氨基酸序列一級結構的情況下從OPGL衍生出一段氨基酸殘基，或至少未引入鏈中各氨基酸之間肽鍵的改變。另一個優選的實施方案利用氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加(可通過重組的方式或肽合成的方式生效；涉及長氨基酸片段的修飾使用融合多肽)。本實施方案的一個特別優選的方案是在WO95/05849中描述的技術。此技術包含一種通過使用一些氨基酸序列已經被用相應數量的包含一外源免疫優勢T細胞表位的氨基酸序列取代的自身蛋白的類似物免疫來負調節自身蛋白的方法，與此同時維持類似物中自身蛋白的總體三級結構不變。就本發明的目的，如果修飾(插入、添加、缺失或取代)產生一外源的T細胞表位并且同時在OPGL中保持顯著數量的B細胞表位就足夠了。但是，為了獲得所誘導的免疫應答的最大效率，最好在被修飾的分子中維持OPGL的總體三級結構不變。下面的公式描述了本發明普遍涵括的OPGL構建物(MOD^(OPGLe0m(MOD2)s2(OPGLe2)n2……(MODx)sx(OPGLex)nx(I)其中OPGLel-OPGLex是含有OPGL亞序列的x個相同或不相同并且包含或不包含外源側鏈基團的B細胞表位，x是一個大于等于3的整數，nl-nx是x個大于等于0的整數(至少一個大于等于1)。MOD,-MODx是在保存的B細胞表位間引入的x個修飾，sl-sx是x個大于等于0的整數(如果在OPGLe序列中沒有引入側鏈基團則至少有一個大于等于1)。因此，給定對構建物的免疫原性的總的功能性限制，本發明允許原始OPGL序列的所有各種排列，以及其中的所有種類的修飾。因此，包括在本發明中的是通過忽略在體內起反作用的OPGL的部分序列或通過忽略部分正常情況下位于胞內并且可能因此引起預料不到的免疫學反應的序列而獲得的被修飾的OPGL。可以有幾種方法保持大部分的B細胞表位或甚至是在此描述的易于被修飾的蛋白的總體三級結構不變。一種方法是制備針對OPGL的多克隆抗血清(例如在兔中制備的抗血清)，并且此后使用此種抗血清作為抗所產生的被修飾蛋白的測試試劑(如，在競爭性ELISA中)。與抗血清反應的程度和OPGL相似的被修飾的模本(類似物)則被認為是具有與OPGL相同的總體三級結構；而與抗血清顯示出有限的(但仍然顯著的和特異的)反應性的類似物被認為是保持了原始B細胞表位的大部分。另外，可以選擇制備可與OPGL上相同的表位反應的單克隆抗體并且用于一系列測試。這種方法的優點是給予了(1)OPGL的表位圖譜，和(2)在制備的類似物中保持的表位圖譜。當然，第三種方法可以解決OPGL或其生物活性截短部分的三維結構(見上)，并且將其與已經解決了三維結構的所制備的類似物的三維結構比較。在X—射線衍射研究和NMR光譜學的幫助下，可以解決其三維結構。為了提供給定分子的有用的三級結構信息，其他有關三級結構的信息在一定程度上可以從具有僅需要純度較高的多肽的優點的圓二色性研究中獲得(而X射線衍射需要晶體化的多肽并且NMR需要多肽的同位素突變體)。但是，由于圓二色性研究只能憑借其二級結構的信息提供關于正確的三維結構的間接的信息，最終結論仍需要用X射線衍射和/或NMR法獲得。本發明的一個優選實施方案使用OPGL上B淋巴細胞表位的多重呈遞(即公式I中，一個B細胞表位至少出現在兩個位置上)。可以通過各種不同的方法達到此效果，例如，通過簡單制備包含(OPGL)m結構的融合肽，其中m是一個大于等于2的整數，然后至少在OPGL序列之一上引入在此所討論的修飾。引入的修飾最好包括B淋巴細胞表位的至少一個重復和/或引入半抗原。正如上面所提到的，通過引入至少一個氨基酸的插入、添加、缺失或取代來完成一個外源T細胞表位的引入。當然，通常情況下在氨基酸序列上引入的改變不止一個(例如通過一個完整的T細胞表位的插入或取代)，但OPGL類似物才是所要達到的重要目標，當被抗原呈遞細胞(APC)處理時，將會產生這樣一個與MHCII類分子結合共同呈遞在APC細胞表面的外源優勢免疫表位。因此，如果OPGL的氨基酸序列的合適位置包含許多也可在外源Th表位中發現的氨基酸殘基，那么通過氨基酸插入、添加、缺失和取代的方法保留外源表位的氨基酸，從而引入外源Th表位。換句話說，就本發明的目的而言，并不需要通過插入或取代引入全長的Th表位。插入、缺失、取代或添加的優選的氨基酸數目至少是2，例如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20和25個插入、取代、添加或缺失。而且插入、取代、添加或缺失的氨基酸數目最好不超過150，例如最多100，最多90，最多80和最多70。尤其優選的是插入、缺失或添加的氨基酸數目不超過60，并在某些特別的情況下不超過50或甚至是40。最優選的情況是不超過30。關于氨基酸添加應該注意的是，當產生的構建物采取融合多肽的形式時，通常認為其氨基酸數目大于150。本發明的優選實施方案包括通過引入至少一個外源優勢免疫T細胞表位而造成的修飾。將認識到一個T細胞表位的免疫優勢取決于所討論的動物物種。正如在此所用的，術語"免疫優勢"僅指在被接種的個體/群體中產生明顯的免疫應答的表位，但眾所周知的事實是在一個個體/群體中占免疫優勢的T細胞表位在同一物種的另一個體中就未必是免疫優勢的，盡管在后者中它可以與MHCII類分子結合。因此，就本發明的目的而言，一個優勢免疫T細胞表位是當呈現在抗原上時能有效提供T細胞輔助的T細胞表位。較為典型的是，優勢免疫T細胞表位具有總是被呈遞結合在MHCII類分子上的內在特征，不管其所處的多肽如何。另外很重要的一點是T細胞表位的MHC限制性。通常情況下，自然發生的T細胞表位是MHC限制性的，即組成T細胞表位的某一多肽只與MHCII類分子的某一亞群有效結合。這又具有這樣的效果，在大多數情況下使用一個特異的T細胞表位會導致一種疫苗組合物只在一部分群體中有效，根據那部分群體的大小，有必要在同一分子中包含更多的T細胞表位，或另外制備一個多成分的疫苗，其中的組分是憑借所引入的T細胞表位的性質來區分彼此的OPGL突變體。如果對所用的T細胞的MHC限制性一無所知(例如在對被接種的動物的MHC組成不甚明了的情況下)，通過下列的公式可決定一個特異性疫苗組合物能覆蓋的群體比例/群體^-f[(1-A)(n)其中Pi指對呈現在疫苗組合物中的第產個外源T細胞表位的應答者占群體的頻率，n是疫苗組合物中外源T細胞表位的總數。因此，一個含有3個在群體中應答頻率分別是0.8，0.7，0.6的外源T細胞表位的疫苗組合物，會得出1一0.2X0.3X0.4=0.976即97.6。/。的群體在統計學上會對此疫苗產生MHCII類分子介導的應答。上面的公式并不適用于對所使用的肽的MHC限制性模式有或多或少精確了解的情況。例如，如果某一肽只與由HLA-DR等位基因DR1，DR3，DR5和DR7編碼的人MHCII類分子結合，那么將此肽與另一個可與由剩下的HLA-DR等位基因編碼的MHCII類分子結合的肽混合使用足可以達到討論的群體100%的覆蓋率。如果將應答群體的計算僅僅以疫苗中的T細胞表位的MHC限制性為基礎，憑借下列公式可決定由某一特異疫苗組合物所覆蓋的群體比例/群體二卜rt(1—A)2(111)其中9j是編碼MHC分子的可與疫苗中的任何一個T細胞表位結合并且屬于第f個已知的3個HLA的部位(DP，DR禾BDQ)等位基因單倍型在群體中的頻率之和。在實際應用中，應首先確定哪個MHC分子可識別疫苗中的每一個T細胞表位并且隨后根據類型將它們列出(DP，DR禾BDQ)。然后，對每一種類型來說，列出來的不同等位基因單倍型的個體頻率被相加，因此產生了(RLcp2和(p3。可能發生公式中A值超過相應的M理論值的情況&=1-fl(1-v/》2(IV)其中巧.是編碼MHC分子的可與疫苗中的第產個T細胞表位結合并且屬于第/個已知的3個HLA的部位(DP，DR和DQ)等位基因單倍型在群體中的頻率之和。這意味著在l-M的群體中應答者的頻率為/剩余尸(Al-O因此，調整公式III就產生了公式V:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>(V)其中，如果陰性的話，1-/"的值設為0。必須注意的是公式v要求相同的單倍型群所有的表位都作出單倍型圖譜。因此，在選擇引入OPGL類似物中的T細胞表位時，將這些表位的現有的所有知識包括在內非常重要1)群體對每一表位的應答頻率，2)MHC限制性數據，禾B3)相關的單倍型在群體中的頻率。在一動物物種或動物群體的大部分個體中存在許多有活性的、自然發生的"混棲"T細胞表位，并且這些"混棲"T細胞表位被優選引入，籍此降低在同一疫苗中使用很大數量的不同的OPGL類似物的根據本發明，混棲表位可能是一自然發生的人類T細胞表位，例如來自破傷風類毒素(如P2和P30表位)、白喉類毒素、流感病毒血凝素(HA)和惡性疾原蟲CS抗原的表位。過去數年中，也己經闡明了許多其他的混棲T細胞表位。特別是可與大部分的由已經闡明的不同HLA-DR等位基因編碼的HLA-DR分子結合的多肽，并且根據本發明在所使用的類似物中這些都是可能被引入的T細胞表位。見下列參考文獻所討論的表位，在此參考文獻都并入文中W098/23635(FrazerIH等，轉讓給昆士蘭大學)；SouthwoodS等，1998，免疫學雜志，160:3363-3373;SinigagliaF等,1998，自然，336:778-780;Chicz腹等，1993，實驗醫學雜志，178:27-47;HammerJ等，1993，細胞，74:197-203;和FalkK等，1994，免疫遺傳學39:230-242。后一參考文獻還涉及到HLA-DR和HLA-DP配體。在這5篇參考文獻中所列出的所有表位都是被用于本發明的相關的天然候選表位，和與這些表位共享普通基序的表位一樣。另外，表位也可以是任何可以與大部分的MHCII類分子結合的人工T細胞表位。根據本發明，本文中在WO95/07707和AlexanderJ等，1994，免疫1:751-761相應文章中所描述的泛DR表位肽('PADRE')(在此參考文獻都并入文中)都是待用的非常令人感興趣的候選表位。應該注意的是，為了在施與疫苗時增加穩定性，這些文章中所公開的最有效的PADRE肽的C和N末端都帶有D氨基酸。但是，本發明的基本目標在于將相關表位合并作為被修飾的OPGL分子的一部分，此OPGL隨后在APC細胞的溶酶體胞中被酶降解掉以便隨后呈遞在MHCII類分子上，因此在本發明所用的表位中摻入D一氨基酸是不利的。一個特別優選的PADRE肽是具有AKFVAAWTLKAAA氨基酸序列或其免疫學有效亞序列的肽。這個以及其他同樣缺乏MHC限制性的表位是優選的應該存在于本發明方法中所用的OPGL類似物中的T細胞表位。這個超混棲表位將解釋本發明中最簡單的實施方案，其中僅單一的OPGL被呈遞給被接種動物的免疫系統。如上所述，對OPGL的修飾也可包括引入使修飾后的OPGL定向至APC或B淋巴細胞的第一部分。例如，第一部分可以是B淋巴細胞特異性的表面抗原或APC特異性表面抗原的一個特異的結合配偶體。本領域已經知道很多這樣的特異的表面抗原。例如，這個部分可以是在B淋巴細胞或APC細胞上有受體的碳水化合物(如甘露或甘露糖)。另外，第二部分可以是半抗原。可特異性識別APCs或淋巴細胞表面分子的抗體片段也可被用做第一部分(表面分子可以是例如巨噬細胞或單核細胞的Fcy受體，如FcyRI或，另外其他任何特異的表面標志如CD40和CTLA-4)。應該注意的是，所有這些可仿效的定向分子也可被用做佐劑的一部分，見下。為了獲得增強的免疫應答，作為將修飾的OPGL多肽定位至某一類型細胞的替代或補充方法，可能憑借將上面所提到的刺激免疫系統的第二部分包括在內來提高應答水平。這樣的第二部分的典型例子是細胞因子和熱休克蛋白或分子伴侶以及其有效部分。根據本發明待用的合適的細胞因子通常情況下也可作為疫苗組合物的佐劑起作用，即例如Y干擾素(IFN-Y),白細胞介素l(IL-1)，白細胞介素2(IL-2)，白細胞介素4(IL-4)，白細胞介素6(IL-6)，白細胞介素12(IL-12)，白細胞介素13(IL-13)，白細胞介素15CIL-15)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);另外細胞因子分子的功能性部分也足以用做第二部分。關于將這些細胞因子用做佐劑物質，見下面的討論。根據本發明，適于用做第二部分的合適的熱休克蛋白或分子伴侶有HSP70，HSP90，HSC70，GRP94(也稱做gp96，見WearchPA等，1998，生物化學37:5709-19)和CRT(鈣網蛋白).另外，第二部分也可以是一種毒素，例如李斯特氏菌毒素(LLO)、脂質體A和熱穩定的內毒素。一些細菌衍生物如MDP(胞壁二肽)、CFA(完全弗氏佐劑)和海藻糖雙酯TDM和TDE也是有趣的可能用做第二部分的物質。引入一個可以增加被修飾的OPGL呈遞給免疫系統的第三部分也是本發明的一個重要的實施方案。本
技術領域：
已經出現了幾個這種原理的實施例。例如，據我們所知，在布氏疏螺旋體蛋白OspA上的棕櫚酰基脂質化錨蛋白可被利用以提供自身佐劑多肽(見，例WO96/40718)---似乎脂質化的蛋白帶有一個由多肽的脂質化錨部分組成的核心，分子的剩余部分從其中突出從而形成一個膠囊樣的結構，導致對抗原決定簇的多重呈遞。因此，使用這種以及相關利用脂質化錨的方法(例如，肉豆蔻基，法呢基，香葉基-香葉基，GPI錨和N—酰基甘油二酯基)是本發明的優選實施方案，特別是因為在重組產生的蛋白質中提供這種脂質化錨很直接并且僅僅需要使用如自然發生的信號肽序列作為被修飾的OPGL多肽的融合配偶體。另外一種可能是使用補體成分C3的C3d片段或C3本身(見Dempsey等，1996，自然271:348-350和Lou&Kohler，1998，自然生物工程16:458-462)。本發明的另外一個也可導致向免疫系統呈遞多重拷貝的OPGL的重要表位區的(例如，至少是兩個)實施方案是將OPGL亞序列或其突變體與另一個分子偶聯在一起。例如，可以使用多聚體，例如碳水化合物如葡聚糖，見如LeesA等，1994，疫苗12:1160-1166;LeesA等，1990，免疫學雜志145:3594-3600。而且甘露和甘露糖也是有用的替代物。從如大腸桿菌和其他細菌來源的完整的膜蛋白也可是有用的結合配偶體，傳統的載體分子例如KLH，破傷風類毒素，白喉類毒素和BSA也是優選的有用的結合配偶體。原始的OPGL的某些區域似乎很適于進行修飾。由于OPGL與TNF-a和腫瘤壞死因子家族其他成員的結構關系，所以預測在170-192，198-218，221-246，256-261，或285-316位置(氨基酸序列號SEQIDNos:4，6和12)引入T細胞表位或其他修飾很有可能產生預期效果。這些位置指鼠的OPGL--在人OPGL分子上相應的位置是171-193,199-219，229-247，257-262，或286-317位置(氨基酸序列號SEQIDNo:2)。這些選定的區域考慮到以下幾點1)保存已知的和預測的B細胞表位，2)保持三級結構等。如上所述，無論如何，對已經在不同位置引入T細胞表位的一系列被修飾的OPGL分子進行篩選是非常容易的。既然本發明的最優選的實施方案包括負調節人OPGL，因此上面所討論的OPGL多肽優選是人OPGL多肽，在本實施方案中，特別優選的多肽是已經通過用等長的或不等長的并且含有一個外源Th表位的至少一個氨基酸序列取代在SEQIDNO:2中的至少一個氨基酸序列(或在SEQIDNO:2的一個多肽中221位的半胱氨酸被絲氨酸取代)而被修飾的人OPGL多肽。被取代的氨基酸殘基選自SEQIDNO:2中257-262，289-303和222-243位氨基酸殘基。在實施例中詳細討論了隱藏在這些構建物后的基本原理。OPGL和被修飾的OPGL多肽的配制當憑借向動物施與疫苗的方式來實現將OPGL多肽或被修飾的OPGL多肽呈遞給動物免疫系統時，多肽的配制遵循本
技術領域：
普遍認可的基本原理。制備含有肽序列作為活性成分的疫苗是本
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所普遍熟知的，正如在美國專利4608251，460湧3，4599231，4599230，4596792和4578770中舉例說明的那樣。在此參考文獻都并入文中。典型的是，這些疫苗被制備為可注射的溶液或懸液形式，也可制備為注射前適于溶于或懸浮于液體中的固體形式，制備物可被乳化。活性的免疫原成分常與藥物學上可接受的并與此活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑有，例如水，鹽，葡萄糖，甘油，酒精或其類似物以及它們的組合物。此外，如果需要的話，疫苗可以含有少量的輔助物質例如加濕劑或乳化劑，pH緩沖劑或增強這些疫苗效果的佐劑；見下面關于佐劑的詳細討論。通常用傳統的腸胃外的方式施與疫苗，例如通過皮下、皮內、真皮內、真皮下或肌肉注射。適于其他接種方式的另外的配制品包括栓劑和在一些情況下口服、經頰、舌下、腹膜內、陰道內、肛內、硬腦膜外、脊髓和顱內配制品。對于栓劑而言，粘合劑和載體可包括，例如聚乙二醇和甘油三酯；這些栓劑可形成自含有0.5%到10%，優選1-2%活性成分的混合物。口服劑型包括這些通常使用的賦形劑如制藥等級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖化鈉、纖維素、碳酸鎂及其類似物。這些組分采用溶液、懸液、藥片、藥丸、膠囊、緩釋配制品或粉末的形式并且含有10-95%，優選25-70%的活性成分。對于口服劑型而言，白喉毒素是一種非常令人感興趣的配制配偶體(并且也是一種可能的綴合配偶體)。多肽可能以中性或含鹽的形式被配制進疫苗之中。藥物學上可接受的鹽包括酸加合鹽(與肽的游離氨基形成)并且其由無機酸例如鹽酸或磷酸或諸如醋酸、草酸、酒石酸和苦杏仁酸及其類似物的有機酸形成。由游離羧基基團形成的鹽也可來自無機鹽如鈉、鉀、銨、鈣或氧化鐵和諸如異丙基胺、三甲胺、2-巰基乙醇、組氨酸、普魯卡因及其類似物的有機鹽。以一種與劑量和劑型相容的方式接種疫苗，并且這個量是治療上有效的和有免疫原性的。接種疫苗的量取決于被治療的個體，例如，此個休的免疫系統產生免疫應答的能力和所期望的保護程度。合適的劑量范圍約等于每次接種幾百微活性成分，優選的范圍是約0.1微克到200微克(盡管在1-10毫克的較高劑量范圍內需慎重考慮)，例如在從約0.5微克到1000微克的范圍內，優選的范圍是從1微克到500微克尤其是在10微克到100微克的范圍內。對于初次免疫和加強免疫的合適的策略也是不定的，但以初次免疫后隨后加強接種或其他免疫方式為特征。應用的方式可能變化很大。任何一種傳統的施與疫苗的方式都是可行的。這些方法包括口服在生理學可接受的固體基礎上或在生理學可接受的散劑基礎上通過注射或類似的非胃腸道途徑。疫苗的劑量將取決于接種疫苗的途徑并且根據被接種個體的年齡和抗原的劑型而變化。疫苗的一些多肽在一種疫苗中具有足夠的免疫原性，但對于另外一些多肽來說如果疫苗進一步包含佐劑物質那么就會增強免疫應答。對于疫苗來說，已經知道有許多方法可以達到佐劑效果。在"佐劑的理論和實際應用"，1995，DucanESStewart-Tull(編者),約翰威利父子公司，ISBN0-471-95170-6，和在"疫苗新一代的免疫學佐劑"，1995，GregoriadisG(編者),PlenumPress,紐約，ISBN0-306-45283隱9中都詳細地說明了其一般原理和方法，在此以上兩書并入文中。特別優選的是，使用一種已經證明可以促進打破對自身抗原自身耐受狀態的佐劑。實際上，在一些利用未經修飾的OPGL作為自身疫苗活性成分的情況下，這是必須的。合適的佐劑的無限的實施例選自包含一種免疫定向佐劑，一種免疫調節佐劑如毒素、細胞因子和細菌衍生物；油劑；聚合物；膠囊形成佐劑；皂苷；免疫剌激復合物基質(ISCOM基質)；顆粒；DDA;鋁佐劑；DNA佐劑；y-菊粉和膠囊化佐劑的組。通常情況下，應該注意的是在上文中涉及的在類似物中用做第一、二、三部分的有用的化合物和制劑也同樣適用于其在本發明疫苗佐劑中的應用。佐劑的應用包括使用氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑，通常用0.05-0.1%的緩沖鹽溶液，與糖混合形成多聚物(例如Carbopol)的合劑使用0.25%的溶液，通過在70至10rC的范圍內分別加熱處理30秒至2分鐘可使蛋白質聚集，使用膠聯劑使蛋白質聚集也是可行的。通過用胃蛋白酶處理過的抗體(Fab片段)與鋁的作用聚集蛋白質，與細菌細胞如C.parvim或內毒素或革蘭氏陽性菌的脂多糖成分混合，乳化在生理學上可接受的油性介質如二縮甘露醇單油酸酯(AracelA)中或用20%的全氟碳(Fluosol-DA)溶液作為阻斷取代物來乳化也可實施。油合劑如角鯊烯和IFA也是優選的。根據本發明，DDA是DNA和Y-菊粉的一種非常有效的候選佐劑，而且弗氏完全和不完全佐劑以及皂樹皂甙如QuilA和QS21也如RIBI一樣是令人感興趣的候選佐劑。上面提到的C3和C3d以及胞壁二肽(MDP)也是進一步可能的佐劑。已知脂質體劑型也具有佐劑效果，因此根據本發明脂質體佐劑也是優選的。根據本發明，免疫刺激復合物基質類型(ISCOM基質)的佐劑也是優選的選擇，特別是已經表明這種類型的佐劑能上調APCsMHCII類分子的表達。ISCOM基質由任意分離的)來自皂樹的皂甙(三萜系化合物)，膽固醇和磷脂組成。當與有免疫原性的蛋白質混合時，所產生的呈顆粒狀的劑型即已知的ISCOM顆粒，其中皂武占60-70%，膽固醇和磷脂占10-15%，蛋白質占10-15%，以上比例均為重量/重量比。有關免疫剌激復合物的構成和使用的詳細信息可參見上面提到的論及佐劑的教科書，MoreinB等，1995，臨床免疫治療3:461-471以及BarrIG和MitchellGF,1996，免疫和細胞生物學，74:8-25(在此參考文獻都并入文中)對如何制備完全的免疫剌激復合物也都提供了有用的指導。另外一種很令人感興趣的(并且因此，優選的)可以達到佐劑效果的可能是應用Gossdin等1992年描述的技術(在此并入文中)。簡言之，通過將抗原與抗單核/巨噬細胞表面的FcY受體的抗體(或結合抗原的抗體片段)結合，可加強對相關抗原如本發明中的抗原的呈遞。特別是抗原和抗FcYRI抗體的結合已經被證明可以為了接種的目的增加免疫原性。其他可能的情況包括使用上面提到的定向和免疫調節物質(細胞因子)作為OPGL被修飾后形式的候選的第一和第二部分。就此而言，合成的細胞因子誘導劑如多聚I:C也是可能的選擇。合適的細菌衍生物選自由胞壁酰二肽、完全弗氏佐劑、RIBI和海藻糖二酯如TDM和TDE所組成的組。合適的免疫定向佐劑選自由CD40配體CD40抗體或其特異性結合片段(見上面的討論)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4組成的組。合適的多聚物佐劑選自碳水化合物如右旋糖苷、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖、塑料多聚物如，和乳膠如乳膠珠組成的組。另外一種令人感興趣的調節免疫應答的方式是在"虛擬淋巴結"中(一種由位于360LexingtonAvenue,NewYork,NY10017-6501的免疫治療公司開發的專利性醫療裝置)包括OPGL免疫原(與佐劑以及藥物學可接受的載體和賦形劑任選組合)。VLN(細長的管狀裝置)模擬淋巴結的結構和功能。在皮膚下插入VLN產生了一個細胞因子和趨化因子迅速增多的無菌的炎癥位點，T和B淋巴細胞以及APCs迅速對危險信號發生反應，定位炎癥位點并聚集在VLN的可透過的基質中。已經表明當使用VLN時針對某一抗原產生免疫應答的必須抗原劑量減少了，并且使用VLN接種產生的免疫保護超過了傳統的使用Ribi作為佐劑的免疫。在"從實驗室到臨床，摘要，10月12-15日，1998，海景勝地，Aptos,加州"中GdberC等"應用名為虛擬淋巴結的新型醫療裝置誘導出了針對少量抗原的強大的細胞和體液免疫應答"一文中簡要描述了此技術。據預測每年需要接種此疫苗1至6次，如每年l，2，3，4，5,6次給需要它的個體接種疫苗。先前已經表明根據本發明使用優選的自身疫苗所引起的記憶免疫是短暫的，因此需要用OPGL或被修飾的OPGL多肽周期性的攻擊免疫系統。由于遺傳變異，不同的個體針對相同的多肽所產生的免疫應答強度不同。因此，根據本發明為了增強免疫應答，疫苗應當包含幾種不同的多肽，見上面關于引入外源T細胞表位的選擇的討論，此疫苗可以含有2或更多的多肽，其中所有的多肽在上面已經闡釋過了。因此疫苗可以含有3至20個不同的經修飾的或未經修飾的多肽，例如3至10個不同的多肽。核酸接種作為傳統的接種以肽為基礎的疫苗的另外一種選擇，核酸接種技術(也稱為"核酸免疫""遺傳免疫"和"基因免疫")具有許多引人注目的特征。首先，與傳統的疫苗方法相比，核酸免疫并不需要用來大規模地生產免疫原性物質的資源(例如，工業上大規模微生物發酵以產生被修飾形式的OPGL)。而且，不需要免疫原純化裝置和再折疊方案。最后，由于核酸免疫依賴于被免疫個體自身的生物化學裝置去產生被引入的核酸的表達產物，所以希望對表達產物進行最佳的翻譯后處理；這在自身接種的情況下尤其重要，如上所述，這是因為在修飾后的分子中應當保留大部分的原始OPGLB細胞表位，并且在理論上B細胞表位可被任何(生物)分子(如碳水化合物、脂類、蛋白質等)的部分所取代。因此，免疫原天然的糖基化和脂質化特征對于總體的免疫原性來說是非常重要的，并且使宿主產生免疫原很好地確保了這一點。因此，本發明的一個優選的實施方案包含通過將編碼被修飾的OPGL的核酸引入動物細胞來實現向免疫系統呈遞被修飾的OPGL，并且憑此獲得了由被引入核酸的細胞進行的體內表達。在本實施方案中，被引入的核酸優選是DNA，可采用裸DNA的形式，DNA與帶電荷的或不帶電荷的脂類配制在一起，DNA配制在脂質體中，DNA被包含在病毒載體中，DNA與促進轉染的蛋白或多肽配制在一起，DNA與導向蛋白或多lfc配制在一起，DNA與鈣沉淀試劑配制在一起，DNA與惰性載體分子結合在一起，DNA由殼多糖或脫乙酰殼多糖膠囊化，和DNA與佐劑配制在一起。在本文中需要注意的是，在實際應用中所有與在傳統疫苗配制物使用佐劑有關的設想同樣適用于DNA疫苗。因此，多肽疫苗中涉及佐劑使用的所有說明同樣適用于核酸接種技術。關于上面已經詳細討論的多肽疫苗的接種途徑和接種方案，也同樣適用于本發明中的核酸疫苗并且以上關于多肽免疫途徑和免疫計劃的所有討論也都適用于核酸疫苗。需要增加的一點是核酸疫苗可適用于靜脈內和動脈內接種。而且，本領域中眾所周知，核酸疫苗可以使用基因槍接種，因此，這個及其相關的接種方式也被認為是本發明的一部分。最后，也有報道稱在核酸疫苗的接種上應用VLN產生了很好的結果，因此這種獨特的接種方式是尤其優選的。而且，用做免疫作用劑的核酸可包含編碼第一、第二或第三部分的區±或，例如以上面所描述的免疫刺激物質的形式如上面所討論的細胞因子作為有用的佐劑。本實施方案的一個優選的樣本包括將類似物的編碼區和免疫調節子的編碼區處于不同的讀碼框內或至少在不同的啟動子的控制之下，由此避免了所產生的類似物或表位作為免疫調節子的融合配偶體的情況。另外，可以使用兩種不相同的核酸片段，這是因為當將兩個編碼區包含在同一個分子中時具有確保其共同表達的優點。因此，本發明也涉及誘導產生抗OPGL抗體的組合物，此組合物包含…-本發明的核酸片段或載體(見下面關于載體的討論)，和——藥物學和免疫學可接受的如上所述的賦形劑和/或載體和/或佐劑在正常情況下，編碼OPGL突變體的核酸以載體的形式被引入，其中表達被控制在病毒啟動子之下。根據本發明關于載體更為詳細的討論參見先前的討論。涉及核酸疫苗配制和使用的詳細說明見DonnellyJJ等，1997，免疫學年度評論，15:617-648和DonnellyJJ等，1997，生命科學，60:163-172，在此參考文獻都并入文中。活疫苗第三種實現被修飾的OPGL呈遞給免疫系統的方法是使用活疫苗技術。在活疫苗接種中，呈遞給免疫系統這一過程受到一種非致病性的已經被用一編碼被修飾的OPGL的核酸片段或用一含有此核酸片段的載體轉化的微生物而實現。這種非致病性的微生物可以是任何合適的減毒的細菌菌株(通過傳代的方法或利用重組DNA技術去除致病性表達產物的方法減毒)，例如牛結核桿菌卡介苗、非致病性的膿毒敗血癥鏈球菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌和志賀氏細菌等。關于制備最先進的活疫苗的綜述見SaliouP，1995,應用綜述45:1492-1496和WalkerPD,1992，疫苗10:977-990，在此參考文獻都并入文中。關于用于這些活疫苗的核酸片段和載體的細節參見下面的討論。作為活細菌疫苗的另外一種選擇，將在下,論的本發明的核酸片段可被插入到一無毒性的病毒疫苗載體中如痘苗病毒株或其他任何可用的痘病毒。正常情況下，非致病的微生物或病毒僅被接種到動物體內一次，但在某些情況下為了維持保護性免疫，在一生中有必要接種這種微生物多于一次。曾經構想的在上面詳細討論的用于多肽接種的免疫方案在活疫苗或病毒疫苗的應用中也是有用的。另外，在活疫苗或病毒疫苗接種之前或之后常組合多肽和/或核酸接種。例如，可能利用活疫苗或病毒疫苗產生初始免疫，隨后用多肽或核酸疫苗加強免疫的方法。微生物或病毒可被用含有第一、二、三部分編碼區的核酸所轉化，例如采用上面所描述的利用免疫調控物質如細胞因子作為有用的佐劑的形式。本實施方案的一個優選的樣本包括將類似物的編碼區和免疫調節子的編碼區處于不同的讀碼框內或至少在不同的啟動子的控制之下，由此避免了所產生的類似物或表位作為免疫調節子的融合配偶體的情況。另外，可以使用兩種不相同的核酸片段用做轉染作用劑。當然，使第一、二、三部分處于同一讀碼框中可將其作為一種表達產物而提供，即本發明的一種類似物，根據本發明這樣的實施方案是尤其優選的。在疾病治療中使用本發明的方法從上面的討論中我們可以看到，本發明方法的設立考慮到了對以骨質過度損失為特征的疾病的控制。在本文中，骨質疏松癥是本發明方法的主要目標，與復雜的骨折有關的骨損失也是治療/緩解此疾病的一個可行的目標。因此，本發明的一個重要的負調節OPGL活性的實施方案包含治療和/或預防和/或緩解骨質疏松或其他以骨再吸收過度為特征的癥狀，此方法包括根據本發明的方法負調節OPGL活性至骨再吸收顯著降低的程度。與病理速率相比，本文中骨再吸收速率顯著下降至少3%，但包括稍微高一點的百分比，如至少5%，至少7%，至少9%，至少11%，至少13%，至少15%和至少17%，但預期更高的百分比，如至少20%,或甚至是至少30%。尤其優選的是骨再吸收的下降導致了骨形成和骨再吸收之間的平衡的逆轉，即骨生成速度大于骨再吸收的速度。當然，不能維持這種不平衡(因為這會導致硬骨病)，但通過仔細控制需要免疫個體的接種次數和免疫學效果，可以隨時間推移獲得導致骨質凈保存的平衡。另外，如果在一個體中本發明的方法不能終止骨損失，本發明的方法可(與其他已知的在骨質疏松患者中減少骨損失的方法任意組合使用)被用以獲得骨損失的顯著減少，因此延長在此個體中存在充足的骨質的時間。用以測量骨再吸收和骨形成速率的方法是本領域所熟知的。憑借生化分析的方法有可能通過測量I膠原蛋白某種片段(見WO93/15107和WO94/14844)在血液中的濃度來測定骨再吸收的速率。另外，通過物理學的方法也可測定骨損失速率。本領域方法中通過無侵害的物理學的方法測定骨質的最具有代表性的說明見WO88/06862，W094/12855,W095/14431，和W097/00643。本發明的肽、多肽和組合物正如在上文中所顯而易見的那樣，本發明基于為了間接獲得降低的破骨細胞活性而用OPGL抗原免疫個體這一概念。獲得這樣的免疫的優選方法是利用修飾后的OPGL，籍此提供本領域中此前所未包括在內的分子。我們認為在此所討論的被修飾的OPGL分子就其本身來說是有創造性的，因此本發明的一個重要部分涉及一種來自動物OPGL的OPGL類似物，其中引入了一個其后果是用此類似物免疫動物誘導產生的抗體可與未經修飾的OPGL多肽特異性反應的修飾。更為可取的是，這個修飾的性質與上面在討論本發明方法的各種實施方案使用修飾的OPGL時所描述的修飾類型一致。因此，在此提供的涉及被修飾OPGL分子的任何說明都與描述本發明OPGL類似物的目的有關，并且任何這樣的說明同樣適用于對這些類似物的描述中。需要注意的是優選的被修飾的OPGL分子包含可造成與OPGL序列具有70%—致性的多肽或與其亞序列至少具有10個氨基酸一致的修飾。較高一些的序列一致性是更為優選的。例如只曬是75%，或甚至是至少80，85，卯或95%。可用(Nref-Ndif)100/Nref來計算蛋白質和核酸的序列一致性，其中Ndif是在序列比較時兩序列中不相同的氨基酸殘基的總數，Nref是其中一個序列中的殘基數目。因此，AGTCAGTCDNA序列與AATCAATC序列具有75%的序列一致性(Ndi尸2并且Nre尸8)。本發明也涉及在應用本發明方法中有用的組合物。因此，本發明也涉及含有免疫學上有效量的是動物自身蛋白的OPGL多肽的免疫原性組合物，據說OPGL多肽與一免疫學可接受的佐劑配制在一起以用于打破動物針對此OPGL多肽的自身耐受，此組合物還包含藥物學和免疫學可接受的稀釋液和/或賦形劑和/或載體和域賦形劑。換句話說，本發明的這一部分與天然發生的巳經聯系本發明方法的實施方案描述過的OPGL多肽的配制有關。本發明也涉及含有免疫學上有效量的上面闡明的免疫原性組合物，據說此組合物還包含藥物學和免疫學可接受的稀釋液和/或賦形劑和/或載體和/或賦形劑和任選的佐劑。。換句話說，本發明的這一部分有關被修飾的OPGL的配制；基本如上所述。當涉及被修飾的或未修飾的OPGL用于本發明方法以負調節OPGL時，對佐劑、載體和賦形劑的選擇與上面所討論的一致。多肽的制備采用本領域眾所周知的方法，通常通過重組基因技術包括將一編碼OPGL類似物的核酸序列引入到一合適的載體中來制備較長一些的多肽，用此載體轉化合適的宿主細胞表達此核酸序列，從宿主細胞或其上清中提取表達產物，隨后進行純化和任選的進一步修飾，例如再折疊和衍生化。較短一些的多肽優選眾所周知的固相或液相多肽合成技術來制備。但是，最近此技術的進展已經提出可能利用此技術產生全長的多肽和蛋白這一問題。因此，它也在本發明通過合成方法制備長構建物的范圍之內。本發明的核酸片段和載體從上面的說明中我們可以得知被修飾的OPGL多肽既可以通過重組技術，又可憑借化學合成或半合成的方法來制備。當修飾存在于對蛋白質載體(如KLH，白喉類毒素，破傷風類毒素和BSA)和非蛋白質分子如碳水化合物多聚物偶聯時和當然當修飾包含加入側鏈或側鏈基團至OPGL多肽來源的肽鏈時，后兩種方法尤其有用。就重組基因技術而言，和當然就核酸免疫而言，編碼被修飾的OPGL的核酸片段是重要的化學產物。因此，本發明的一個重要部分涉及編碼OPGL類似物的核酸片段，即一包含已經加入或插入融合配偶體的天然OPGL序列的OPGL衍生的多肽或最好是OPGL衍生的多肽，其中已經通過插入、添加，優選是取代或缺失的方法引入外源T細胞表位。本發明的核酸片段是DNA或RNA片段。本發明的核酸片段通常情況下被插入到合適的載體中以形成攜帶有本發明核酸片段的克隆或表達載體，這些新型的載體也是本發明的一部分。關于構建本發明這些載體的細節將在下面轉化細胞和微生物一文中討論到。依據應用的目的和類型，載體可以是質粒、噬菌體、粘粒、微型染色體或病毒的形式，只在某些細胞中瞬時表達的裸DNA也是一種重要載體。本發明優選的克隆和表達載體是可以自主復制的，因此為了高水平表達或用于隨后克隆的高水平復制的目的，可以獲得高拷貝數。本發明載體的一般輪廓是在5'-3'方向以可操作的連接方式包含以下特征驅動本發明的核酸片段表達的啟動子，任選的一編碼可使多肽片段分泌(至細胞外相，或至間充質)或結合在膜上的前導肽的核酸片段，本發明的核酸片段，和任選的編碼終止子的核酸序列。當在生產菌株或細胞系上操作表達載體時，為了轉化細胞的遺傳穩定性優選的方法是當載體被導入宿主細胞后整合到宿主細胞基因組中。相反，當在動物體內操作將導致體內表達的載體時，為安全起見優選的是此載體不能整合到宿主細胞基因組中；典型的是，當用到裸DNA或非整合的病毒載體時，本領域熟練技術人員熟知應該選擇哪一個。本發明的載體被用于轉化細胞以產生本發明的被修飾的OPGL多肽，也作為本發明的一部分的這些轉化的細胞可以是用于本發明核酸片段和載體增殖的細胞和細胞系，也可以是用于重組生產本發明中被修飾的OPGL多肽的細胞和細胞系。另夕卜，被轉化的細胞也可以是合適的或疫苗株，其中核酸片段(單一或多個拷貝)已經被插入以造成被修飾的OPGL分子的分泌或者整合到細菌細胞膜或細胞壁上。本發明優選的轉化細胞是微生物如細菌(如埃希氏桿菌屬(例大腸桿菌)，芽孢桿菌(例如枯草芽孢桿菌)，沙門氏菌，或分支桿菌(優選非致病性的，例牛結核桿菌卡介苗))，酵母(釀酒酵母)和原生動物。另外，被轉化的細胞也可以來自多細胞的生物體，如真菌類，昆蟲細胞，植物細胞或哺乳動物細胞。最優選的是人的細胞，見下面關于細胞系和載體的討論。最近在申請者的實驗室中使用商業上可用的果蠅黑色素細胞系(S2細胞系和載體系統，Invitrogen)生產重組的多肽的結果顯示很有希望，因此，這個表達系統是特別優選的。為了克隆或優化表達的目的，優選的情況是被轉化的細胞可以復制本發明的核酸片段。表達核酸片段的細胞是本發明任選的有用的實施方案；它們可被用于在非致病性細菌中小規模或大規模地制備被修飾的OPGL或在活疫苗中作為疫苗組合物。當使用轉化細胞生產本發明的被修飾的OPGL時，表達產物或者是被分泌到培養液中或者是被運送到轉化細胞的表面上是很方便的，盡管不是最重要的。當一株有效的生產細胞己經被鑒別出時，在其基礎上，優選的情況是建立攜帶有本發明能表達編碼修飾的OPGL核酸片段的載體的穩定的細胞系。更優選的情況是，這個穩定的細胞系分泌或攜帶有本發明的OPGL類似物，因此利于其純化。通常情況下，含有復制子和來自與宿主細胞相容的物種的控制序列的智力載體被與宿主細胞一起使用。此載體通常帶有一個復制位點，以及可在轉化細胞中提供表型選擇的標記序列，例如，最典型的是用來自大腸桿菌種的pBR322質粒轉化大腸桿菌(見，例Boliver等，1997)。pBR322質粒含有氨芐青霉素和四環素抗性基因，因此為鑒定轉化細胞提供了簡單的方法。pBR322質粒或其他細菌質粒或噬菌體也必須含有，或被修飾后含有可被真核微生物用于表達的啟動子。最常被用于重組DNA構建的啟動子包括B-內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(Chang等，1978;Itakura等，1977;Goeddel等，1979)和色氨酸啟動子系統(Goeddel等，1979;EP-A-0036776)。在經常使用這些最常用的啟動子的同時，也發現和使用其他的微生物啟動子，關于它們的核酸序列的資料已經發表，以使本領域熟練技術人員能將其與質粒連接使用(Siebwenlist等，1980)。在大腸桿菌中某些原核基因可在它們自己啟動子控制下有效地表達，從而排除了通過人工方法加入另外一個啟動子的需要。除了原核生物外，真核微生物如酵母培養物也可以使用，并且在此此啟動子能夠啟動表達。釀酒酵母和面包酵母是在真核微生物中最常用的，盡管其它一些菌株也是可用的。為了在對于在酵母中的表達而言，YRp7質粒是普遍使用的(Stinchcomb等,1977;Kingsman等，1979;Tschemper等，1980)。這個質粒已經包含了為在色氨酸例如ATCCNO44076或PEP4-1(Jones，1977)中失去生長能力的酵母突變株提供選擇標記的trpl基因。trpl基因損傷作為酵母宿主細胞基因組的一個特征，為利用在色氨酸不存在的情況下生長來檢測轉化提供了一個有效的環境。在酵母載體中合適的啟動子序列包括3-磷酸甘油激酶的啟動子(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968;Holland等，1978)，例如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，葡萄糖-6-磷酸異構酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶和葡(萄)糖激酶。在構建合適的表達質粒時，與這些基因有關的終止序列也被連接到表達載體序列的3'端以期望表達產生mRNA多聚腺苷酸尾并終止。具有轉錄被控制在生長條件之下的額外優點的啟動子有醇脫氫酶2，異細胞色素C，酸性磷酸酶，與氮代謝有關的降解酶，和前述的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以及和麥芽糖和半乳糖代謝有關的酶的啟動子區。任何含有酵母相容的啟動子、復制起點和終止序列的質粒載體都是合適的。除了微生物，來自多細胞生物的細胞培養物也可被用做宿主細胞。早理論上，任何這樣的細胞培養物都是可行的，無論來自脊椎動物培養物還是來自無脊椎動物培養物。但是，脊椎動物細胞最令人感興趣，并且近年來在培養中繁殖脊椎動物(組織培養)已經成為常規方法(組織培養，1973)。這些有用的細胞系有VERO和Hela細胞系，中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)，和W138，BHK，COS-7，293，草地夜蛾(sf)細胞(從位于1000ResearchParkway,Meriden,CT06450,USA的蛋白質科學和Invitrogen公司有售的完全表達系統)和MDCK細胞系。在本發明中，尤其優選的細胞系是從位于P.O.Box2312,9704CHGroningen，荷蘭的Invitrogen公司有售的S2細胞系。這些細胞的表達載體通常包括(如果需要的話)復制的起點，存在于被表達基因之前的啟動子以及任何必要的核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點和轉錄終止序列。為用于哺乳動物細胞，表達載體上的控制功能常由病毒成分提供，例如，普遍使用的啟動子來自多瘤病毒，腺病毒2型，以及最常用的猴病毒40(SV40)，SV40的早期和晚期啟動子尤其有用，因為它們作為含有SV40病毒的復制起點的片段很容易從病毒中獲得(Fiers等，1978)。如果在病毒的復制起點從HindIII位點到BglI位點大約250bp的序列被包含在內的話，SV40的大片段或小片段也可被使用。另外，使用與所需基因序列有關的啟動子或控制序列也是可能的，并且常是希望的，如果這控制序列與宿主細胞系統相容。復制起點可由構建載體時包括一外源的起點如可能來自SV40或其他病毒(例如多瘤病毒，腺病毒，VSV，BPV)提供，也可由宿主細胞染色體復制機制提供。如果載體整合入宿主細胞染色體的話，后者就足夠了。對有用的OPGL類似物的鑒別本領域熟練技術人員都知道并不是原始OPGL的所有突變體或修飾體都具有在動物體內誘導可與原始形式交叉反應的抗體的能力。但是，對達到在此所討論的免疫反應性最低要求的修飾的OPGL分子來說，要建立一個有效的篩選標準并不困難。因此，本發明的另一部分是關于鑒別一個能在動物體內誘導產生抗未修飾的OPGL抗體的被修飾的OPGL的方法。在此未經修飾的OPGL多肽是非免疫原性的自身蛋白，此方法包括…-通過肽合成或基因工程方法制備一系列彼此不同的被修飾的OPGL多肽，其中該動物物種中的OPGL多肽的氨基酸序列己被添加、插入、刪除或被取代了氨基酸，由此，在該系列多肽的氨基酸序列中包含對該動物物種是外源的T細胞表位，或者制備一系列編碼該一系列彼此不同的被修飾的OPGL多肽的核酸片段，…-測試該一系列被修飾的OPGL多肽或核酸片段中的成員的誘導該動物物種產生抗未經修飾的OPGL抗體的能力，和---鑒別和任選地分離該一系列被修飾的OPGL多肽中的在該動物物種體內顯著引起抗未經修飾的OPGL抗體產生的成員，或鑒別和任選地分離由該一系列核酸片段中的在該動物物種體內顯著引起抗未經修飾的OPGL抗體產生的成員編碼的多肽表達產物。在本文中，"一系列彼此不同的被修飾的OPGL多肽"指根據上面討論的標準挑選出來的不相同的被修飾的OPGL多肽的集合(例如結合圓二色性，NMR光譜，禾n/或x-射線衍射特征研究)。此系列可僅由少數成員組成，但也可含有數百成員。對此系列成員的測試最終可在體內進行，但是可在體外進行一些測試，以縮小為本發明的目的服務的被修飾的OPGL分子的數量。既然引入外源T細胞表位的目標是通過T細胞輔助來支持B細胞應答，先決條件是被修飾的OPGL分子可以引起T細胞增殖。T細胞增殖可用體外標準的增殖分析來測試。簡言之，從受試者獲得富含T細胞的樣品并隨后培養，培養的T細胞與受試者的在此之前己被提取的APCs細胞和被修飾的分子接觸，并處理以呈遞其T細胞表位，測定T細胞增殖并與合適的對照相比較(例如培養的T細胞與己用完整的原始OPGL處理的APCs細胞相接觸)。另外，可通過測定T細胞在識別外源T細胞時所釋放出的相關細胞因子的濃度來測量增殖。已經提出任何一種類型的至少一個被修飾的OPGL可以引發抗OPGL抗體產生有很大的可能性，所以制備一種含有至少一個可在動物物種中誘導抗未經修飾的OPGL抗體產生的被修飾的多肽的免疫原性組合物是可能的，其中未經修飾的OPGL多肽是該動物物種的自身蛋白。此方法包含將此系列中在該動物物種中明顯誘導與OPGL反應的抗體產生的成員與藥物學和免疫學可接受的載體和/或賦形劑和/或稀釋液和/或賦形劑混合，與藥物學和免疫學可接受的至少一種佐劑任選組合使用。與多肽群測試有關的本發明的上述方面可以通過首先制備本發明一些彼此不同的核酸序列或載體，然后將它們插入到合適的表達載體中，用此載體轉化合適的宿主細胞來表達本發明的核酸序列從而很方便地完成。這些步驟之后是表達產物的分離。優選的情況是核酸片段或載體通過包含分子擴增技術如PCR或通過核酸合成的操作來制備。本發明的另一部分是有關在動物，包括人當中治療、預防或緩解以骨再吸收過度為特征的疾病的方法，此方法包含向動物施與有效量的不同于oste叩rotegerin的至少一種可以阻斷OPGL對破骨細胞活性刺激效應的物質，現在認為在本領域中從未嘗試過此種方法。本發明的這一部分的優選實施方案涉及使用OPGL特異的抗體(多抗或單抗)或其特異性結合的突變體作為阻斷OPGL刺激效應的物質。優選的情況是抗體是IgG或IgM分子，或其特異性結合的突變體來自IgG或IgM。抗體的特異性結合的突變體可以很方便的是Fab片段、F(ab，)2片段，人源化的單抗或其片段，或者是二聚或多聚抗體片段如diabody(由劍橋抗體技術公司生產的雙特異性和二聚體的人工抗體衍生的分子)。實施例已經決定克隆或合成編碼鼠158-316位氨基酸殘基和人159-317位氨基酸殘基的截短的鼠和人OPGL的cDNAs(編號分別與SEQIDNos:2和4一致)。由于這些截短了的分子具有生物學活性，使自身抗體針對OPGL的這個部位是合理的。此外，這樣會使蛋白質稍微小一些，因此易于操作。已經合成了一段編碼鼠OPGL158-316位氨基酸殘基的cDNA，從已發表的序列去除了次優的大腸桿菌和Pichiapastoris密碼子。此外，一個N末端組氨酸標記，來自釀酒酵母的ot交配因子信號序列的切割位點的部分，以及合適的限制性酶切位點都被加入到開放讀碼框中(見SEQIDNO:7)。這種編碼野生型OPGL的cDNA已經使用BspHI和HindIII限制性酶克隆入標準的大腸桿菌表達載體(pTrc99a),以及使用SacI和KpnI限制性酶克隆入標準的克隆載體(pBluescriptKS+)中(產生了SEQIDNO:9)。在大腸桿菌細胞中的表達導致了大約30。/。的總大腸桿菌蛋白是重組的0PGL，利用以下方法再折疊和純化這種蛋白質1.通過離心收獲細胞。2.細胞重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)中并且再次離心。3.棄上清，細胞重懸于3倍體積的下述溶液中(lOOmMTris(羥甲基)氨基甲垸氫氯化物，5mM二硫蘇糖醇(DDT)，0.5MNaClpH8.0)4.每克細胞加入8^150mMPMSF和80^1溶菌酶(10mg/ml),室溫孵育20分鐘。5.對于每克細胞沉淀，加入4mg脫氧膽酸，懸液在37"C孵育至變得粘稠。6.每克細胞重量加入20|alDNA酶(lmg/ml),加入MgCl2至5mM，懸液室溫孵育30分鐘。7.將懸液置于冰上超聲直至粘性消失。8.20000g離心30分鐘后，沉淀重懸于水中，再離心，沉淀每克細胞重量用3ml1M的尿素溶液重懸。9.20000g離心30分鐘后，沉淀重懸于1M鹽酸胍，100mMTris(羥甲基)氨基甲烷氫氯化物pH7.8的溶液中。10.20000g離心30分鐘后，沉淀重懸于6M鹽酸胍，20mMTris(羥甲基)氨基甲垸氫氯化物，5%乙醇，18%P-巰基乙醇，pH8.0的溶液中，并在4'C攪拌過夜。11.40000g離心1-4小時后，上清過濾后-2(TC凍存。12.利用Superdex200(發瑪西亞)通過凝膠過濾層析分離可溶的包涵體。13.收集含有重組OPGL的部分并用下述液體稀釋至0.1mg/ml:1.5M鹽酸胍，20mMTris(羥甲基)氨基甲垸氫氯化物，lmMDTT,pH7.5.14.用10倍體積的下述溶液在4"C透析過夜1.5M鹽酸胍,20mMTris(羥甲基)氨基甲烷氫氯化物，lmMDTT,pH7.5。15.用10倍體積的下述溶液在4i:透析過夜1.0M鹽酸胍，20mMTris(羥甲基)氨基甲垸氫氯化物，lmMDTT,pH7.5。16.用10倍體積的下述溶液在4"C透析過夜0.5M鹽酸胍，20mMTris(羥甲基)氨基甲烷氫氯化物，lmMDTT,pH7.5。17.用10倍體積的下述溶液在4'C透析過夜20mMTris(羥甲基)氨基甲烷氫氯化物，150mM精氨酸，lmMDTT,pH7.5。18.用10倍體積的下述溶液在4X:透析過夜20mMTris(羥甲基)氨基甲烷氫氯化物，150mM精氨酸，pH7.5。19.再折疊產物凍干并-2(TC貯存。用這種方法再折疊的效率大約是40%，純度大于65%，純化方法和再折疊過程仍有待于進一步改進。固定化的再折疊仍在研究之中，正如有Pedersen等，1999所描述的那樣，必要時可用酶解方法去除組氨酸標記。已經用SDS-PAGE，N末端測序，氨基酸分析和質譜測定鑒定和證實了重組蛋白的性質。鼠野生型OPGL的一個半胱氨酸取代突變體正在構建中(其中對應于SEQIDNO:4氨基酸殘基的半胱氨酸被用絲氨酸取代；見SEQIDNOs:ll和12)。取代是為了消除純化的重組蛋白潛在的穩定性問題。見下面始自SEQIDNO:9的DNA的描述，這種突變的截短的OPGL將作為完整的類似物中疫苗構建的基礎。而且，為同樣的目的，人OPGL的相應半胱氨酸-絲氨酸突變體(絲氨酸221被取代)也將被構建出來。疫苗分子起初是通過在指定位置插入或內部取代破傷風類毒素的P2或P30表位而構建的，在后來也可用其他的合適的優勢免疫T細胞表位。引入突變的位置是根據現有的或預測的B細胞表位和預測的原始分子二級結構要素的知識，以及為塑造OPGL細胞外部分的二級和三級結構利用對現有的TNFa(la8m.pdb)和CD40配體(laly.pdb)的三維結構進行序列比較的知識而選定的。在鼠OPGL分子中引入突變的位置在170-192，198-218，221-246，256-261和285-316位氨基酸殘基(見SEQIDNO:4)，而在人OPGL分子中引入的突變在171-193，199-219，222-247，257-262和286-317《立氨基酸殘基位置。至今已經有4種鼠OPGL的變異體被構建并且在大腸桿菌中表達。編碼帶有N末端組氨酸標記的mOPGL(158-316)—P30(256-261)的DNA(SEQIDNO:13)利用SEQIDNO:22和25作為引物對SEQIDNO:9進行PCR擴增。產物PCR片段用SacII和KpnI進行限制性酶切分析并隨后用瓊脂糖凝膠純化，然后以SEQIDNO:9為模板，以SEQIDNO:26引物和載體特異性引物進行二次PCR擴增。產物PCR片段用KpnI和HindIII酶切，然后將兩個片段與用SacII和HindIII酶切處理的在pBluescriptKS+中的SEQIDNO:9連接。為了糾正此構建物中的單堿基突變，利用SEQIDNO:33和29作為引物利用構建物作為模板進行PCR擴增，產物PCR片段用PstI和EcoRI酶切處理，凝膠純化并隨后連接至已經用PstI和EcoRI消化的錯誤的構建物中。利用BspHI和HindIII限制酶將證實的構建物(SEQIDNO:13)轉移到pTrc99a中。編碼帶有N末端組氨酸標記的mOPGL(158-316LP2(256-261)的DNA(SEQIDNO:15)利用SEQIDNO:27和28作為引物不加模板進行PCR擴增。產物PCR片段PstI和EcoRI酶切處理，并隨后用瓊脂糖凝膠純化。產物片段與用SacII和HindIII酶切處理的在pBluescriptKS+中的SEQIDNO:9連接。隨后利用BspHI和HindIII限制酶將證實的構建物(SEQIDNO:15)轉移到pTrc99a中。編碼帶有N末端組氨酸標記的mOPGL(158-316)—P2(288-302)的DNA(SEQIDNO:17)利用SEQIDNO:22和29作為引物進行SEQIDNO:9的PCR擴增。產物PCR片段用PstI和BstBI進行限制性酶切分析并隨后用瓊脂糖凝膠純化出來。以SEQIDNO:30引物和一載體特異性引物作為引物，以SEQIDNO:9為模板進行二次PCR擴增。產物PCR片段BstBI和KpnI酶切處理，并隨后用瓊脂糖凝膠純化。兩個片段與用PstI和KpnI酶切處理的在pBluescriptKS+中的SEQIDNO:9連接。隨后利用BspHI和HindIII限制酶將證實的構建物(SEQIDNO:17)轉移到pTrc99a中。編碼帶有N末端組氨酸標記的mOPGL(158-316)_P30(221-241)的DNA(SEQIDNO:19)利用SEQIDNO:22和23作為引物進行SEQIDNO:9的PCR擴增。產物PCR片段用SacII和KpnI進行限制性酶切分析并隨后用瓊脂糖凝膠純化，然后以SEQIDNO:9為模板，以SEQIDNO:24和31為引物進行二次PCR擴增。產物PCR片段用KpnI和EcoRI酶切，兩個片段與用SacII和EcoRI酶切處理的在pBluescriptKS+中的SEQIDNO:9連接。隨后利用BspHI和HindIII限制酶將證實的構建物(SEQIDNO:19)轉移到pTrc99a中。這些截短的OPGL變異體已經在大腸桿菌中進行了表達，對于所有的變異體而言所產生的變異體占總蛋白的20%以上。上面所描述的對野生型蛋白(SEQIDNO:9)的純化和再折疊過程仍將進一步發展。對每一種變異體而言，這個過程將作為發展最佳程序的基礎。利用組氨酸標記進行變異體蛋白的固定化折疊是現在正在進行的另外一種方法。另外，如果需要糖基化的話，利用限制性酶可將變異體直接轉到Pichiapastoris表達載體中，或利用PCR轉到其他的酵母表達系統中。應該注意的是，糖基化對于OPGL的體內活性并不是必需的。如Lacey等報導的那樣，也可在人293成纖維細胞中表達截短的OPGL。也將考慮在昆蟲細胞中表達(例如S2細胞系和載體系統或sf細胞系和載體系統，Invitrogen公司有售)。由于沒有現成的商業上出售的抗體，純化的變異體將被用于免疫兔子以誘導產生抗體用于檢測。此外，在評價候選自身疫苗中，這種抗體是在生物學分析中需要的并且非常有用的工具。抗體的制備使用本領域所熟知的標準方法。對最佳的學自身疫苗的選擇是根據在體外分析其對破骨細胞成熟/激活的抑制活性或在體內動物模型中對骨硬化癥的抑制活性作出的。在文獻中描述了有用的分析方法和動物模型系統(例Lacey等；Fuller等；禾QSimonet等)。通過向未麻醉的雄性BALB/c小鼠注射100^1重組蛋白(每千克鼠重用0，0.1禾nl.O毫克蛋白)，一小時后使用包被有鈣浸潤的肝磷脂的毛細管從小鼠眼主靜脈采血125微升來分析重組蛋白的活性。使用ICA2(輻射計，丹麥)測量鈣水平。在此分析中，純化的并且再折疊的重組鼠OPGL(SEQIDNO:9)是有反應的，將鈣離子的循環水平提高了10%。對候選自身疫苗的評價可利用如使用自身疫苗接種并且向小鼠注射重組的mOPGL隨后監測它們對鈣離子釋放至外周血的抑制作用來實現。應該注意的是，作為被修飾OPGL的一種替代物，針對抗OPGL抗體的獨特型的抗獨特型抗體也可作為在本發明的范圍內的免疫原。而且，利用可以在例如使用抗OPGL或osteroprotegerin作為捕獲探針的噬菌體展示系統分離出的模擬型多肽也被認為是本發明免疫原的參考文獻1.Bucay，N等，(1998)，基因發展，12，1260-12682.Lacey，D等，(1998)，細胞，93，165-1763.Marks,S.C.等，(1989)，美國實驗藥學遺傳學雜志，34，43-534.Simonet，W.S等，(1997)，細胞，89，309-3195.Fuller，K等，(1998)，實驗藥學雜志，188，997-10016.Byrgess,T等，(1999)，細胞生物學雜志，145，527-5387.Pede腦J等，(1999)，蛋白質實驗純化，15，389-400序列表<i，a〉M&E生物技術公司'"托本-哈爾基爾杰斯珀哈寧"20>負調節Oste叩rotegerin配體活性的方法<i30>22021C<140><1S0><170>35<210><211><212><213>12271DMAHomosapiens<220><221><222>CDS(185)，-(1138)aagcttggtaccgagctcsgatccactac=c:gacccscgcgtccgcgcgccccagg"agc;r60aaagccgggctceaagtctjgcgccccacgt:cgaggctccgccgcasc=tccggagttggc120cgcagacaagsaggggaggsagcgggagagggaggagagctccgaagcgagagggccgag180cgccatgcgccgcgccageagagactacaccaagcacctgcgtggcncgMetA￡gArgAlaSerArgAspTyrThrLysTyrLeuAxgGlySet1015223gaggagatgggcggcggccccggagccccgcacgagggccecctgcacGluG丄uMetGlyGlyG丄yProGlyAlaProHisGluGlyProLeuHis202530277gccAlaccgccgPcoProccgPro35cct5cgAlaccgcaccagPtoHisGin40ccccccgccgccProProAlaAlatecSec45cgctec325atgttcgtggccetcc::ggggctggggctgggccaggttst;:tgcageMetPheVslAla二euGlyLeuGlyLeuGlyGinValValCysSer505560ValAlateagaa30aat:gcaAsnAla3仁3CCt二leProGinLysasagcgLysAlactt:gaaLeuGlu160cc:atctGlyT巧LeuPhsgatggcAspGi'/AspPheAspSecU5Glu130"3gtgMetValgetcsgAlaGinggttecGlySergecaagAlaLys:t:ccattt-agagcgcagatggatheTyrPheAlaGinMetAsp7075act二ctgcatttatagaat:-t二gTheHis二yslieT'yrArqZlel^u35SO:aaacaactctggagagtcaaGinAspThrThrLeuGluSecGin100105tgtaggagaattaaacsggectttCysArgArglieLysGinAlaPhecaaca:ategttggateacagcacG丄nlieValGlySerGinHisU5gat<jgcteatggtt:agatctggc:;AspGlySerTrpLeuAspLeuAls!50155ccttc;:getcatencsecsetsacProPheAlaHisLeuThr工leAsn155170catasagtgagtctgtectcttggHis4'sValSecLeuSecSecTrp180185ccrsatagaataroAsnArglies-gs。r,r:一汽n。'i三ArgLeuHisGlu35gacacasaat::sAspThrLysLeuU0caaggagetgtgGinG丄yAlaVa二125agagcagaglieArgAlaGlu140422sagaggageLysArgSergecacegacAla丁hrAsptaecatgs:TyrH丄sAsp乙yslieL75atetecsacstgactt=tage￡atgsa"aetalie3e:AsnMetThrSerAsnGlyLysLeu200205gttaatcaggstValAsnGinAsp210tcatgaaactHisHisGluThr225gtgtacgtcactValTyrVal'Thr240atgasaggaggaMetLysGlyGiyggctt::t:atGlyPheT'/i:tea"agacSecG二yAsp230tacccgtatgecaacatttgcttcTyrLeuTyrMaA^nlieCysEhe215220geta"gagtatcttcaa-taLeviAla*ThrTycL^uGinI^u235MetaaaaccageateaaaateccaagtcctcataccctgLysThrSer工leLyslieProSerSerHisThrLeu245250255ageaccaagtattggteagggaacteccjaa〔tccat:SecTti二LysTyi:Trp5gj:GlyAjciSer"CluPhaHis250265270517565;13703757805853901S43997ttttattecataaacgtcggtggat:ttc二t:aag:taeggtecggasaSPhe:TyrSerlie.\snVsl_GlyGlyPhePheLysArgSecGlyGlu2752S0285gaaateageategaggt:=tc:raacccc-ccttac=ggatccggateagGlulieSerrieGlu''/&]_SecAsnPro3srLeuLeuAspProAspGin290235300gats匚aacataxct:ggggettttaaagetcgagatanagaccgsAspAlahrTyrhe'3lyA_LaPheLysValAxgAsplieAsp310305actcagtaccgttagactcaggt仁ggtcccattgaaggattatttcagtttgattcaaagattttttcagcaggatgtgscattgecatgttgaacag<210>2<211>U7ttggagtgtcscgtacttcc仁ggatgtttg:guacatag3cgcgtgagsctactaagaggcatgctctr^acc"gtagagaacacgcgctggtgtgttscacaatggtttttaastzttgagcaattacgggctgaccx:tatgagaaaccggtcstg:gccccttcgcagc:gaAgtggcatctgaaggggcaaattcttecgaategettttctaatgaggagagaaaa仁atatgtat在tgtaatgttttctttgesaagtattgtaaastatttaaaaatgtcttgctgttgacataaczggtgcactt:tgtaaattccctggggaatgtttcctsatatcaaatgcagtatafctcagacctgtcaagcctgtgcaaaaaaattaatggccaccaggtg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acatgaccAsnMetThr55ctgtctaacggcI^uSerAsnS丄ySOgtt132aaccaggacsgttec:三ctacc匸gcacgecaacseccgttecagacitAsnGinAspGlyTyrTy::LeuTyrAlaAsnI丄eCysheAj:gHis65*707580cacgaaacctctggttctgttHisG丄uThrSerGiySerVaL85:caacegactacccgcagccgacggt二::oThrAspTyrLeuGinLsuMezVal903S288tacgtcgttaaaacctc-atesaaiatecc這tctt-acatascctgatgTyrValValLysThrSerlieLysILeEroSerSerHisAsnLeuMet10010511033S3乙ysGlyggt:GlyUStctSerThraaasactggLysAsnTrp120cctggtaaccctSerGlyAsnSergas125heHisct:c384tactctateascggtggtttct=caaactgagagetggtgaagaaTyrSer工leAsnValGlyGlyPhePheLysLeuArgAlaGl'/GluGl_u130135no432atetctatecaggtttctsacccttc::ctgctggacccagaccaggaclieSeclieGinValSerAsnProSerLeuLeuAspProAspG丄nAsp1451501551604S0getacccacttcggggecttcaaagttcaggacategacAlaThrTyreheGlyAlaPheLysValGinAsplisAsp165170S19<210>LO<213>人工序列-223>人工序列描述編碼與His標記融合的鼠OPGL殘基)58—316的DNA"'〕0>LOMecLysHisGinGluAlaGinPro20Ser:G丄ySerHis35HisGinHisGinHisGinHisGinHisGinLysPro1015PheAJLaHisLeuT:--rlieAsnAlaAlaSer:le2530ValThrLeuSerSecTrpTyr40TrpAlaLyslieSe:AsnMetThr5055AsrxGinAspGlyhsTycTyrLeu6570HisGluThrSerGl'/SerValro35TyrValValLysTh;:SerlieLys100LysGlyGlySerTh::LysAsnTrp115120TyrSe-lieAsnValG丄yGlyPhe130135lieSerlieGinVal5erAsnPro150LeuSerAsnGly60TyrAlaAsnlis"7SThrAspTyrLeu90liePro5erSer13SHisAspA工gGl'/45LysLeuArg"1CysPhsArgHis80GinLeuMetVal95HisAsnLeuMetSerGlyAsnSe二GluPhsHisPhe125PtieLysLeuArg140AlaGiyGluGluSerLeuLeuAspPro1S5AspGinAspISOAlaThrTycPheGlyAlaPheLysValGinAsplieAsp155no<210>U<211>513<212>DMA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有C至S突變的鼠OPGL殘基158—316和His標記的融合體<220><221>CDS<22_>(11..(515)<220><221>raise—結合<222>(1),(42:<223>His標記<220><221>misc一特征<222>I"),,{228<223>鼠0PGL，殘基158—219<221>misc—特征<222>;232:'..<223>鼠0PGL，殘基221—316<220><221>突變<222>(2291.(2311<223>tgt(Cys)to;:c:c(Ser><220><400>11atgaaa=a=caacaccsacatcaacatcaacatcasicatcaaaaacct48MetLysHisOUHisGinHisGinHisGinHisGl::HisGinLysProL510ISgaagetGluAlacagGinCC51Pro20tecgetcatPheAlaHisctgsectjeuThe25ateUeAsngetAlagcategAlaSsr30I"96tctggttctcatasagttaccctgtcttcttggtatcacgaccgcgg:1"SerGlySerHisLysValThrLeuSerSerTrpTyrHisAspGly354045t:gggetAla50tctSecsscs匸gAsnMet3CCThrctgtctLeuSeraacgg:aaa60ctgLeuaga_gttA工gVal19265cagGingacggtttcAspGlyPhetactac70ctgLeutacgetTy::Alasac:ccAsnlieSec75PheagacatArgHis30240HisgaaGluacctc二ThrSecGly35CccgetScrValCC3accgactacczgcagctgatggttThrAspTyrLeuGinLeuMetValSO952S8tacValLysTheSerI丄eLysI丄eProSerSerH丄s10010533CLidLeuMec336ggtGly115tc二Secaci3aactggLysAsnT::p120Asn1251"5heK二sShetact:tateaac;二ggtggtt二cttcaaac:ga^3>getgg::gaaTyrSerrieValGlyGlyPheP:，eLysLeuArgAlaGlyGluG丄vi130135432axetctatecaggtt=ctaacccttctctgctgsa=lieSecrisGinValSerAsnProSerLeuLeuAs145150155ProAspcagg&c480G丄nAsp二SOgetAlasecC3CTvr:PheS^ggect;:casaG丄yA_LaPhe乙ys165gtt:cagValGin1"AspAsp513<210>L2<211>口3<2L2>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述具有C至S突變的鼠0PGL殘基158—316和Hi:,標記的融合體12GluiAlaHisGinH丄sG丄nHisG丄nHis65GinPro20SecHis35TrpAlaLyslie50TyrValLysGlyPteAlaHisLeuThr25GinHisGinHisGin10工leAsnAlaAlaSec30GinAspGlyHisGluThr'SerLysValThrLeu40AsnMetThe55PheTycTyi:Leu70GlySerValPro85SerSerTcpTyrLeuSejcAsnGiy60HisAsp45LysLeuLysPro15UeProArgValTysAlaAsnSeePheArg75ThrAspTyrLeviGin30100U5Th-SerlieLy5lieProSe-SerHis105LeuMec95AsnLeu110His80MetThrLysAsr\Tcp120SerCUyAsnSerGluhs:*Usehe125TyrSerI丄eAsnVsLCUyGlyShsPheI//SLsuArg."aGl'/GluC-lu130Ui"0lie5srlieGin，"1SecAsnS^rLeuLsuAspProAspGinAsp14515D15SISC-Ala了hr了yrhe(SlyAlahs"/s、'slGinAspI丄eP^p170<210><220><223><:220><221><222><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>13564人工序列人工序列描述由導入破傷風類毒素P30表位而修飾的鼠0PGL殘基158—316與His標記的融合體CDSU).■(564)misc一結合(1)..M2)His標記misc一特征(43)-(3351鼠OPGL.殘基l58—255^sc—特征(337)--(3S9破傷風類毒素P30表位<220><221>misc一特征<222>(400了-(564)<223>歷^PGL,殘基262—316"00:>13atgaaacaccsacaccsac:accaaestcaacatcsacatcaassacct48MetLysHi3GinGinHisGinHisGinHisGinHisGinLysPrt)1510ISgccGlUAla5ecSlytgggetTcpAla50Asr.Gin55cacgaaHisG丄utacgetTyrValttcaacgettctAlaSer130tctateSeclietctSecIJLeThETyrSin:二cataccl".e入la:Us〉uTh::20。tHis3CCI丄e33agttacectg1^3ValThrI^uSectctascacgaccSerAsnMetTheLeu115HisG二nttcShe10O"70GlySecsecgecT卜丄ValLeuValVal柳HOsacGluAsnTycLeuTy:GlyGly150sac1SSg;:cttcAlaPhe.axeUstctgct:AlaAsr.g:tccssecValS二oThrstcUftLysIlCc-cccreggSerPheTrp120tggtctTrpSerGly135ttcttceaaPhePheLysccttctctgProSerLeu33agttC3gLysValGin135Asp30C=3c匸gLeuctg乙eu乙eu170AspSerA丄i155gacAspI"G丄y60ateLeuteaSec140getAlaFro三asat:gageggAspArgctgagaLeuAi:g匸S:CysG二iHisSheheArg95AsnLeusasgttLysValcaxt匸cHisPheGlyAspgasGluGluGinA3p175His80Va丄atgMetSertacatelie160get:AlaAsp361"132240238336334432480528564<210>14<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述由導入破傷風類毒素P30表位而修飾的鼠0PGL殘基158—316與His標記的融合體<400>"MetLysHisGinH丄sGinHisClnH丄sGinHisGinHisC-lnGluAlaGinPro.sMaHisLeuTh-IlaAsnAlaAlaSer202530SerGlySerH丄sLysVa丄ThrLeuSsrSerTrpTyrHisAsp3S4045TrpAlaLyslisSerAsnMet:ThrLsuSerAsnGlyLysLeu50'5560AsnGinAspGlyTyrTyrLeuTyrAlaAsnlieCysEhe657075H丄sGluAidSer130Ser工lsSclieThrTyr15ProThrS&rGlySerValProThrAspTycLeuGinLeu3590ValLysThrSer工le工lePro5ecSerHisAsn100105U0AsneheThj:ValSerPheTrpLeuArgValroLys115L20125HisLeuGluAsnTrpSerGlyAsnSerG丄uPheHisL35140Met95HisB0VaiLeuMetPheTyrAsnValGlyGlyPheheLysLeuArgAlaC-lyGluGlulie150155"0G丄nValSsj:A^nProSecLeuLeuAspProAspGinAspAla165170l"5PheG丄yAlaPheLysValG丄nAsplieAsp180185<210>15<211>5"<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有導入的破傷風類毒素P2表位的鼠0PGL殘基158—316與His標記的融合體<220〉<221>CDS<222>(1)..(546)<221>misc一結合<223:>Kis標記<220><221>misc—特征<222>i。)"T.(33。〈223〉鼠0PGL,殘基158—255<221>misc—特征<222>(382-.(S")〈222^鼠0PGL,殘基262—316<220><221>inisC-特征<222>(337",(38]J<223>破傷風類毒素P2表位<400>15atgaaa-accaacaccaacatcsaca:caacatcsacatcaaaaacct48MetLysHisGinHisGinHi3Glr*HisGinHisClnHisG丄nLysProL51015gaaget:cagccatecgetcatctgaccratesacgeegcatega仁ccct95GluAlaGinPcoheAlaHisLeuThrlieAsnAlaAlaSerI丄ePro202530tecggttctcatasagttaccctgtcttcttggtatcacgaccgcggc144SecGlySerHis:ysValThrLeuSerSerTrpTyrHisAjspAxgGly35404S匸gggetaaaate二ct:ascatgacec:gtctaacggtaaactgagagtt192TrpAlaLyslieSerAsnMetThrLeuSec*AsnGlyLysLeuArgVal505560aaccaggacg^tttc:actacctgtacgetaacatetgtttcagacat240AsnGlr\AspGlyheTyrTyrLeuTyrAlaAsnlieCysPheArgHis65707S80cacgaaacctct:ggcCctgttccsaccgactacctgcagctgatggtt2B8HisGluThrSerGlySerValProThrAspTyrLeuGinLeuMetVal85SO95tacgttVal3dS100cctateProIU工le1'35Gintct:-3escSecHisU0Leu占tgMetcagcacateaaagetaattegaaattcGin't'yrlieLysAlaAsnSerLysPhe115GlvitcacclieThr125GluctgLeu384tctU0aac;tctgasG丄uttc135catHisttcPheTyrSec1403"ValGlyGly"2tec145ttcPhe乙ys乙euArggetAla150GluGlulie155GinVa丄tctaac5erAsiiISO"0ProSerLeu=t;ggac乙euAsp165cca>gacAspgetMa170secttcggggectecAlaPhe175523GinAsplie130Asp"5<210>16<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述具有導入的破傷風類毒素P2表位的鼠0PGL殘基l58—316與His標記的融合體<400>16Met:LysHisGluAlaGinSerGlyTrpAla50AsnGinS535X5pGinHisGinHisG丄aHisGLn510ProPheAlaHisLeuThrlie2025HisLysValThrLeuSerSer40HisGluThrGinTyx:UsTrpSerG二y130lieAsrxMetThr55GlyPheTyrTyrLeu70SerGlySerValPro85LysThrProlie:Lys100Ii'/sAlaAsnSerI^ys120AsnSerG丄uHis135HisGinHisGinAsnAlaAlaSer30TrpTyrEisAsp45LysProISI丄eProI*euSecTyrMaAsnGlyAsnlie7Sl*ysLeuArgValCysPheThrAspTycLeuGinLeuSOArgHis80MetVal95lieGinSerSerHisAsciLeuMet10513L0ShelieGlyleTheGluLsuAsn125She'i，yi:SerUeAsnValGlyGlyPhePheLysLeuA::gAlaGlyGluSlulieSei:lieGir*Val5!e::Asn145150155i6GProSerLeuLeuProAspGinAspAlaThrT./:heGlyAlaPhe1701"LysvalGinAsprieAsp<210>二7<211>519<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述具有導入的破傷風類番素P2表位的鼠0PGL殘基l58—316與His標記的融合體<220><221>CDS<222>(1).-(513)<220><221>misc—結合<222>(1).7(42).<223>His標記<220><221>misc—寸寺征<222>(431,.(432)<223>鼠0PGL,殘基，58—287<220><221>roisc_特征〈223^鼠0PGL,殘基303—316<220>《Z21>misc一特征<222>M33丁…(4*77)<223>破傷風類毒素P2表位<則>17atgaascsccsacaccaacatcasMetLysHisGinHisGin卜:isGingaagetcagccaexcgetcanctgGluAlaGinProPheAlaHisLeu20catcsaestcsacatcaaasacct43HisGinHisGinHisGinLysPi:o1015accateaacgetgcategacccctThrlieAsnAlaAlaSecliePr。2530tctggttctcataaagtcaccctgtcttc仁tggtatcacgaccgcggtSerGlySerHis二ysValThrLeuSerSerTrpTyrHisAspArgGly3540451"tgggetTrpAla50LysSecAsnatgaccctgtc:aacggcdsactgagagttMetThrLeuSsrAsriGlyLysLeuArgVal55SOAsn65GingacAsp70tacctgtscgcr.tTyrLeuTyrAla75亡gtCys仁tcagsArgHis80240escHisGluseeThrt;ctSer3gt:二y35tctgttccaaccgactacctgcagctgatggt:SerValProThrAspTyrLsuGinLeuMetVa〗30952B3TyrVa丄ValLysTh:100tctateaaaateccacctt:csicatsacccgatgSerlieLyslieProSerSerHisAsnLeuMet105110a_saggtggctctssaaaceggtctggtaacLysGlyGlySerThrLysAsnTrpSerGlyAsn115120gasGlu125ttcC3tHisttc384taccctateaac5"ggtggtttc::::caaactgagagetggtgaagaaTyrSerlieAsnVslG丄yGlyShePheLysLeuArgAlaGlyGluGlu13013S140432ca^gGin145tscTyratelieaa在getLysAlas在t150:cgaaattcateSecIysPhe工leGly1553仁Clie3CCThrLeuAsp160480getacctacttcggg*gecttcaaagttcaggacategacAlaThrTyrPheGlyAlaEheLysValGinAsplieAsp乙65170513<210〉13<211>173<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述具有導入的破傷風類毒素P2表位的鼠0PGL殘基158—3l6與His標記的融合體<則>18MetLysHisGinHisGinHisGinHisGinHisGinHi3GinI*ys151015GluAlaGinProPheAlaHisLeuThrlieAsnAlaAlaSerliePro202530SecGlySecHisLysValThrLeuSecSerTrpTyrKisAspArgGly<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><221>ndsc—特征<222>(235]\.(S19)<223>鼠0PGL,殘基242—316<220><221>misc一特征<222>(232;..(294)<223>破傷風類毒素P30表位<綱>19MetLysHisGinC3lCHisGinHisGincat:HisGin10estHisGincatHisGin333Lys15cct48GlugetAlaGin20getAlacatHisLeuThr25atelieaacgetgC3AlatcgSex303tCliecctPro55tctSecggtGlytc二Ser35C3tHisLysgttVal3CC了hxLeu40tctSertcttggTrpTyrg在cAsp45cgcGlvtggTrpgetAla50atelieSerAsnatgMet55accThrctgLeutctSecaacgg=AsnGly60333LeuagaArgVal!■9265cagGinAspggtGlvtacTyr70tacctgLeutacTyi:getAlaa_tcAsnlie75ttc入snAsn80240ThrVa丄Seretc85TrpctgLeuagggtaValccg90LysValSergetAlatctSer95CELCHis288ctgLeuG丄uVal333Lys100axeThrtctateLyslie105tctteaSecSerHisAsn110ctg乙euMet336333LysggtggtGlyGlyUStctSecsecThi:Ly-AsntggTup120tctggtGlyGlu12SttcPheestHisttc3B4tctateSerlie130AsnValggtGlyggtGly135ttcttcaaactgagaLeuArg"0getAlaGlyGluGlu432atetctatelieSecI"145GingtttctSei:ISOcctProtctSerctgctggacLeu!>euAsp155ProgacAspG丄ngacAsp160480getacctacetcggggecttcaaagttcaggacategacAlaThrTyi:E>he(UyAlaPheLysValGinAsplisAsp165170519<210>20<211>173<2i2>RT<213>人工序歹lj<223>人工序列描述具有導入的破傷風類毒素P30表位的鼠0PGL殘基158—316與His標記的融合體<400>20MecLysHisGinHisGinHisGinHisGinHisGin1510GluAlaGinProPheAlaHisThrlieAsnAla2025SerGlyserHisLys、/alThrLeuSerSerTrpTyr3540TrpAlaLyslieSerAsnMetThrLeu5erAsnGl'/5055SOAsnGinAspGl:/h_eTy::TyrLeuTyrAlaAsn657075Ehei:hiValSerheTrpLeuArgValProLysVal8530LeuGluValLysThr工leLyslieProSerSer100105LysGlyGlySet:ThrLysAsnTrpSerGlyAsnSer!15120TyrSsrlieAsnValGlyGlyPhePheLysLeuArg130135"0lieSerlieGinValSerAsnPi:oSerLeuLeuAsp14S150AlaThrTyrPheGlyAlaPheLysValGinAsplie165170HisGinLysPro15AlaSerliePro30HisAspArgGlyLysLeuArgValCysPtveAsnAsn8GSea:AlaHisAsnGluPhe125SecHis95LeuMetHisPheMaGlyGluGluProAspAspGinAspISO<210>21<2il>S8<212>DMA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物agctgcaggtagtcggttggaacagaaccagaggtttcgtgaxgtctgaaacaga二g::a60gcgtacag<:210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物"00>22ctcatctgaccatcsacgctgcat<210>23<C211>64<212>DMA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>23tttcggtsccctcagccagaaagaaacggtgaagttgttgsaacagstgtt在gcgtacag60<210>24<211>Sl<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>24tgagggtaccgaaagtttctgcctctcacctggaagttaaaacccctatcaaaatccaat60<210>25<211>S3<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物"00>25tttcggtaccct:csgccagaaagaaac^gtttg<210>26<2U>S2<23L2>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>26tgagggtaccgaaagttcctgcttG:cacc<210>27<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>27tacctgcigctgatggtttscgttgtt"sctgatgcagtacatcaaag<210>28<211>83<212>DMA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>28tggaattcsgagttaccagaccagttcagt<210>29<211>49<212>DNA<213>人工序列gaagf-fgttssacsteaggttatgegsaga50S352acccctatcaaaacccaatcttcacataac6075teggtgataecgatgsatttcgaattaijci:6083<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>23gaa亡i:ccgaa匕ta^ctl:tgatgtactg:tc<210>30<211>53<212>DMA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>30gc仁3attcgaaat::atcggtatcacc:gaa<210>31<211>2S<212>DMA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>31<210>32<211>74<212>■<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成PCR引物<400>32agtggaattcagag:tac;:agaccagttttasgatgggattttg<210>33<211>65<212>DNA<213>Clostridiumtetanictggacgctacctacttcggggc532Stggtagaaccacctttcatcaggttatgtg6074<400>33actacctgcagc:;a仁ggttt:acgttgt:T:aaaacctccaccaaaaccccatc:tc:acata60acctg55<2:o>3415<212>PRT<213>Clos<400>GlnTy::lieLysAiaAsnSerLysPhe.lisGlylieThrGluLeu10IS<210>35<211>21<212>PRT<213>Clostridi'jmtetani<400>3SPheAsnAsnPheThrValSerPheTrpLeuArgVa二ProLysV"Sec151015AlaSerHisl*euGlu20權利要求1.一種衍生自動物OPGL多肽的OPGL類似物，其中引入了一個修飾，其結果是利用此類似物免疫動物誘導抗OPGL多肽抗體產生。2.如權利要求l的OPGL類似物，其中所述修飾導致大部分的OPGLB-細胞表位被保存下來，并且_——引入了至少一個外源的T輔助淋巴細胞表位(Th表位)，和域-一—引入了至少一個實現被修飾的分子定向至抗原呈遞細胞(APC)或B淋巴細胞的第一部分，和/或--引入了至少一個刺激免疫系統的第二部分，和/或———引入了至少一個優化被修飾的OPGL多肽呈遞給免疫系統的第三部分。3.如權利要求2的類似物，其中所述修飾包括以側鏈基團的形式經與OPGL或其亞序列中合適的化學基團共價或非共價結合而引入外源Th表位和/或第一和/或第二和/或第三部分。4.如權利要求3的類似物，其中所述修飾包括氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加。5.如權利要求4的類似物，其中所述修飾導致一融合多肽的產生。6.如權利要求4或5的類似物，其中引入的氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或添加導致OPGL的總體三級結構的大部分保留下來。7.如權利要求1-6中任一項的類似物，其中所述修飾包括至少一個OPGLB-細胞表位的重復和減引入半抗原。8.如權利要求2-7中任一項的類似物，其中外源T細胞表位在動物體內是免疫優勢的。9.如權利要求2-8中任一項的類似物，其中外源T細胞表位能結合大部分MHCII類分子。10.如權利要求9的類似物，其中至少一種外源T細胞表位選自一天然的T細胞表位和一人工的MHCII類分子結合肽序列。11.如權利要求10的類似物，其中天然的T細胞表位選自破傷風類毒素表位如P2和P30、白喉類毒素表位、流感病毒血凝素表位和惡性瘧原蟲(P/a/c^an/m)CS表位。12.如權利要求2-11中任一項的類似物，其中第一部分是B淋巴細胞特異性表面抗原或APC特異性表面抗原的特異的結合配偶體，例如在B淋巴細胞或APC細胞上有受體的半抗原或碳水化合物。13.如權利要求2-12中任一項的類似物，其中第二部分選自細胞因子、激素和熱休克蛋白。14.如權利要求13的類似物，其中細胞因子選自Y干擾素(IFN-Y)、Flt3L、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素12(IL-12)、白細胞介素13(IL-13)、白細胞介素15(IL-15)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、或者是其有效部分，而熱休克蛋白選自HSP70，HSP90，HSC70，GRP94和^網蛋白(CRT)，或者是其有效部分。15.如權利要求2-14中任一項的類似物，其中第三部分是脂類，如棕櫚酰基、肉豆蔻基、法呢基、香葉基-香葉基、GPI錨和N—酰基甘油二酯基。16.如前述權利要求任一項的類似物，其中所述修飾包括OPGL多肽或其亞序列在170-192的任一位置，198-218的任一位置，221-246的任一位置，256-261的任一位置，或285-316的任一位置被修飾，氨基酸位置號與SEQIDNO:4，6和12的任一個序列一致，或者OPGL多肽在171-193的任一位置，199-219的任一位置，222-247的任一位置，257-262的任一位置，或286-317的任一位置被修飾，氨基酸位置號與SEQIDNo:2—致，同時大部分的動物OPGLB-細胞表位被保存下來。17.如權利要求16的類似物，其中所述修飾包括用等長的或不等長的并且含有一個外源TH表位的一個氨基酸序列取代權利要求16中所闡明的位置的至少一個氨基酸序列。18.如權利要求17的OPGL類似物，其中含有外源TH表位的氨基酸序列取代SEQIDNO:4中256-261禾口/或288-302禾口/或221-241位氨基酸或SEQIDNO:2中257-262和/或289-303和/或222-243位氨基酸或221位的半胱氨酸被絲氨酸取代的一多肽中257-262和/或289-303禾口/或222-243位氨基酸。19.一種免疫原性組合物，包含-----免疫學有效量的動物自身OPGL多J太，所述OPGL多肽與免疫學可接受的佐劑配制在一起以破壞動物對OPGL多肽的自身耐受，此組合物還包含藥物學和免疫學可接受的載體和/或賦形劑，或—…免疫學有效量的如權利要求1_18中任一項的OPGL類似物，此組合物還包含藥物學和免疫學可接受的載體和/或賦形劑和任選地佐劑。20.—種編碼權利要求1-18中任一項的OPGL類似物的核酸片段。21.—種攜帶權利要求20的核酸片段的載體。22.如權利要求21的載體，其能自主復制。23.如權利要求21或22的載體，其選自由質粒、噬菌體、粘粒、微型染色體和病毒組成的組。24.如權利要求21到23任一項的載體，其在5'-3'方向和以可操作的連接方式包含驅動權利要求33的核酸片段表達的啟動子，任選地一編碼可使多肽片段分泌或結合在膜上的前導肽的核酸序列，權利要求33的核酸片段，和任選的終止子。25.如權利要求21到24任一項的載體，當被引入宿主細胞時，此載體可與或不與宿主細胞染色體整合。26.如權利要求24或25的載體，其中啟動子在真核細胞和/或原核細胞中驅動表達。27.—種攜帶有如權利要求21到26任一項的載體的轉化的細胞。28.權利要求27的轉化的細胞，其能夠復制權利要求20的核酸片段。29.如權利要求28的轉化的細胞，其是選自細菌、酵母、原生動物的微生物，或衍生自多細胞生物體如真菌的細胞，昆蟲細胞如S2和SF細胞，植物細胞和哺乳動物細胞。30.如權利要求27到29任一項的轉化的細胞，其表達權利要求33的核酸片段。31.如權利要求30的轉化的細胞，其分泌或在其表面結合權利要求1到18任一項的OPGL類似物。32.—種誘導抗OPGL抗體產生的組合物，此組合物包含-…權利要求20的核酸片段或權利要求21到26任一項的載體，禾口--藥物學和免疫學可接受的載體和域賦形劑和域佐劑。33.—種穩定的細胞系，其攜帶權利要求21到26任一項的載體并且表達權利要求20的核酸片段，且任選地分泌或在其表面結合權利要求1到18任一項的OPGL類似物。34.—種制備權利要求27到31任一項的細胞的方法，此方法包括用權利要求20的核酸片段或權利要求21到26任一項的載體轉化宿主細胞。35.—種鑒定被修飾的OPGL多肽的方法，該多肽能在未經修飾的OPGL多肽是其自身蛋白的動物物種中誘導產生抗未修飾的OPGL的抗體，此方法包括---通過肽合成或基因工程方法制備一系列彼此不同的被修飾的OPGL多肽，其中該動物物種中的OPGL多肽的氨基酸序列已被添加、插入、刪除或被取代了氨基酸，由此，在該系列多肽的氨基酸序列中包含對該動物物種是外源的T細胞表位，或者制備一系列編碼該一系列彼此不同的被修飾的OPGL多肽的核酸片段，-—測試該一系列被修飾的OPGL多肽或核酸片段中的成員的誘導該動物物種產生抗未經修飾的OPGL抗體的能力，禾口—-鑒別和任選地分離該一系列被修飾的OPGL多肽中的在該動物物種體內顯著引起抗未經修飾的OPGL抗體產生的成員，或鑒別和任選地分離由該一系列核酸片段中的在該動物物種體內顯著引起抗未經修飾的OPGL抗體產生的成員編碼的多肽表達產物。36.—種制備免疫原性組合物的方法，該組合物包含至少一個可在動物物種內誘導抗未經修飾的OPGL抗體產生的被修飾的多肽，在所述動物物種中未經修飾的OPGL多肽是其自身蛋白，此方法包括---通過肽合成或基因工程方法制備一系列彼此不同的被修飾的OPGL多肽，其中該動物物種中的OPGL多肽的氨基酸序列已被添加、插入、刪除或被取代了氨基酸，由此，在該系列多肽的氨基酸序列中包含對該動物物種是外源的T細胞表位，---測試該一系列中的成員誘導該動物物種產生抗未經修飾的OPGL抗體的能力，和-將該系列中在動物物種中明顯誘導可與OPGL反應的抗體產生的成員與藥物學和免疫學可接受的載體和/或賦形劑混合，任選地與至少一種藥物學和免疫學可接受的佐劑組合。37.如權利要求35或36的方法，其中所述系列成員包括制備彼此不同的核酸序列，每一核酸序列均為如權利要求20的核酸序列，然后將它們插入到合適的表達載體中，用此載體轉化合適的宿主細胞，表達所述核酸序列，任選地隨后分離表達產物。38.如權利要求37的方法，其中核酸系列和/或載體通過借助分子擴增技術如PCR或通過核酸合成的操作來制備。39.OPGL或其亞序列在制備負調節動物體內OPGL活性的包含佐劑的免疫原性組合物中的應用。40.OPGL或其亞序列在制備用于治療、預防或緩解骨質疏松癥或其他以骨再吸收過度為特征的疾病的包含佐劑的免疫原性組合物中的應用。41.權利要求1到18任一項的OPGL類似物在制備負調節動物體內OPGL活性的任選地包含佐劑的免疫原性組合物中的應用。42.權利要求1到18任一項的OPGL類似物在制備用于治療、預防或緩解骨質疏松癥或其他以骨再吸收過度為特征的疾病的任選地包含佐劑的免疫原性組合物中的應用。全文摘要本發明提供了負調節Osteoprotegerin配體(OPGL，TRANCE)的生物學活性的新方法，從而使得治療/緩解以骨質過度喪失為特征的疾病如骨質疏松癥成為可能。負調節是通過在需要的個體中誘導抗OPGL的免疫應答而實現。免疫應答可通過用OPGL的免疫原性變異體傳統免疫接種或用編碼OPGL變異體的核酸免疫接種而產生。本發明還涉及用于本發明的組合物、多肽和核酸，以及用于制備這些物質的載體和轉化的宿主細胞。文檔編號A61KGK101260152SQ20071019277公開日2008年9月10日申請日期1999年9月13日優先權日1998年9月15日發明者托本·哈爾基爾,杰斯珀·哈寧申請人:法麥克薩有限公司