鑒定用于細胞附著的配體的高通量方法

專利名稱：鑒定用于細胞附著的配體的高通量方法
技術領域：
本發明總體上涉及高通量篩選方法的領域。特別是，本發明涉及高通量篩選方法，所述方法可用于鑒定在細胞中引發想要的生物學反應的單一物質(single agents)的混合物和這些混合物中的單一物質。
背景技術：
已知附著依賴性細胞需要合適的允許細胞附著以使在體外細胞培養中存活的培養基質。一般地，培養基中的蛋白任意地固定在細胞培養基質的表面以形成細胞可以附著的層。細胞表面受體，例如，整聯蛋白，例如通過與細胞外基質(ECM)蛋白例如纖連蛋白作用來介導細胞附著至該蛋白層上，所述細胞外基質蛋白存在于該血清蛋白層中并且仍具有生物學活性。當細胞通過細胞表面受體-配體相互作用附著在表面時，在細胞內觸發了內部信號傳導途徑，最終確定所述細胞的命運，例如存活、增殖或分化。與體內生物學過程相反，由于非特異性地和任意地形成的血清蛋白層的原因，使用含于培養基中的血清蛋白將細胞附著在細胞培養基質上的不利方面是信號傳導途徑被非特異性地和任意地觸發。另一個不利方面是被吸附至來自培養基的基質上的蛋白可溶解回培養基中，從而離開表面，其進一步導致基質表面不分明。
在其它常規的細胞培養系統中，細胞可附著的蛋白可以蛋白包被(protein coatings)的形式存在，在將細胞加入細胞培養基之前，將所述蛋白包被應用于培養容器。作為包被被吸附至培養表面的蛋白可溶解回培養基中，從而離開培養表面。
對于用于在治療中醫治或治療人疾病的細胞，當細胞保持在體外培養時，希望控制細胞命運例如細胞存活、增殖和分化。因此控制細胞表面受體與存在于體外培養基質上的配體的相互作用是必要的。為了控制細胞表面相互作用，可用不允許細胞附著的多聚物包被合適的培養基質例如聚苯乙烯，即使在培養基中使用血清蛋白時。因此該包被消除了血清蛋白不受控制的和任意的吸附。然后將適合與細胞表面受體相互作用的生物學活性配體固定在該包被上，但同時保持所述配體的生物學活性。該概念是已知的。例如，已知使用透明質酸或algenic酸作為表面包被(coating)，可通過使用導致包被與細胞附著配體之間形成穩定共價鍵的化學反應將細胞附著配體固定在所述表面包被上。這防止了細胞附著配體溶解和離開表面。此外，所述包被自身不支持細胞附著。這描述于2002年9月30日提交的共同未決的、共同擁有的美國申請10/259,797。
已知研究一種被固定的配體和其在某個時刻對某種細胞類型的影響。然而，為了獲得想要的細胞命運，很可能需要細胞附著配體和外部因子的混合物。已知大量的細胞附著配體并且其用于細胞附著研究中。因此找到置于細胞培養表面以最優化給定細胞類型的細胞附著的恰當的細胞附著配體或細胞附著配體組合是件繁重的工作。
因此，在本領域存在對用于鑒定給定細胞類型的細胞附著配體和/或外部因子的更高通量的方法的需要。這對不能存活或只能通過在常規細胞培養系統中急劇改變其分化狀態才能存活的細胞是特別有益的，主要的實例是初級哺乳動物細胞。特別地，在本領域存在對統計實驗設計的需要，所述實驗設計可用于系統地研究因子混合物之間的相互作用，所述因子是為獲得給定的細胞類型的想要的命運所必需的。
發明概述本發明提供了用于鑒定能夠在整個細胞中產生目的生物學效應的物質(agent)的高通量方法。特別地，所述方法包括步驟提供具有培養表面的容器；根據統計設計將單一物質的不同的混合物放入選擇的容器中；和將該單一物質的混合物固定在培養表面上。所述方法進一步包括將被固定的物質與完整的細胞接觸；和獲取表示被接觸細胞中目的生物學反應的數據。所述方法也包括使用由獲得的數據統計模建(statistical modeling)來確定哪種單一物質的混合物和/或這些混合物中的哪種單一物質對在被接觸的細胞中產生目的生物學反應有效。
附圖簡述

圖1是用于本發明的優選的步驟的示意說明圖。
圖2是實例性受試孔的示意說明圖。
圖3是96孔板布局(layout)的示意說明圖，其包含單一物質的不同的混合物。通過使用統計設計產生該布局，其中設計中的總因子(generic factor)各代表單一物質。
圖4是96孔板布局的示意說明圖，其包括單一物質的不同的混合物。通過使用統計設計建立該布局圖，其中設計中的總因子(genericfactor)各代表物質的混合物。
圖5是可用于產生本發明方法的統計設計的方案的示意說明圖。
圖6是可用于產生本發明方法的統計設計的進一步方案的示意說明圖。
圖7是數據表(spreadsheet)，其顯示使用圖6中的方案產生的96孔板布局的混合設計，其中按存在的因子的數目來分配孔中總的流體體積。
圖8顯示基于圖7中的數據表的統計設計建立的96孔板布局。
圖9是附著在96孔板的孔中的熒光標記的細胞的熒光顯微圖象，所述96孔板具有圖8顯示的布局。
圖10是在分析圖9的顯微圖象后獲得的細胞核計數對孔編號的圖表。
圖11是使用來自圖6-10的信息的混合模型分析獲得的Ln(細胞計數-無血清+1)對來自參照混合物的偏差的圖表。
圖12是使用來自圖6-10的信息的混合模型分析獲得的Ln(細胞計數-10％血清+1)對來自參照混合物的偏差的圖表。
圖13是顯示用于96孔板布局的Plackett-Burman統計設計的數據表。
圖14顯示圖13中的統計設計中的因子的鑒定。
發明詳述如此處所定義的，“物質(agent)”是結合細胞并調節靶細胞或組織存活、分化、增殖或成熟的生長效應物分子。用于本發明的合適物質的實例包括生長因子、細胞外基質分子、肽、激素和細胞因子。
術語“固定物質的材料”此處定義為可用作培養表面和某一物質之間連接的生物相容性多聚物。
如此處所定義的，術語“固定”、“被固定的”等是指使物質，即，生長效應物分子固定在培養表面，例如孔表面或包含于孔中的支架的表面。該術語包括所述物質被動吸附至培養表面和所述物質直接或間接地共價附著至培養表面。
“因子”是實驗中變量的名稱，其代表實驗從一個試驗或運行(run)(針對例如，一個孔)到下一個發生變化的事物。在本發明中，“因子”是單一物質或單一物質混合物的總名稱(generic name)。根據統計設計將因子組合以在實驗中形成不同的混合物。
“統計設計”，如此處所定義的是指實驗設計，所述設計幫助用戶發現產生最優實驗結果的可調節變量(即，因子)組合，其顯著地減少獲得該目的所需的實驗次數。本發明中，通過使用代表被測物質的總因子名稱來產生合適的統計設計。所述設計包括因子水平，所述因子水平可以是因子的量和/或濃度或可被轉化成因子的實際量和/或濃度。所述設計也包括被編號的實驗運行(run)。實驗運行明確說明要被檢驗的因子的組合和其水平，并且各對應例如多孔板上的單個孔。可將實驗運行標繪在總的多孔板上的孔上。
如此處所用的，術語“預處理”、“經預處理的”是指在表面或其它基質上加上官能團，所述官能團通過化學作用參與隨后與固定物質的材料(即，生物相容性多聚物)形成的共價鍵。例如，可將微量滴定孔的表面進行氨基-等離子(plasma)處理以產生在其上可連接固定物質的材料的富含胺的表面。
如上所述，本發明涉及用于鑒定能夠在完整細胞中產生想要的生物學反應的物質的高通量方法。該方法包括步驟提供具有培養表面的容器；根據統計設計將單一物質的不同混合物置于選擇的容器中；將單一物質的混合物固定至培養表面；和將所述被固定的物質與完整的細胞接觸；所述方法進一步包括獲取表示被接觸的細胞中想要的生物學反應的數據；和通過使用由獲得的數據的統計學模建來確定哪種單一物質的混合物和/或這些混合物中的哪種單一物質對在被接觸的細胞中產生想要的生物學反應有效。在一個目的實施方案中，想要的生物學反應可選自下列細胞附著、細胞存活、細胞分化、細胞成熟、細胞增殖和其組合。
如上所述，為獲得想要的細胞命運可能需要單一物質的混合物。已知大量的生長效應物。例如，結合細胞表面受體或通過離子通道或轉運蛋白被吸收并調節這些細胞存活、分化、增殖或成熟的生長效應物分子包括生長因子、細胞外基質分子、肽、激素和細胞因子，其中存在許多實例。因此找到置于細胞培養表面以獲得給定的細胞類型的想要的細胞命運的恰當的生長效應物或生長效應物組合是件繁重的工作。
本發明通過提供更高通量的方法解決了本領域的需要，所述方法用于鑒定在給定的細胞類型中引起想要的生物學反應的物質的混合物。
在本發明方法的優選的實施方案中，單一物質的混合物被共價地固定在培養表面例如容器表面上的固定物質的材料上。本發明也涉及可將單一物質的混合物被動地吸附至培養表面。固定物質的培養表面也可以是包含于容器內的支架。
現參照圖1，顯示了優選的實施方案，其中容器10提供了表面12，所述表面可經氨基-等離子處理以產生在其上可附著固定物質的材料16的胺化表面14。如下面更詳細描述的，固定物質的材料16優選地是已與胺化的表面14連接的生物相容性多聚物。單一物質20例如20a-d的混合物18理想地共價固定至固定物質的材料16。
現參照圖2，根據本發明，將單一物質不同的混合物置于根據統計設計的容器中，所述設計在下面進行更詳細的描述。如圖2所顯示的，容器10a中的物質20a-d的組合物與第二容器10b中的不同，在容器10b中組合物包含單一物質20e-h。然而要注意的是，一個以上的容器可以包含相同的物質。例如，本發明涉及當被某種其它物質組合包圍時給定的物質可對獲得想要的細胞命運起正效應，而當被不同的物質組合包圍時該相同的物質可能對獲得想要的細胞命運起中性效應或不起作用，因此，提供物質與其它物質的不同組合對獲得這些效應是有益的。再次參照圖2，根據統計設計，當將物質20以不同的混合物放置在不同的容器10中時，這些混合物18與完整細胞22接觸。物質20結合細胞22并且能夠在被接觸的細胞中產生一種或多種想要的生物學反應。基于獲得的實驗數據確定關于給定的物質混合物或混合物內單一物質對在細胞類型中引起想要的反應的效果的測定。使用方法，包括但不限于免疫細胞化學分析、顯微鏡法或功能性測定法，可獲得所述數據。
現參照圖3-6，現更詳細地描述統計設計方面。特別地參照圖3，顯示了對應于96孔板24的孔的容器10。該96孔板由A-H行和1-12列組成。如圖3所示，由總因子名稱代表圖1和2中單一物質20或混合物18的鑒定是本發明的一個方面。所述因子是實驗中的變量。
例如，如圖3所顯示的，總因子(generic factor)1-10代表10個在框28中標出的單個細胞外基質蛋白。在該實例中，總因子1是I型膠原蛋白、總因子2是III型膠原蛋白等。這些因子中的各因子可與一種或一種以上其它因子組合產生用于板布局的混合物。
現參考圖4，本發明也涉及這些總因子1-10可能各代表一種以上的物質。例如，如框30中標明的，在該實例中總因子1表示I型膠原蛋白和纖連蛋白的混合物；總因子2表示III型膠原蛋白和玻連蛋白的混合物等。這些總因子中各因子可類似地與其它總因子組合產生用于板布局的復雜混合物。
現就圖3顯示的實施方案描述圖5和6，其中總因子1-10中的每一個對應著給定濃度的單一物質。
如在圖5中示意性顯示的，提供了如下的方案，其中容器10中的總流體體積被分配至10個等體積的區室32中。96孔板的各孔可包含所有10個因子(例如，單一物質)或這些因子的子集(subset)。如圖5a中顯示的，在第1種情況中，存在所有10個因子，并且10個因子占據了流體區室32。圖5a顯示的孔10中的總因子濃度是[10/10]＝[1]。這提供了每孔等于[1]的因子總濃度。圖5b表實例如相同96孔板上的不同孔。在該情況(第2種情況)下，只出現10個因子中的5個。同樣，將流體體積分配至10個相等的區室32中。在第2種情況下，當因子存在時，流體區室填充有該因子。然而，在第2種情況下，10個體積區室外中有5個未填充有因子，而是填充有“位置支架(place holder)”，例如培養基。在圖5b的第2種情況中，總因子濃度等于
。因此，顯示于圖5b中的孔中的總因子濃度是每孔
因子。第1種情況中的總因子濃度與第2種情況中的總因子濃度不相等。因此，在本發明的一個實施方案中，各容器中的總物質濃度可以是不同的。此外，在第1和第2種情況中，孔之間的單一因子的濃度是相同的。例如，可代表單一I型膠原蛋白配體的因子1的濃度在孔之間是相同的。
現參照圖6，提供了另一種方案，其中對表面化學要求給出了特別的考慮。特別是在該方案中，因子的總密度在各孔間保持恒定，并且只允許孔間的因子組成發生變化。換句話說，因子的濃度在孔間可以不同，但各孔具有相同數量的總的被固定的因子。如圖6所顯示的，基于存在的因子數目分配存在于給定的孔中的總流體體積。同樣，為了簡化，我們可假定一個因子對應于一個單一物質，盡管本發明不限于該種情況。如圖6a所顯示的，存在所有10個因子并且總因子濃度等于[10/10]＝[1]，總因子濃度為每孔[1]因子。在圖6b中，10個因子中只有5個存在，但這5個因子中各因子的流體體積32是圖6a顯示的各因子體積32的2倍。因此，顯示于圖6b中的總因子濃度與圖6a中顯示的相同，總濃度為每孔[1]因子。因此，在本發明的一個實施方案中，各容器中物質的總濃度是相同的。基于圖6，可以看出盡管顯示于圖6a的孔和顯示于圖6b中的孔之間的總因子濃度是恒定的，但這些孔間的單一因子的濃度可以是不同的。特別地，對于可表示I型膠原蛋白的因子1，圖6b中該單一物質的濃度將是圖6a中顯示的濃度的2倍。因此，在本發明的進一步實施方案中，容器間的單個物質的濃度不同。
要注意的是，描述于圖5和6中的各方案是可行的并且可用于篩選細胞附著配體，但使用顯示于圖6中的方案進行下面的實施例部分提出的經統計設計的實驗。
本發明提供了如下的方法，所術方法使用形式例如96孔板形式就物質在細胞中引發想要的反應的能力平行地篩選大量物質的不同的混合物。在一個實施方案中，所述方法包括根據統計設計將物質不同的混合物放入多孔板的選擇的孔中。所述方法可進一步包括將單一物質放入其它的孔中的步驟。隨后將所述物質固定至培養表面，例如孔表面。所述方法也包括將含有細胞類型的流體樣品遞送至孔。在合適的溫育時間后，在不同孔中的細胞和樣品之間，可直接或間接地檢測到細胞和孔成分之間相互作用的跡象。例如，使用功能性測定法、免疫細胞化學法或顯微鏡法可獲得數據。
用于本發明的合適的統計設計包括(但不限于)下列分級析因設計(fractional factorial design)、D-最優化設計(D-optimal design)、混合設計(mixture design)和Plackett-Burman設計。在一個優選的實施方案中，統計設計是混合設計。在另一個實施方案中，設計是基于范圍標準(coverage criteria)、點陣設計(lattice design)或拉丁方設計(latin square design)的空間充滿設計(space-fillingdesign)。
在想要的實施方案中，用固定物質的材料包被可能經預處理的培養表面。所述固定物質的材料理想地是生物相容性多聚物，其不支持細胞附著并可用作培養表面和物質之間的柔性連接(系鏈(tether))。合適的多聚物的實例包括合成的多聚物如聚環氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酰胺和天然的多聚物例如透明質酸和algenic酸。
在想要的實施方案中，培養表面選自，但不限于下列聚苯乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚環氧乙烷、玻璃、聚硅酸鹽、聚碳酸鹽、聚四氟乙烯、氟碳和尼龍。本發明也涉及培養基質可完全或部分地包含生物可降解材料例如聚酐、聚乙醇酸、多羥基酸例如聚乳酸、聚乙醇酸和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚原酸酯、聚羥基丁酸酯、含磷腈、聚富馬酸丙酯和生物可降解聚氨基甲酸酯。
可對物質可吸附的或連接的培養表面進行預處理。例如，通過多聚物在氨環境中的等離子放電處理可制備帶伯胺的細胞培養表面。然后通過使用標準的固定化學將固定物質的材料共價地附著至這些胺化的表面，如在2002年9月30日提交的共同未決的、共同擁有的美國申請10/259,797中所描述的，其全文在此引用作為參考。商業上用于產生組織培養處理的聚苯乙烯的兩個方法是大氣等離子處理法(atmospheric plasma treatment)(也稱作冠狀放電法(coronadischarge))和真空等離子處理法，各方法在本領域是熟知的。等離子是氣態離子和自由基的高反應性混合物。氨基等離子處理或氧/氮等離子處理可用于產生富含胺的表面，通過使用如美國申請10/259,797中所描述的碳二亞胺生物綴合化學法可將生物相容性多聚物例如透明質酸(HA)或algenic酸(AA)通過羧基基團連接在所述表面上。所得的表面不允許細胞附著，即使在細胞培養基中存在高濃度例如10-20％血清蛋白濃度的情況下。可用于通過固定物質的材料共價連接物質的經預處理的組織培養聚苯乙烯產品的實例是PRIMARIATM組織培養產品(Becton Dickinson Labware)，其是通過使用氧聚苯乙烯的氧-氮等離子處理產生的并且其導致包含氧和氮的官能團例如氨基和酰胺基團的摻入。
然后可將物質例如細胞外基質蛋白、肽等共價地連接至上述的HA或AA表面，通過利用蛋白/肽上的胺基團和HA或AA上的羧基基團或通過使用例如高碘酸鈉氧化作用在HA或AA上產生的醛基來實現連接。
例如，人胎盤的透明質酸的末端糖可通過描述于E.Junowicz和S.Charm，″The Derivatization of Oxidized Polysaccharides forProtein Immobilization and Affinity Chromotography，″Biochimicaet.Biophysica Acta，Vol.428157-165(1976)的高碘酸鹽方法激活，所述文獻此處引用作為參考。該方法要求向透明質酸溶液中加入高碘酸鈉或高碘酸鉀，從而激活末端糖，其可化學交聯至物質的游離氨基例如細胞外基質蛋白上的末端氨基。在另一個優選的實施方案中，通過使用碳二亞胺作為交聯劑可將生物相容性多聚物(例如，HA或AA)上的游離羧基基團化學交聯至物質的游離氨基。其它標準的固定化學方法對本領域技術人員來說是已知的并且可用于將培養表面與生物相容性多聚物連接和將生物相容性多聚物與物質連接。例如，參見″ProteinImmobilizationFundamentals and Applications″Richard F.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991)或2002年9月30日提交的共同未決的美國申請10/259,797。
要注意的是，盡管通過生物相容性多聚物將試劑與胺化的組織培養表面連接包括本發明的一個實施方案，但可以使用標準的固定化學法通過生物相容性多聚物將這些物質連接至羧化表面或羥化表面。附著劑的實例是溴化氰、琥珀酰亞胺、醛、甲苯磺酰氯、親和素-生物素、可光致交聯劑、環氧化物和馬來酰亞胺。
如上所述，在選擇的容器內包含物質混合物是本發明的一個方面。此外，其它容器可含有單一物質是本發明的其它方面。可將這些物質單獨地或與以組合方式連接至經預處理的組織培養表面。所述物質可以任何所需的比例組合。可通過例如包被組合物中物質的濃度來控制存在于培養表面的不同物質的相對量。可選擇地，通過調節結合至培養表面的生物相容性多聚物的能力來控制荷載密度。這可以通過例如控制多聚物上可與所述物質反應的反應性基團數目或通過控制培養表面上生物相容性多聚物的密度來實現。此外，首先可將所述物質分別地連接至生物相容性多聚物(系鏈)，然后以所需的比例混合“已荷載”系鏈，并將其連接到經預處理的基質上。
如上所述，優選地通過生物相容性多聚物將所述物質共價固定在經預處理的組織培養表面，理想地其富含胺。然而，要注意的是，本發明涉及非共價地將所述物質固定在表面，以這種方式可通過將所述物質被動地吸附至表面來將所述物質固定在培養表面(例如，孔表面)。本發明也涉及可將所述物質固定在支架上或注入支架內，所述支架可放置于容器內并且與包含細胞的流體接觸。用于本發明的合適支架和將物質固定于其上或其內的方法描述于2002年9月30日提交的共同未決、共同擁有的美國申請10/259,817，其全文在此引用作為參考。
除了理想地是組織培養皿、多孔板、培養瓶、試管和滾瓶外，用于本發明的容器可采用任何常用的形式。構型如微量滴定孔和試管的裝置在本發明中特別有用，其允許以有效和方便的方式手工進行大量樣品的同時測定。通過使用例如微量滴定孔也可以自動化進行，由于自動移液器和平板讀出計的存在使得測定能夠更廣泛地自動化。也可使用其它固相，特別是其它塑料固體支持物。
要注意的是，本發明的方法步驟可以容易地自動化。對于以微量滴定板為形式的尤其如此。因此，在本發明的一個實施方案中，容器可以包括96孔微量滴定板的孔。用于微量滴定板的自動化的移液設備(用于試劑的加入和清洗步驟)和顏色讀出計也已存在。用于進行本發明的自動化設備的實例可以包括移液臺和檢測裝置，所述的移液臺能夠在恒溫環境(即，溫控環境)中在特定的時間點上向孔加入或移出試劑。
如上所述，用于本發明的物質是能結合細胞表面上的受體的或通過離子通道或轉運蛋白被吸收的并且調節靶細胞或組織生長、增殖或分化的生長效應物分子。在一個實施方案中，這些物質是細胞附著配體和/或外部因子。在理想的實施方案中，所述物質可以是細胞外基質蛋白、細胞外基質蛋白片段、肽、生長因子、細胞因子和其組合。
優選的物質是生長因子和細胞外基質分子。生長因子的實例包括，但不限于，血管內皮來源的生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板來源生長因子(PDGF)、轉化生長因子(TGFα、TGFβ)、肝細胞生長因子、肝素結合因子、胰島素樣生長因子I或II、成纖維細胞生長因子、促紅細胞生成素神經生長因子、骨形態發生蛋白、肌形態發生蛋白和其它本領域技術人員已知的因子。其它合適的生長因子描述于例如″Peptide Growth Factors and Their Receptors I″M.B.Sporn和A.B.Roberts，Eds.(Springer-Verlag，NY，1990)。
使用本領域已知的方法可從組織中分離生長因子。例如，可從組織中分離生長因子或通過重組方法產生生長因子。例如，可從小鼠的頜下腺分離EGF，Genentech(South San Francisco，CA.)通過重組方法產生TGF-β。其它生長因子也可以天然的和重組的形式從供貨商例如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)、R&D Systems(Minneapolis，MN.)、BD Biosciences(San Jose，Ca.)和InvitrogenCorporation(Carlsbad，CA.)商購獲得。
用于本發明的合適的細胞外基質分子的實例包括玻連蛋白、腱生蛋白、血小板反應蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白和蛋白聚糖。其它細胞外基質分子描述于Kleinman等人，″Use of ExtracellularMatrix Components for Cell Culture，″Analytical Biochemistry 1661-13(1987)，或對本領域技術人員來說是已知的。
用于本發明的另外的試劑包括細胞因子，例如白細胞介素和GM集落刺激因子，和激素例如胰島素。這些描述于文獻中并且可商購獲得。
用于本發明的細胞可以是任何能夠有效地對所述物質起反應或其生長需要所述物質的細胞。例如，可從已建立的細胞系獲得細胞或從分離的組織中分離細胞。合適的細胞包括大多數上皮和內皮細胞類型，例如，實質細胞例如肝細胞、胰島細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、成骨細胞、外分泌細胞、腸來源的細胞、膽管細胞、甲狀旁腺細胞、甲狀腺細胞、腎上腺-下丘腦-垂體通路(access)細胞、心肌細胞、腎上皮細胞、腎小管細胞、腎基底膜細胞，神經細胞、血管細胞、形成骨和軟骨的細胞和平滑和骨骼肌細胞。其它有用的細胞可包括干細胞，其可經歷響應選擇的物質混合物而產生的表型變化。其它合適的細胞包括血細胞、臍帶血來源的細胞、臍帶血來源的干細胞、臍帶血來源的祖細胞、臍帶來源的細胞、胎盤來源的細胞、骨髓來源的細胞和羊膜液來源的細胞。所述細胞可經遺傳工程改造。在優選的實施方案中，可用如下物質培養細胞，所述物質能通過生物相容性性多聚物連接至培養基質例如96孔微量滴定板的孔表面。可使用許多熟知的細胞培養技術例如描述于Freshney，″Cell Culture，A Manual of Basic Technique″第3版(Wiley-Liss，NY，1994)中的技術中的任一種培養這些細胞。其它細胞培養基和技術對本領域技術人員來說是熟知的并且可用于本發明。
現描述根據本發明的統計設計的實驗。
實施例實施例1透明質酸與富含胺的組織培養表面的連接Becton Dickinson Labware使用氧/氮等離子體產生PRIMARIATM組織培養產品。特別地，聚苯乙烯產品的氧/氮等離子體處理導致含有氧和氮的官能團例如氨基和酰胺基團的摻入。為進行該實驗，使用本領域熟知的碳二亞胺生物綴合化學法將HA通過HA上和羧基基團連接至PRIMARIATM多孔板上富含胺的表面，例如描述于″ProteinImmobilizationFundamentals and Applications″Richard S.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991)或描述于2002年9月30日提交的共同未決的美國申請10/259,797中的方法。
實施例2ECM蛋白與透明質酸的連接將ECM物質共價地附著在與培養表面連接的HA多聚物上。特別地，通過使用描述于E.Junowicz和S.Charm，″The Derivatization ofOxidized Polysaccharides for Protein Immobilization and AffinityChromotography，″Biochimica et.Biophysica Acta，第428卷157-165(1976)的高碘酸鹽方法進行氧化反應在HA上產生醛基基團。該方法要求向HA溶液中加入高碘酸鈉，從而激活末端糖。接著，通過使用標準的固定化學方法例如描述于″Protein ImmobilizationFundamentals and Applications″Richard F.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991)或2002年9月30日提交的共同未決的美國申請10/259,797中的方法將激活的HA與ECM蛋白上的胺基連接。
實施例3使用統計設計的實驗(混合設計)同時篩選10種不同的ECM蛋白在本實施例中，統計設計是混合設計。該設計被用于鑒定對細胞反應具有正效應的因子對或單一因子，并允許我們觀察兩個ECM之間的相互作用。在該實施例中，使用10種單一的ECM(各代表單一“因子”)產生ECM混合物，用于如圖3所示將所述混合物置入96孔板的孔中。所述ECM共價地附著在培養表面的生物相容性多聚物上(參見實施例1和2)。要注意的是，如果沒有針對實驗的統計設計，將需要進行210(1024)個單獨的實驗或需要11個96孔板來檢驗與其它針對給定的細胞類型的因子一起的10種ECM的每一個。
在該實施例中，選擇一組10個附著配體和選擇96孔板用作該篩選形式。為消除由于不均勻蒸發造成的邊際效應，在實驗中只使用96孔板的內部60個孔。從而在板的較外側的行和列中的孔可用于合適的對照。
基于其用作細胞培養試劑的常見用途、商業可購得性和價格，選擇下列10種附著配體I型膠原蛋白(CI)、III型膠原蛋白(CIII)、IV型膠原蛋白(CIV)、VI型膠原蛋白(CVI)、彈性蛋白(ELA)、纖連蛋白(FN)、玻連蛋白(VN)、層粘連蛋白(LAM)，多聚賴氨酸(PL)和聚鳥氨酸(PO)。
特別考慮到表面化學要求開發統計設計。特別地，在該實驗中，使用圖6所示的方案，其中在各孔間保持恒定的總附著配體密度并且只允許改變附著配體的組成。換句話說，孔與孔間的單一附著配體的濃度可以不同，但各孔具有相同的總的被固定的附著配體量。上面更詳細地描述了該方案。該設計的實例顯示了圖7中的電子數據表。圖7中的最上行列出了10種用于該特定篩選的細胞附著配體。第1列是實驗點目錄，其可翻譯成96孔板中(例如在該情況下是52個孔)的孔。電子數據表中的數字是加入至特定孔中的因子的實際體積(以μL計)。在該特定的設計中，將因子以三種體積例如5μL、25μL或50μL加入孔。在該情況下總的孔體積是50μL。因此，對于在其中以50μL加入一種因子的孔，最終的孔組合物包含共價地固定在孔表面的單一附著配體。因此，如果將25μL因子加入孔，那么也加入25μL第二因子，最終孔組合物將包含共價地固定在孔表面的兩種不同細胞附著配體的混合物。當加入5μL因子時，也將其它9種因子以各5μL加入，從而導致在孔中包含孔表面的所有10種細胞附著配體的混合物。這些含有所有10種附著配體的實驗點稱作“中點(mid point)”并且是該實施例中統計設計的完整部分(integral part)。
參照圖8，顯示了96孔板布局，其從圖7所示的特定統計設計翻譯過來。特別地，96孔板包含圖7中所示的孔組合物，例如固定在各孔底部的細胞附著配體組合。特別地，圖7中的實驗運行如下對應著圖8中的行/列圖7設計中的運行1-10分別對應著圖8中的平板布局中的B行，2-11列；運行11-20表示C行，2-11列；運行21-30表示D行，2-11列；運行31-40表示E行，2-11列；運行41-50表示F行，2-11列；運行51和52分別表示G行，第2和3列。如圖7中的統計設計和圖8中相應的96孔板布局所示，除了物質的混合物外，也可將單一試劑置于容器中也是本發明的實施方案。
實施例4特異性針對MC3T3-E1成骨細胞的ECM篩選MC3T3-E1細胞，來源于Dr.L.D.Quarles，Duke University，和由University of North Carolina at Chapel Hill的Dr.Gale Lester友好提供。使用標準細胞培養技術培養這些細胞。MC3T3-E1是良好表征的和快速生長的成骨細胞細胞系，其之所以被選擇是因為其迅速地附著至大多數普遍使用的組織培養表面。
根據本領域已知的方法使用胰蛋白酶-EDTA將細胞從細胞培養瓶中移下來。計算細胞數目，離心并重懸于不含血清的培養基中或重懸于含有10％胎牛血清的培養基中。根據圖8所示的和上面實施例3中描述的布局將細胞置于96孔板的孔中。播種密度大約為每孔10,000個細胞。將細胞在平板上37℃下溫育過夜。第二天，除去培養基和任何未附著在被在孔表面上被固定的物質上的細胞。通過將任何附著的細胞暴露于甲醛中至少15分鐘進行固定。使用碘化丙錠(propidium iodite)熒光標記所述的被固定的附著細胞的核。使用熒光顯微鏡(Discovery-1，Universal Imaging Corporation，a subsidiary of Molecular Devices，Downingtown，PA.)獲取附著在ECM篩選板的孔上的熒光標記的細胞的圖象。獲自96孔板的圖象的實例顯示于圖9中。特別地，該布局與圖8中顯示的相同，除了G行，4-11列用作對照孔。在圖9中，將存在于含有10％胎牛血清的培養基中的MC3T3-E1細胞放入含有物質混合物的孔中，所述物質混合物已被連接至透明質酸表面，除了孔G4-G9只含有透明質酸表面和孔G10和G11只包含組織培養級的聚苯乙烯。如所期望的，只有孔G4-G9中的透明質酸表面阻止細胞附著。在該實施例中，在孔G10和G11中對聚苯乙烯表面的細胞附著非常少。相反地，如可通過大量的白點觀察到的，一些含有細胞附著配體的孔顯示很強的細胞附著，各點代表附著細胞的細胞核。
使用圖象分析軟件包(Meta Morph，Universal ImagingCorporation，a subsidiary of Molecular Devices，Downingtown，PA.)對圖9中熒光標記的細胞核進行計數，在不含胎牛血清的培養基和含有10％胎牛血清的培養基中的細胞核計數結果顯示于圖10。在圖10中，孔1-10對應于圖9中的B行，2-11列；圖10中的孔11-20對應于圖9中的C行，2-11列等。
在圖10中，在10％胎牛血清存在的情況下，在許多孔中觀察到細胞附著。在無血清的情況下，細胞附著減少，但仍能在許多孔中觀察到細胞附著。在兩種情況中，在一些根據統計設計的實驗的含有細胞附著配體的孔中的細胞附著超過培養在普通的(plain)組織培養級聚苯乙烯(圖9中的孔59和60)中的細胞的細胞附著。所得結果使得能夠鑒定大量優于組織培養級聚苯乙烯(最常用的細胞培養支持物)的支持MC3T3-E1附著的表面。
為了最優化表面，可遵從兩個指導，例如，“最優孔”組成或“最優因子”。根據對實驗結果進行嚴格的統計學分析確定“最優因子”。
在“最優孔”方法中，選擇具有最優實驗結果的孔進行進一步優化。在圖10所示的實施例中，可選擇具有最多細胞核數目的孔40(或孔E11)。根據圖8所示的平板布局圖，該孔含有VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白的混合物。基于最初的使用模型ECM(纖連蛋白)用MC3T3-E1進行的濃度依賴性研究，選擇用于ECM篩選板制備中的固定步驟中的VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白的濃度。要注意的是，在研究中對一種細胞類型最優的濃度可能對另一種細胞類型不是最優的。此外，對給定的細胞類型來說是最優的特定ECM濃度可能對另一種ECM來說不是最優的濃度，即使使用了相同的細胞類型。類似地，“hit孔”中的混合物組成可能不是最優的。例如，孔E11(其是“最優孔”)的表面包含50/50的VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白的混合物。可進行后續實驗以最優化選擇用于固定步驟的兩種配體的濃度以及最優化與給定的細胞類型的“hit”孔表面結合的混合物的組成(50/50混合物可能不是最優組成)。
在“最優因子”方法中，使用統計學模型分析實驗結果。對于上述實施例，MC3T3-E1數據的混合模型分析顯示如圖11所示，在無血清的情況下，當大量存在時，膠原蛋白IV、層粘連蛋白和多聚L賴氨酸(邊際效應)表現增加細胞計數。所有線都交叉的點對應于中點(mid-point)，其中存在所有10種ECM，各5μL。該圖提供了關于細胞計數如何變化的指示，其依賴于孔組成偏離該參照“中點”混合物多遠。如可以看到的，隨著IV型膠原或層粘連蛋白量的增加，細胞計數也增加。
現參照圖12，在10％血清的情況下，圖11中看到的多聚L賴氨酸的任何效應減少，只有IV型膠原和層粘連蛋白繼續顯示對細胞計數的正效應。
要注意的是，“最優孔”和“最優因子”方法都是有效的，但各方法可導致不同的表面組成。在本實施例中，“最優孔”方法將導致包含VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白的表面，而“最優因子”方法可導致含有VI型膠原蛋白和層粘連蛋白的表面。
實施例5使用根據統計設計的實驗(Plackett-Burman設計)篩選30種不同的物質設計本實施例描述如圖13(a-d)中所示的通過使用從SAS Institute(Cary，NC)商購獲得的軟件包JMPTM產生的Plackett-Burman(PB)設計。特別地，使用SAS/JMP V4.0.5中的定制設計功能產生篩選設計。所述軟件包是GUI導向的軟件包，因此不顯示代碼。參照圖13a，第1列是實驗點(運行(runs))的目錄，其可翻譯成96孔板(例如在該情況下是60孔)上的孔。電子數據表中的數字(-1或1)自身(圖13a-d)指示因子水平。在該實施例中，“1”表示因子存在而“-1”表示因子不存在。此外，在該實施例中，如果因子存在于給定的孔中，對于孔的總體積，其總是以相同的濃度存在。物質的總濃度在孔與孔間可基于相應的實驗運行內包含的物質數目發生變化。在圖13a-d的最上行提供了總因子名稱。圖14顯示本實驗中總因子F01-F30中的每一個的鑒定。例如，在第1列中的實驗運行1可代表96孔板的孔1。根據圖13(a-d)所示的統計設計，可看到下列因子存在(即，水平“1”)于孔1中F04、F08、F09、F11、F12、F14、F16、F20、F23、F25、F26、F27和F29。
建議的數據采集和統計分析根據圖13(a-d)的電子數據表所示的設計將細胞置于96孔板的孔中。播種密度大約為每孔10,000個細胞。將細胞在37℃下在板上溫育過夜。第二天，除去培養基和任何沒有附著在被固定在孔表面的物質上的細胞，并將任何附著的細胞暴露于甲醛中15分鐘進行固定。將經固定的附著細胞的細胞核進行熒光標記，如上在實施例4中所描述的，用熒光顯微鏡獲取圖象。使用圖象分析軟件包(Meta Morph，UniversalImaging Corporation)計算熒光標記的細胞核數目并獲得所述細胞的細胞核計數結果。基于這些結果，選擇具有最優實驗結果(例如，最多細胞核數目)的孔以進行進一步優化。通過檢查給出最優結果的孔的內含物，獲得關于產生有利效果的因子和/或因子組的信息。通過將許多因子包含設計中，可更有效地確定因子之間的復雜相互作用。后續的篩選實驗可集中于在第一輪篩選中發現的特別有意義的因子組合上。
在第一輪篩選后，估計和再檢查主效應。“主效應”是指獨立地起作用的單一物質的效應。相互作用效應是指一個以上的單一物質的組合效應，此時所述物質協同(非獨立地)地發揮作用。在這點上，在統計學模型中一般不估計物質間的關聯相互作用，但物質間的相互作用預期導致最優的實驗運行，即，最優孔。在第一輪篩選后，鑒定最優孔和包含于這些孔(水平＝“1”)中的因子。可使用包含于所述孔中的所有因子對各最優孔進行后續實驗，無論其在最初的統計學分析中具有正、中性或負效應。可用在最優孔中鑒定的物質子集重復實驗以獲得最優的用于在細胞中產生想要的反應的因子子集。此外，可重復所述實驗，其中改變最優孔中物質的濃度。也可用具有統計學上顯著的主效應的單一試劑的子集或通過將最優單一試劑的子集與在最優混合物中鑒定的物質的子集組合進行后續實驗。
已經提出通過細胞外條件對細胞表型的控制是由細胞外環境中因子間高度有序的相互作用決定的。此處提供的Plackett-Burman設計據信提供了良好的主效應的統計學估計并且也提供了在其實驗運行之間觀察到不同組的因子組合的機會。在這種情況下，預期更高度有序的相互作用會導致作為“最優孔”的特異的實驗運行，其超過和高于可由最優孔中的物質的個體主效應預測的實驗運行。
權利要求
1.用于鑒定能夠在完整的細胞中產生想要的生物學反應的物質的高通量方法，所述方法包括步驟(a)提供具有培養表面的容器；(b)根據統計設計將包含單一所述物質的不同混合物放入選擇的所述容器中；(c)將所述單一物質的混合物固定在所述培養表面上；(d)將所述來自(c)的物質與所述完整的細胞接觸；(e)獲取表示所述被接觸的細胞中的想要的生物學反應的數據；和(f)使用所述獲得的數據的統計模建來鑒定哪種所述單一物質的混合物和/或所述混合物中的哪種單一物質對在被接觸的細胞中產生所述想要的生物學反應有效。
2.權利要求1的方法，其進一步包括將單一所述物質放入其它的所述容器的步驟。
3.權利要求1的方法，其中用固定物質的材料包被所述培養表面。
4.權利要求3的方法，其中所述固定物質的材料是選自透明質酸、algenic酸、聚環氧乙烷、聚甲基丙烯酸羥乙酯和其組合的生物相容性多聚物。
5.權利要求3的方法，其中所述固定物質的材料含有用于共價固定所述物質的反應性基團。
6.權利要求3的方法，其中在所述培養表面上的所述固定物質的材料不支持細胞附著。
7.權利要求1的方法，其中所述物質是細胞附著配體和/或外部因子。
8.權利要求7的方法，其中所述物質選自細胞外基質蛋白、細胞外基質蛋白片段、肽、生長因子、細胞因子和其組合。
9.權利要求1的方法，其中通過免疫細胞化學分析法、顯微鏡檢術或功能性測定法獲得所述數據。
10.權利要求1的方法，其中所述想要的生物學反應選自細胞附著、細胞存活、細胞分化、細胞成熟、細胞增殖和其組合。
11.權利要求1的方法，其中所述容器是96孔板的孔。
12.權利要求1的方法，其中在各容器中所述物質的總濃度相同。
13.權利要求1的方法，其中在各容器中所述物質的總濃度不同。
14.權利要求1的方法，其中所述各容器之間單一所述物質的濃度不同。
15.權利要求1的方法，其中所述統計設計選自分級析因設計、d-最優化設計、混合設計和Plackett-Burman設計。
16.權利要求1的方法，其中所述統計設計是基于范圍標準、點陣設計或拉丁方設計的空間充滿設計。
17.權利要求1的方法，其進一步包括用所述經鑒定的單一物質的混合物的子集重復所述步驟。
18.權利要求1的方法，其進一步包括重復所述步驟，其中在所述經鑒定的混合物中物質的濃度改變。
19.權利要求1的方法，其中所述統計學模建是用于將所述獲得的數據與統計設計比較的算法。
全文摘要
提供了用于鑒定能夠在完整的細胞中產生想要的生物學反應的物質的高通量方法。所述方法包括步驟提供具有培養表面的容器；根據統計設計將不同的包含單一所述物質的不同混合物放入選擇的容器中；和將所述單一物質混合物固定在所述培養表面上。所述方法進一步包括將被固定的物質與完整的細胞接觸；和獲取表示被接觸細胞中想要的生物學反應的數據。所述方法也包括使用獲得的數據的統計模建來確定哪種單一物質的混合物和/或這些混合物中的哪種單一物質對在被接觸的細胞中產生想要的生物學反應有效。
文檔編號G01N33/50GK1853102SQ200480026584
公開日2006年10月25日 申請日期2004年9月10日 優先權日2003年9月15日
發明者A·利布曼－芬松, J·A·羅利, C·H·博迪利, M·A·海達蘭 申請人:貝克頓·迪金森公司