Limk－1、其類似物和配體在制備抗血栓形成或血液凝固疾病的藥物中的用途的制作方法

專利名稱：Limk－1、其類似物和配體在制備抗血栓形成或血液凝固疾病的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及LIMK-1、LIMK-1類似物或LIMK-1配體用于結合GPIIb和/或激活或抑制GPIIb/IIIa下游信號傳遞(的用途)，用于制備預防或治療血栓形成或血液凝固疾病的藥物(的用途)，(涉及)篩選LIMK-1類似物或LIMK-1配體的方法以及制備治療血栓形成或血液凝固疾病的藥物的方法。
背景技術：
血小板是最小的血細胞，雖然僅僅是巨核細胞胞漿的一部分，然而它們在正常止血中具有關鍵作用，并且是促成血栓形成性紊亂的重要因素。血小板粘附、激活和聚集是引發止血的首要必備反應，并在廣泛的各種心血管疾病、腦血管疾病和外周血管疾病的病理學中起作用(Bhatt等，2003；George 2000；Moroi等，1998；Rao等，2000；Ruggeri 2002)。
血小板膜含有高濃度的整聯蛋白和其它糖蛋白，它們參與使血小板粘附至胞外基質成分(Lopez等，1988；Philips等，1988；Shattil 1999)。膠原纖維和馮·維勒布蘭德因子(vWF)提供了重要的位點，使血小板粘附于暴露的內皮下，在血管損傷部位誘捕它們并使之形成單層細胞覆蓋在損傷區域上(Ruggeri 2002；Watson 1999)。膠原纖維和vWF，和通過G-蛋白偶聯受體(GPCRs)起作用的信號相呼應，也刺激血小板的激活，導致整聯蛋白糖蛋白GPIIb/IIIa(也稱之為□IIb□3)的“內-外”調節、從致密顆粒和α顆粒中的分泌、凝血噁烷的產生和促凝血活性的表達(Parise 1999；Ruggeri 2002；Shattil 1999)。同樣，經激活血小板從正常的盤狀變為帶有長樹枝狀延伸的緊湊球形以便于粘附。所有這些事件支持了凝血過程。在結合了纖維蛋白原、馮·維勒布蘭德因子(vWF)和纖連蛋白的血小板的表面，膜蛋白GPIIb(CD41)和GPIIIa(CD61)形成最豐富的異源二聚體復合物。GPIIb/IIIa以失活的構象表達在靜息血小板的表面上，其對于可溶性纖維蛋白原具有低的親和性。在血小板通過大量重要的激動劑如膠原、ADP或凝血酶激活之后，GPIIb/IIIa經歷構象變化，提高了其結合可溶性纖維蛋白原的親和性，導致血小板聚集(Parise 1999；Ruggeri 2002；Shattil 1999)。GPIIb/IIIa的信號傳遞涉及其胞漿尾部的數個區域。數種信號傳遞蛋白與GPIIb/GPIIIa整聯蛋白的胞漿結構域結合，包括內聯蛋白、鈣和整聯蛋白結合蛋白(CIB)、Shc和Grb2。此外，α亞基的胞漿尾部的序列KVGFFKR參與信號傳遞，且對應于該區域的脂質修飾的肽完全激活了血小板(Stephens等，1998)。然而，引導從血小板激活到纖維蛋白原受體暴露的一系列精確的信號傳遞事件是未知的。
由于證實了阿斯匹林對于血小板和在心肌梗塞的主要預防中是有效的，阿斯匹林對于血栓形成性紊亂的預防性使用已經迅速增加。因而，幾十年來，抗血小板治療集中在凝血噁烷路徑以及阿斯匹林對它的抑制方面。
考慮到其相關性，預期粘附是開發抗血栓藥物的一個吸引人的靶標。然而，設計用以防止血小板聚集的首個系列的化合物，即αIIbβ3拮抗劑，用于口服長期治療并未成功。這被假定為是由于αIIbβ3拮抗劑(其中許多是基于纖維蛋白原中的受體識別序列)與天然的配體一樣，實際上引起了‘外-內’信號傳遞的事實(Cox等，2000)。因而，直接干預配體和受體之間的相互作用而不激活血小板也許是不可能的。
在最近幾年間，已經介紹了一些抗血小板療法，且有文獻記錄了包括從阿斯匹林到噻氯匹啶(ticlopidine)和氯吡格雷(clopidrogel)等的抗血小板治療在血栓栓塞性紊亂中的益處(Konstantopoulos等，2001；Mousa等，2002；Weksler 2000)。然而，雖然所有這些不同的治療對于治療血栓栓塞性紊亂增加了另外的益處，但是仍然存在許多病例，即使用不同藥劑聯合治療的效果也不是足夠的。而且，在許多病例中，這些抗血小板療法的治療伴隨著不期望的副作用。因而，迫切需要用于治療血栓栓塞性紊亂的新方法。

發明內容
因此，本發明的一個目標是提供用于增強預防和治療血栓形成或血液凝固疾病的新方法和鑒定例如抗血栓性治療的新靶標的方法。
令人驚訝的是，現在發現LIMK-1蛋白與GPIIb/IIIa結合。LIMK-1是72.6kDA的蛋白(人647個氨基酸)，并且是含LIM基序的蛋白激酶家族的成員。其基因圖譜位于染色體7，即7q11.23上。該蛋白質包含兩個N-末端富含半胱氨酸的LIM/雙鋅指基序、一個具有數個推斷的酪蛋白激酶和MAP激酶識別位點的富含脯氨酸絲氨酸的區域、一個PDZ結構域(PSD95/disc large/ZO-1)和一個C末端絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域。據假定鋅指樣LIM-結構域介導蛋白質-蛋白質相互作用，且在核與細胞骨架蛋白中已有描述。已經顯示，LIMK-1的C-末端激酶片斷與LIM結構域結合，且LIM片斷劑量依賴性地抑制LIMK-1的激酶核心片斷的激酶催化活性。因而，N-末端LIM結構域通過直接與C-末端激酶結構域相互作用而負調節LIMK-1的激酶活性(Nagata等，1999)。LIM結構域激酶1(LIMK-1)經由切絲蛋白(cofilin)的磷酸化作用調節肌動蛋白細胞骨架的重建。活性切絲蛋白引起肌動蛋白的解聚。通過LIMK-1的切絲蛋白磷酸化作用結果導致切絲蛋白肌動蛋白解聚活性的失活(Bierne等，2001；Gohla等，2002；Yang等，1998)。然而，迄今為止還沒有關于LIMK-1(或LIMK-2)在血小板中的潛在作用的報道。
由于LIMK-1與血小板整聯蛋白GPIIb結合，LIMK-1觸發了由血小板激活所誘發的并且是血小板激活所必要的血小板的形狀變化。抑制LIMK-1從而導致經促血栓形成刺激的血小板激活的抑制。因此，LIMK-1抑制劑干擾血小板的激活和聚集從而干擾血栓形成。
因此，本發明的第一個方面涉及在體外和在體內LIMK-1或LIMK-1類似物結合GPIIb的用途，特別是為了調節(優選抑制)整聯蛋白GPIIb/IIIa下游的信號轉導。
根據本發明的LIMK-1是任何天然存在的LIMK-1蛋白。這包括不同物種的LIMK-1蛋白及其變體，優選脊椎動物，更優選哺乳動物，也可以是剪接變體。優選的LIMK-1蛋白是人LIMK-1蛋白。人LIMK-1蛋白的氨基酸序列公布在Mizuno等，《原癌基因》(Oncogene)91605-1612，1994中。
根據本發明的術語“LIMK-1類似物”是指結合GPIIb的衍生自LIMK-1但不是LIMK-1的蛋白質。更特別地，是指與天然存在的LIMK-1序列(即野生型多肽)有一個或多個氨基酸不同的氨基酸序列。這樣的類似物以取代、插入或缺失一個或多個氨基酸而不同于野生型多肽。優選的是半保守的(氨基酸取代)，更優選的是保守氨基酸的取代，由此一個殘基被具有相似特征的另一個殘基所取代。典型的取代發生在脂肪族氨基酸之間，在具有脂肪族羥基側鏈的氨基酸之間，在具有酸性殘基的氨基酸之間，在酰胺衍生物之間，在具有堿性殘基的氨基酸之間，或者在具有芳香族殘基的氨基酸之間。典型的半保守和保守取代是


如果新的半胱氨酸保持為游離的硫醇，則從A、F、H、I、L、M、P、V、W或Y轉變為C是半保守的。而且，本領域的技術人員將會意識到處于空間需要位置上的甘氨酸不應被取代，且不應將P導入蛋白質中具有α螺旋或β片層結構的部分。
變體多肽在一級結構(氨基酸序列)中不同，但可能在或可能不在二級或三級結構中或在功能上相對于野生型具有顯著不同。在任何情況下，類似物都顯示出相對于野生型LIMK-1的同一性(同源性)至少為75％，優選至少為80％，更優選至少為90％，甚至更優選至少為95％，且最優選至少為99％。
類似物也可以是足以與GPIIb結合的LIMK-1的一部分。該部分包含至少30個氨基酸，優選至少100個氨基酸，更優選至少300個氨基酸，甚至更優選至少450個氨基酸，且最優選至少600個氨基酸。類似物的這個部分可如上文詳述的那樣以取代、插入或缺失一個或多個氨基酸而不同于野生型多肽部分。在一個實施方案中，LIMK-1或LIMK-1類似物可被融合到其它分子如蛋白質和/或標記(例如像上面詳述的)上。
術語“與GPIIb的結合”或“與GPIIb結合”是指主要化合物(LIMK-1或LIMK-1類似物)與GPIIb蛋白的特異性結合。根據本發明與GPIIb蛋白的特異性結合包括但不限于以不超過10-4mol/l的解離常數KD結合，優選不超過10-5mol/l，更優選不超過10-6mol/l。解離常數KD可以例如使用如實施例中(見例如

圖1)所示的免疫沉淀反應來測定，通過使用變化濃度的測試化合物即LIMK-1或LIMK-1類似物和恒定濃度的GPIIb實現。通過使用例如抗LIMK-1或LIMK-1類似物的特異性抗體來測定與GPIIb結合的測試化合物的濃度。根據以下等式測定KDB[L]＝[L]/([L]+KD)，其中[L]代表該化合物的濃度。KD是測試化合物的解離常數，而B[L]是在測試化合物特定濃度下的結合(％)。
為了檢測，抗體可被標記，這可以適當地為熒光團、發色團、放射性同位素標記、金屬膠體、酶或者化學發光的或生物發光的分子。合適的熒光團和發色團在R.P.Haugland，Molecular Probes，Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals，第5版，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg.，1992中公開。優選的熒光團的例子包括熒光素、羅丹明(rodamine)和硫代吲哚菁染料(sulfoindocyanine dye)Cy5(Mujumdar等，Bioconjuga Chem.4105，1992)。優選的放射性同位素標記包括3H、14C、32P、33P、35S、99mTc或125I。優選的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和脲酶。
本發明的GPIIb是任何天然存在的GPIIb蛋白。這包括不同物種的GPIIb蛋白及其變體，優選脊椎動物，更優選哺乳動物，也可以是剪接變體。優選的GPIIb蛋白是人GPIIb蛋白，其氨基酸序列在Poncz等，《生物學化學雜志》(J.Biol.Chem.)2628476-8482，1987中公開。
在本發明優選的一個實施方案中，LIMK-1類似物是GPIIb/IIIa下游信號傳遞的激活劑或抑制劑，優選地是其抑制劑。
GPIIb/IIIa下游信號傳遞的激活劑激活相應的信號轉導路徑，導致可檢測的信號。抑制劑至少部分地阻斷GPIIb/IIIa下游信號傳遞。激活和失活如下文所定義。激活劑和滅活劑如下文所述鑒定。
在本發明另一個優選的實施方案中，LIMK-1或LIMK-1類似物用于GPIIb/IIIa下游信號傳遞的激活或抑制，更優選地用于其抑制。
如上文詳述的那樣，GPIIb/IIIa下游信號傳遞的激活導致血小板的激活，其中這是通過血小板的外觀從正常的盤狀到緊湊的具有長樹枝狀延伸的球形的構象變化進行協調配合的。當用LIMK-1或競爭性的LIMK-1類似物刺激時，本發明的GPIIb/IIIa下游信號傳遞的激活相應于至少10％、優選至少20％、更優選至少50％且最優選至少80％血小板的激活。GPIIb/IIIa下游信號傳遞的抑制從而導致血小板激活的抑制。當用或任選地在存有GPIIb/IIIa激活劑時用抑制性LIMK-1類似物抑制時，本發明的GPIIb/IIIa下游信號傳遞的抑制相應于至少10％、優選至少20％、更優選至少50％且最優選至少80％血小板的抑制。
本發明的另一個主題是LIMK-1配體用于激活或抑制GPIIb/IIIa下游信號傳遞的用途，優選地用于其抑制。
LIMK-1配體是任何特異性地與LIMK-1結合的化合物分子。本發明與LIMK-1特異性地結合包括不限于以不超過10-4mol/l的解離常數KD結合，優選不超過10-5mol/l。解離常數KD可如詳述的GPIIb那樣測定，或通過使用LIMK-1蛋白和合適標記的LIMK-1配體來測定。合適的標記在上文詳述。此外，LIMK-1的競爭性或拮抗性LIMK-1配體的結合可通過分別激活或失活LIMK-1的激酶功能來檢測。激酶功能可通過本領域技術人員已知的方法容易地檢測。其中一些在下文詳述。為檢測拮抗性的LIMK-1配體，可能有必要用例如PAK(p21激活的激酶)或ROCK(Rho激酶)激活LIMK-1。可選擇地，LIMK-1配體的結合可以通過測量在信號轉導路徑中更下游的信號來檢測，例如血小板的激活或失活或者其構象變化的誘導。本發明LIMK-1的特異性結合包括不限于分別以分別不超過10-4mol/l的EC50值和IC50值與競爭性和拮抗性LIMK-1配體結合，優選不超過10-5mol/l。EC50值和IC50值的測定和計算對于本領域的技術人員來說是公知的。
LIMK-1可以是非聚合的有機化合物、脂質、碳水化合物、肽，優選為具有約10至約300個氨基酸的肽，特別是具有10至50個氨基酸的肽。特別優選的是化學小分子，特別是非聚合的有機化合物，無論是在實驗室里合成的或者是天然發現的，優選具有約200g/mole至約1500g/mole，特別是400g/mole至1000g/mole的分子量。
可選擇地，本發明的LIMK-1配體可以是天然產物提取物的形式，無論是未加工的或是純化的形式。提取物可根據標準方法生產，如從動物、植物、真菌或微生物來源，像蛇毒、葉子或微生物發酵培養液中以水和/或醇和/或有機溶劑提取和/或柱層析和/或沉淀。
在一個優選的實施方案中，LIMK-1配體是LIMK-1激動劑或者LIMK-1拮抗劑，更優選的是LIMK-1拮抗劑。
激動劑與LIMK-1結合，誘導變化，例如LIMK-1構象的變化，激活相應的信號轉導，例如激活LIMK-1的激酶功能，這導致可檢測的信號。拮抗劑或阻斷劑也與LIMK-1結合，但一般不誘導信號轉導。在激動劑的存在下，拮抗劑劑量依賴性地抑制激動劑誘導的信號轉導。
本發明的另一主題是本發明的LIMK-1、LIMK-1類似物或LIMK-1配體在制備預防或治療血栓形成或血液凝固疾病的藥物中的用途。血栓形成或血液凝固疾病是涉及改變的血栓形成或血液凝固的疾病。與健康的人類相比，血栓形成或血液凝固(的傾向)可能增加或減少。
為制備藥物，LIMK-1、LIMK-1類似物或LIMK-1配體或其藥學上可接受的鹽必須是以一種藥物劑型，其一般是由諸如藥學上可接受的載體或輔助物質組合的成分的混合物組成，以提供所期望的特征。
制劑包含至少一種合適的藥學上可接受的載體或輔助物質。這樣的物質的例子是軟化水，等滲鹽，Ringer′s溶液，緩沖液，有機或無機酸和堿以及它們的鹽，氯化鈉，碳酸氫鈉，檸檬酸鈉或磷酸二鈣，醇如丙二醇，酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯，糖類如葡萄糖、蔗糖和乳糖，淀粉如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉，增溶劑和乳化劑如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油類如花生油、棉籽油、玉米油、大豆油、蓖麻油，合成脂肪酸酯如油酸乙酯、豆蔻酸異丙酯，聚合的佐劑如明膠、葡聚糖、纖維素及其衍生物，白蛋白，有機溶劑，絡合劑如檸檬酸鹽和尿素，穩定劑如蛋白酶或核酸酶抑制劑，優選抑酶肽、∈-氨基己酸或抑胃酶肽A，防腐劑如苯甲醇，氧化抑制劑如亞硫酸鈉、蠟或穩定劑如EDTA。組合物中也可以存在著色劑、釋放劑、涂層劑、甜味、調味劑和香味劑、防腐劑和抗氧化劑。生理緩沖液優選pH約為6.0-8.0，特別地pH約為6.8-7.8，特別地pH約為7.4，和/或摩爾滲透壓濃度約為200-400毫摩爾滲透/升(milliosmol/liter)，優選約為290-310milliosmol/liter。藥物的pH一般用合適的有機或無機緩沖液調節，像例如優選使用磷酸緩沖液、tris緩沖液(三(羥甲基)氨基甲烷)、HEPES緩沖液([4-(2-羥乙基)哌嗪]乙磺酸)或MOPS緩沖液(3-嗎啉代-1-丙磺酸)。相應緩沖液的選擇一般取決于所需的緩沖液摩爾濃度。例如磷酸緩沖液適合用于注射液和輸注液。配制藥物和合適的藥學上可接受的載體或輔助物質的方法對于本領域的技術人員來說是熟知的。藥學上可接受的載體和輔助物質是根據主要劑型和所鑒定的化合物進行a.o.選擇的。
藥物組合物可以制備成經口、鼻、直腸、腸胃外、陰道、局部或陰道給藥。腸胃外給藥包括經皮下、皮內、肌肉內、靜脈內或腹膜內給藥。
藥物可以被配制成各種劑型，包括經口服給藥的固體劑型如膠囊、片劑、丸劑、散劑和顆粒，經口服給藥的液體劑型如藥學上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、混懸劑、糖漿劑和酏劑，可注射的制品例如無菌可注射水溶液或油質混懸劑，經直腸或陰道給藥的組合物，優選為栓劑，以及用于局部或經皮給藥的劑型如膏劑、糊劑、霜劑、洗劑、凝膠劑、散劑、溶液、噴霧劑、吸入劑或貼片劑。
任何特定患者的具體治療有效劑量水平將取決于各種因素，包括所鑒定的化合物的活性、劑型、患者的年齡、體重和性別、治療持續時間等醫學領域中眾所周知的因素。
以單一或分開劑量給予人或其它哺乳動物的本發明的化合物的日總劑量，總計可以是例如約0.01至約50mg/kg體重或更優選地約為0.1至約25mg/kg體重的量。單一劑量組合物可以含有補足日劑量的數量或其約量。一般地，本發明的治療方案包含每天以單一或多劑量地給予需要這樣的治療的患者約10mg至約1000mg的本發明化合物的化合物。
在優選的實施方案中，LIMK-1類似物是GPIIb/IIIa下游信號傳遞的抑制劑。在另一個優選的實施方案中，LIMK-1配體是LIMK-1拮抗劑。
大多數患有血栓形成或血液凝固疾病的患者遭受具有血栓形成或血液凝固(傾向)增加的疾病。因此，他們特別需要抑制血栓形成或血液凝固的藥物。因此，抑制血栓形成或血液凝固的藥物如抑制性LIMK-1類似物和拮抗性LIMK-1配體對于制藥用途是優選的。
又在另一個優選的實施方案中，血栓形成或血液凝固疾病是伴有血栓形成或血液凝固增加的疾病。
伴有血栓形成或血液凝固增加的疾病對于本領域的技術人員來說是公知的，且包括例如動脈血栓形成性疾病。
在更優選的實施方案中，疾病是動脈血栓形成性疾病，甚至更優選的疾病選自心肌梗塞、不穩定型心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、冠狀動脈疾病、冠狀動脈溶栓后再閉塞、血栓形成期間的閉塞和冠狀動脈再狹窄、中風、短暫性腦缺血發作、肺栓塞、左心室功能障礙、患有心血管和腦血管疾病的患者的臨床血管并發癥的二級預防、動脈粥樣硬化、血管介入性策略的結合藥物治療。
然而，本發明的另一個實施方案是篩選LIMK-1類似物的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供GPIIb蛋白和任選地至少一種其下游信號傳遞元件；(b)提供測試化合物；和(c)檢測測試化合物與GPIIb蛋白的結合，其中該測試化合物衍生自LIMK-1。
一般地，GPIIb和任選地至少一種其下游信號傳遞元件在例如測定系統中被提供，且直接或間接與衍生自LIMK-1的測試化合物接觸。表述“衍生自LIMK-1的測試化合物”是指如上文所定義的LIMK-1類似物。然后，檢測測試化合物與LIMK-1蛋白的結合，其中所述結合可通過測量GPIIb與測試化合物之間的相互作用或者通過測量其對下游信號傳遞的效應來檢測。
術語“GPIIb/GPIIIa或GPIIb的下游信號傳遞元件”是指作為GPIIb/GPIIIa或GPIIb下游信號轉導的一部分的每一個分子或離子。其可以是信號傳遞級聯中任何步驟的任何元件。優選地元件自身為可測量的信號或其產生可測量的信號。元件可以是例如第二信使或酶。信號可以是例如物質濃度的變化或者構象的變化。
結合可被直接檢測，即通過檢測建立的復合物，或者間接檢測，即建立復合物的效應，其可以是例如信號轉導路徑中的下游信號。之后，可以分析和/或分離合適的配體。直接測量LIMK-1類似物與GPIIb的結合的方法在上文詳述。
在本發明的另一個實施方案中，篩選本發明的LIMK-1類似物的方法包括以下步驟代替步驟(c)(c’)檢測GPIIb/IIIa和/或其下游信號傳遞的激活或抑制。
用于檢測LIMK-1的激活或抑制的合適的功能測定法可以例如包括GPIIb/GPIIIa的下游信號轉導。例如，可如上面詳述的那樣通過分析下游信號例如血小板的激活或其構象的變化來檢測激活或抑制。可能有必要在GPIIb和/或LIMK-1刺激物的存在下檢測GPIIb/GPIIIa信號轉導的抑制，其信號將受到抑制性LIMK-1類似物的抑制。
本發明的又一個實施方案是篩選LIMK-1配體的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供測試化合物；和(c)檢測測試化合物對LIMK-1蛋白的結合。
一般地，LIMK-1在例如測定系統中被提供，且直接或間接地與測試化合物接觸，特別是生化或化學測試化合物，例如以化學化合物文庫的形式。然后，檢測測試化合物與LIMK-1蛋白的結合。結合可被直接檢測，即通過檢測建立的復合物，或者間接檢測，即建立復合物的效應，其可以是例如信號轉導路徑中的下游信號。直接測量LIMK-1配體與LIMK-1結合的方法在上文詳述。其后，可分析和/或分離合適的配體。
在本發明的另一個實施方案中，篩選本發明的LIMK-1配體的方法包括以下步驟代替步驟(c)(c’)檢測LIMK-1或GPII/IIIa下游信號傳遞的激活或抑制，優選檢測其失活。
用于檢測LIMK-1的激活或失活的合適的功能測定法可以例如包括LIMK-1的激酶功能。檢測激酶活性的方法對于技術人員來說是公知的(見下文)。一般地，這些方法包括磷酸基團向受體的轉移，例如標記的磷酸基團如32P或33P標記的磷酸基團。因此LIMK-1的激活伴隨著增加的磷酸轉移，而失活伴隨著減少的磷酸轉移。可能有必要在LIMK-1刺激物的存在下檢測LIMK-1的失活，其信號將受到拮抗性LIMK-1配體的抑制。也可通過測量下游信號檢測激活或失活，例如血小板的激活或其構象的變化。
本發明另一個主題是篩選與GPIIb/IIIa和/或其下游信號傳遞相互作用的測試化合物的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供GPIIb和/或至少一種其下游信號傳遞元件；(c)提供測試化合物；和(d)檢測該化合物對于GPIIb/GPIIIa下游信號傳遞的效應。
一般地，LIMK-1和GPIIb和/或至少一種其下游信號轉導元件在例如測定系統中被提供，且直接或間接地與測試化合物接觸，特別是生化或化學測試化合物，例如以化學化合物文庫的形式。然后，如上文所述檢測測試化合物對于GPIIb/GPIIIa信號轉導的效應。其后，可以分析和/或分離合適的配體。
在一個優選的實施方案中，整個細胞例如血小板用于本發明的篩選方法，由此提供GPIIb/GPIIIa和更多其下游信號傳遞的元件。在這種情況下，檢測到的信號可以是血小板的形狀變化。
若存在測試化合物時LIMK-1或其類似物對GPIIb的結合不同于在缺少測試化合物時的情況，則測試化合物與GPIIb和/或其下游信號傳遞相互作用。信號轉導可以是增加或減少，優選減少。所檢測到的下游信號傳遞量的差異總計最少10％，優選至少20％，更優選至少50％且最優選至少80％，且計算為存在和缺少測試化合物時的信號比。
在本發明篩選方法的另一個實施方案中，以化學化合物文庫的形式提供測試化合物。化學化合物文庫包括大量的化學化合物且是由任何多種來源組合的，包括化學合成的分子和天然產物，或由組合化學技術產生。它們特別適合高通量篩選。它們可由特定結構的化學化合物或由特定生物如植物的化合物組成。在本發明的上下文中，化學化合物文庫優選是包括蛋白質和多肽或小分子的文庫。
又在根據本發明用于篩選LIMK-1類似物或LIMK-1配體的篩選方法的另一個實施方案中，測試化合物與所述GPIIb蛋白或所述LIMK-1蛋白的結合或其對GPIIb和/或其下游信號傳遞的效應通異質或均質測定法檢測。如本文所用，異質測定法是包括一個或多個洗滌步驟的測定法，然而在均質測定法中這樣的洗滌步驟是不必要的。僅僅是混合試劑和化合物并進行測量。
在優選的實施方案中，均質測定法是ELISA(酶聯免疫吸附試驗)、DELFIA(解離增強鑭系熒光免疫分析)、SPA(閃爍親近測定法)或閃爍板(flashplate)測定法。
基于ELISA(酶聯免疫吸附試驗)的測定法由多種公司提供。該測定法使用可被激酶如LIMK-1磷酸化的隨機肽。含有激酶的樣品通常是被稀釋到含有例如ATP和必需的陽離子的反應緩沖液中，然后再加入到板孔中。通過簡單地除去混合物而停止反應。其后，洗滌板子。例如通過將生物素化的底物加入到激酶中開始反應。反應后，加入特異性的抗體。樣品通常被轉移至預先封閉的G蛋白板上，在洗滌后例如加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP。其后，除去未結合的鏈霉抗生物素蛋白-HRP(辣根過氧化物酶)，通過加入過氧化物酶底物開始過氧化物酶顯色反應，且用合適的光密度計測量光密度。
基于DELFIA(解離增強鑭系熒光免疫分析)的測定法是固相測定法。抗體通常用銪或其它鑭系元素標記，并在洗去未結合的銪標記的抗體之后檢測銪熒光。
SPA(閃爍親近測定法)及閃爍板測定法通常采用生物素/抗生物素蛋白相互作用以捕獲放射性同位素標記的底物。一般地，反應混合物包括激酶、生物素化的肽底物和γ-[P33]ATP。反應后，生物素化的肽通過鏈霉抗生物素蛋白捕獲。在SPA檢測中，鏈霉抗生物素蛋白結合在含閃爍材料的珠上，然而在閃爍板檢測中，鏈霉抗生物素蛋白結合至含閃爍材料的微板的孔的內部。一旦固定，放射性同位素標記的底物與閃爍材料足夠接近以刺激光的發射。
在另一個優選的實施方案中，均質測定法是TR-FRET(時間分辨熒光共振能量轉移)測定法、FP(熒光偏振)測定法、ALPHA(增強發光鄰近均質分析)、EFC(酶片斷互補)測定法或基因測定法。
基于TR-FRET(時間分辨熒光共振能量轉移)的測定法是利用了銪和APC(修飾的別藻藍蛋白)之間或其它具有重疊光譜的染料如Cy3/Cy5或Cy5/Cy7之間的熒光共振能量轉移的測定法(Schobel，U.等(1999)Bioconjugate Chem.10，1107-1114)。在例如用337nm的光激發銪之后，該分子在620nm發熒光。但是如果該熒光團足夠接近APC，則銪將轉移其激發能至APC，后者在665nm發熒光。激酶底物通常為生物素標記的底物。在激酶反應后，銪標記(P)的特異性抗體隨同鏈霉抗生物素蛋白-APC一起加入。磷酸化的肽使銪標記的抗體和鏈霉抗生物素蛋白-APC緊密接觸。APC與銪熒光團的緊密接近將因為APC熒光的得益而引起銪熒光的淬滅(FRET)。
基于熒光偏振(FP)的測定法是使用偏振光激發溶液中的熒光底物肽的測定法。這些熒光肽在溶液中是游離且翻轉的，致使發出的光變成去極化的。然而，當底物肽結合于更大的分子如(P)-Tyr時，其翻轉速率極大地降低，且發出的光保持高度偏振。對于激酶測定法，一般有兩種選擇(a)熒光磷酸肽示蹤劑被結合到(P)特異性抗體上。磷酸化產物將與抗體中熒光磷酸肽競爭，導致偏振由高至低變化。
(b)磷酸化底物肽結合于磷特異性抗體導致偏振由低至高變化。
基于ALPHA(增強發光鄰近均質分析)的測定法是依賴于通過磷酸化肽使其接近的供體和受體珠之間的純態氧轉移的試驗。在680nm激發時，供體珠內的光敏劑將周圍的氧轉變成純態氧，其擴散至200nm的距離。受體珠內的化學發光基團將能量轉移至珠內的熒光受體，從而在約600nm處發出光。
基于EFC(酶片斷互補)的測定法或等同試測定法可特別地用于化合物的高通量篩選。EFC測定法是建立在工程化的β-半乳糖苷酶的基礎上的，其由酶受體(EA)和酶供體(ED)兩個片斷組成。當兩片斷分開時，沒有β-半乳糖苷酶活性，但當片斷在一起時，它們就結合(互補)形成有活性的酶。EFC測定法利用了ED-被分析物綴合物，其中所述被分析物可被特異性結合蛋白如抗體或受體識別。在缺少特異性結合蛋白時，ED-被分析物綴合物能夠互補EA以形成活性β-半乳糖苷酶，產生正的發光信號。如果ED-被分析物綴合物被特異性的結合蛋白結合，則與EA的互補將被阻止，因此沒有信號。如果提供了游離的被分析物(在樣品中)，它會與ED-被分析物綴合物競爭與特異性結合蛋白的結合。游離的被分析物將釋放ED-被分析物綴合物以與EA互補，產生依賴于樣品中存在著的游離被分析物的含量的信號。
還有，在另一個實施方案中，根據本發明的用于篩選LIMK-1類似物或LIMK-1配體的篩選方法是通過將GPIIb或LIMK-1結合在陣列上而在陣列上進行的。使用固相化學和光不穩定保護基團制備這樣的陣列的方法公開在例如US 5,744,305中。也可以使這些陣列與測試化合物或化合物庫接觸，并測試相互作用例如結合或改變構像。
又在另一個實施方案中，根據本發明的用于篩選LIMK-1類似物或LIMK-1配體的篩選方法是使用整個細胞進行的。優選地，血小板用于這樣的測試，因為它們可以容易地從血液供體中獲得。可選擇地，可以使用細胞系，任選地為轉染的細胞系。這樣的細胞系包括但不限于巨核細胞系(例如DAMI或MEG-1)、HEK 293細胞(初級人胚腎)、3T3細胞(鼠胚胎成纖維細胞)、CHO細胞(中華倉鼠卵巢)、COS-7細胞(非洲綠猴細胞系)、HeLa細胞(人上皮樣宮頸癌)、JURKAT細胞(人T細胞白血病)、BHK 21細胞(倉鼠正常腎，成纖維細胞)和MCF-7細胞(人乳腺癌)。使用整個細胞相對于細胞膜是有利的，因為胞內基質、酶等不需要加入到測試系統中。而且，在多孔板中的整個細胞是特別適合于高通量輸出篩選測試和自動測試系統。
在另一個實施方案中，根據本發明的用于篩選LIMK-1類似物或LIMK-1配體的篩選方法是在機器人系統中進行的。最好本發明的方法是在機器人系統(例如包括機器人涂板和機器人液體轉移系統)中，例如使用微流體學，即有溝構造的系統進行的。
又在另一個實施方案中，根據本發明的用于篩選LIMK-1類似物或LIMK-1配體的篩選方法是以高通量輸出篩選系統的形式進行的。在這樣的系統中，最好篩選方法是自動化的且小型化的；特別是使用通過機器人控制的小型化孔和微流體學。
本發明的另一個主題是制備用于預防或治療血栓形成或血液凝固疾病的藥物的方法，其中該方法包括以下步驟(a)實施根據本發明的篩選方法，(b)提供適量所檢測的測試化合物，和(c)將所檢測的測試化合物與如上詳述的一個或多種藥學上可接受的載體或輔助物質一起配制。
血栓形成或血液凝固疾病是涉及血栓形成或血液凝固改變的疾病。與健康人類相比，血栓形成或血液凝固(傾向)可能增加或減少。伴有血栓形成或血液凝固增加的疾病對于本領域的技術人員來說是公知的，且包括例如動脈血栓形成性疾病。
在優選的實施方案中，所述疾病是動脈血栓形成性疾病。
又在本發明更優選的實施方案中，動脈血栓形成性疾病選自心肌梗塞、不穩定型心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、冠狀動脈疾病、冠狀動脈溶栓后再閉塞、血栓形成期間的閉塞和冠狀動脈再狹窄、中風、短暫性腦缺血發作、肺栓塞、左心室功能障礙、患有心血管和腦血管疾病的患者的臨床血管并發癥的二級預防、動脈粥樣硬化、血管介入性策略的結合藥物治療。
以下附圖和實施例將更詳細地解釋本發明，而非限制本發明的范圍。
附1顯示了用GPIIb免疫沉淀物的2D凝膠電泳對LIMK-1的檢測。
人靜息血小板提取物(3.9mg)與對照IgG(圖1A)或抗GPIIb特異性抗體(圖1B)的免疫沉淀物通過IEF(等電聚焦)在第一步中在pH 3-10梯度上分離。隨后，在10％SDS-PAGE上進行第二維的蛋白質分離。凝膠經膠態考馬斯染色并分析。只切下在具有特異性GPIIb抗體的凝膠上可見的蛋白質斑點，用胰蛋白酶消化(在膠內消化)，提取并通過MALDI-TOFMS分析。
圖2顯示了用抗LIMK-1抗體免疫沉淀后對整聯蛋白GPIIb的檢測。
人血小板提取物(2mg)以及人巨核細胞系DAMI和MEG-01與抗LIMK-1的特異性抗體的免疫沉淀物通過4-12％SDS-PAGE分離。通過電轉移將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜。用特異性抗體檢測整聯蛋白GPIIb。
圖3顯示了用抗LIMK-1和GPIIb抗體免疫沉淀后對LIMK-1的檢測。
人血小板提取物與抗LIMK-1和GPIIb的特異性抗體的免疫沉淀物通過10％SDS-PAGE分離。通過電轉移將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜。用特異性抗體檢測LIMK-1。
圖4顯示了血小板提取物以及DAMI和Meg-01細胞中LIMK-1的檢測。
來自人血小板提取物的等量蛋白質(50μg)通過4-12％SDS-PAGE分離。通過電轉移將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜。用特異性抗體檢測LIMK-1。
圖5顯示了不同的人組織提取物中LIMK-1的檢測。
來自人結腸、睪丸、腎、心臟、血小板、肝、肌肉、皮膚、胰、腦和胸腺組織的提取物的等量蛋白質通過4-12％SDS-PAGE分離。通過電轉移將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜。用特異性抗體檢測LIMK-1。
圖6顯示了在不同的人組織中通過定量Taqman分析對LIMK-1轉錄本的檢測。
通過Taqman分析對人骨髓、結腸、睪丸、腎、心臟、血小板、肝、胎肝、肺、乳腺、胎盤、前列腺、唾液腺、腸、脊髓、脾、胃、氣管、子宮、肌肉、胰、腦、胎腦和胸腺組織的mRNA進行了分析。
實施例1.材料&方法1.1血小板(凝血細胞)的制備從血庫(4個供體的)凝血細胞濃縮物中制備凝血細胞。所有步驟在室溫下進行。用Tyrode′s緩沖液(pH 7.4；137mmol/l NaCl，2.7mmol/l KCl，12mmol/l NaHCO3，0.36mmol/l NaH2PO4，1mmol/l MgCl2，10mmol/lHEPES，5.6mmol/l右旋糖)稀釋凝血細胞濃縮物，并將所得的懸液在120×g下無制動減速地(without brake)離心15min。然后將前列腺素E1(PGE10.5μg/ml)加入到上清中，將混合物在室溫下孵育5min并在650×g下無制動減速地離心15min。棄上清，將沉淀重懸于Tyrode′s緩沖液(具有0.1％BSA)中，并加入PGE1(0.5μg/ml)。將混合物在室溫下孵育5min，隨后在650×g下無制動減速地離心5min。棄上清，將沉淀重懸于Tyrode′s緩沖液(無BSA)中，加入PGE1(0.25μg/ml)，孵育混合物(室溫下5min)并離心(650×g，15min，無制動減速)。再次棄上清，將沉淀重懸于Tyrode′s緩沖液(無BSA)中，將細胞在液氮中冷凍，然后貯存在-80℃備用。
1.2細胞培養將人DAMI和Meg-01巨核細胞系的培養物在含有10％胎牛血清(FCS)和青霉素/鏈霉素的Dulbecco′s改良的Eagles′s培養基(DMEM)中培養(37℃，5％CO2)。洗滌細胞、收獲并將細胞沉淀貯存在-80℃，之后制備提取物。
1.3用于免疫沉淀的血小板的處理將冷凍的血小板沉淀在1-2ml裂解緩沖液(見下文)中解凍，然后通過移液管上下吸取進行重懸，接著進行超聲(10次脈沖，30％)。通過離心血小板(5min，3.000×g)進行預分級以在上清液中富集可溶性蛋白質。
圖1中所使用的裂解和洗滌緩沖液裂解緩沖液(pH 8)10mmol/l Tris，140mmol/l NaCl，1％Triton，0.05％SDS，1tab完全的200μmol/l pefabloc(4-(2-氨基乙基)-苯基磺酰氟氫氯化物)洗滌緩沖液(pH 8)10mmol/l Tris，140mmol/l NaCl，1％Triton圖2中所使用的裂解和洗滌緩沖液裂解緩沖液(pH 7.5)50mmol/l Tris，50mmol/l NaCl，0.5％Triton，0.05％SDS，1mmol/l Na3VO4，1tab完全的1μg/ml抑胃酶肽，5mmol/lNaF洗滌緩沖液(pH 7.5)50mmol/l Tris，50mmol/l NaCl，0.1％Triton圖3中所使用的裂解和洗滌緩沖液裂解緩沖液(pH 7.5)50mmol/l Tris，150mmol/l NaCl，1％Triton，1mmol/l Na3VO4，1tab完全的1μg/ml抑胃酶肽，50mmol/l NaF洗滌緩沖液(pH 7.5)50mmol/l Tris，150mmol/l NaCl，1％Triton1.4免疫沉淀依據抗體的類型，將A蛋白瓊脂糖(Amersham Biosciences，烏普薩拉，瑞典)和G蛋白瓊脂糖(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德國)用于免疫沉淀。所有步驟在4℃進行。
在使用之前用洗滌緩沖液(見上文)將珠子洗滌3次。通過與珠子材料孵育1h(圖1+2，3中不是)和隨后離心(3min，500×g)預先除去血小板裂解物。將血小板溶解物與抗體孵育1h，然后加入珠子進行過夜免疫沉淀。在那之后，用洗滌緩沖液(見上文)洗滌珠子3次，然后通過與IEF再水合緩沖液(用于2D凝膠分析)或裂解緩沖液(用于1D凝膠分析)孵育進行洗脫。
1.5抗體說明GPIIb(Santa Cruz Biotechnology，Inc.in Santa Cruz，加利福尼亞，美國；Cat-No.sc-7310)用于免疫沉淀(A蛋白)GPIIb(Biotrend Chemikalien GmbH，科隆，德國；Cat-No.6065)用于Western印跡(1∶1000)LIMK(Santa Cruz Biotechnology，Inc.in Santa Cruz，加利福尼亞，美國；Cat-No.sc-5576)用于免疫沉淀(G蛋白)和Western印跡(1∶250)。
1.6 2D凝膠電泳第一維凝膠電泳使用Biorad Protean IEF細胞(IPG條帶11cm，pH3-10)(Biorad Laboratories，Hercules，CA，美國)和如下的IEF再水合緩沖液(8mol/l尿素，0.5％CHAPS，10mmol/l DTT，0.2％Biolytes，0.001％溴酚藍)進行。為進行活性再水合，將IPG條帶于50V與185μl的樣品體積靜置過夜。用線性變速、8000V的終止電壓和總計至少40000Vhrs進行IEF(等電聚焦)。在第二維之前在每一平衡緩沖液(pH 8.8；6mol/l尿素，2％SDS，0.375mol/l Tris，20％甘油，130mmol/l DTT或135mmol/l碘乙酰胺)中進行還原/烷基化10min。
使用Criterion 4-20％凝膠在150V和25mmol/l Tris、192mmol/l甘氨酸、0.1％SDS作為跑膠緩沖液中進行第二維凝膠電泳。
1.7 1D凝膠電泳使用X-細胞安全鎖定系統(Novex系統；Invitrogen GmbH，卡爾斯魯厄，德國)以及MOPS-SDS作為跑膠緩沖液且在150V電壓下進行1D凝膠電泳。
1.8電轉移/Western印跡(半干)對于電轉移，使用Multiphor II系統(非連續的緩沖液系統)(Amersham，Biosciencies，烏普薩拉，瑞典)。陽極緩沖液1是0.3mol/l Tris、20％甲醇，陽極緩沖液2是25mmol/l Tris、20％甲醇，而陰極緩沖液是40mmol/l氨基己酸、0.01％SDS、20％甲醇。
使用0.8mA/cm2將蛋白質印跡到硝酸纖維素片(Schleicher & SchuellBioScience GmbH，Dassel/Relliehausen，德國；Protran BA85 0.45um)上。
1.9染色技術用膠態考馬斯(Neuhoff等，1988)或銀(自Blum等，1987改良的)對凝膠染色。對于改良的銀染，將凝膠在40％乙醇/10％醋酸中固定1h，用30％乙醇洗滌兩次，用水洗滌一次，每次20min，在0.02％Na2S2O3中敏化1min，用水洗滌(3×20sec)，用冷的0.1％AgNO3在4℃孵育20min，用水洗滌(3×20sec，然后1×1min)，用3％NaCO3/0.05％福爾馬林顯色，并在水中再一次洗滌20sec。最后用5％醋酸終止染色。
1.10成像在暴露于Hyperfilm ECL(Amersham Biosciences，烏普薩拉，瑞典；Cat-No.RPN2132)5min之后通過化學發光(ECL plus，AmershamBiosciences，烏普薩拉，瑞典；Cat-No.RPN2132)檢測抗體，并通過Adefo-Developer(00009)和Adefo-Fixator(00062)(ADEFO-CHEMIEGmbH，Nürnberg，德國)顯色。
1.11凝膠內消化根據Pandey等，2000進行凝膠內消化。簡言之，人工切下凝膠斑點，且使用胰蛋白酶(豬的；Promega GmbH，曼海姆，德國；Cat-No.V511A)進行切割。
1.12 MALDI-TOF質譜使用Voyager DE-STR MALDI-TOF工作站(Applied Biosystems，Foster City，CA，美國)進行MALDI-TOF質譜。通過小液滴干燥法制備樣品，并將其在2×96孔涂有聚四氟乙烯的樣品板上點樣，使用□-氰基-羥基-肉桂酸(3mg/ml，溶于乙腈/三氟乙酸中)作為基質。檢測范圍為700-4000Da。
1.13蛋白質測定使用BCA試劑盒(Pierce Chemical Company，羅克福德，伊利諾斯州，美國)根據制造商的說明(在562nm檢測)測定樣品的蛋白質含量。
1.14組織分布模式在凝膠上每個泳道施加50μg蛋白質。從BioCat GmbH(海德爾堡，德國)購買不同的人組織。血小板和巨核細胞中LIMK的檢測通過事先在上清液中富集(圖4和圖5分別是離心15000×g 15min或3000×g 5min)而增強。
1.15 Taqman分析對于擴增，使用以下的PCR方案。以下所有的用于擴增的試劑都來自Applied Biosystems(Foster City，美國)20ng基因組DNA；1單位TaqGold聚合酶；1×Taq聚合酶緩沖液；500μM dNTP；2.5mmol/l MgCl2；200nmol/l每一個擴增引物對；H2O ad 5μl。
PCR擴增過程95℃×10min×1循環95℃×30sec70℃×30sec×2循環95℃×30sec65℃×30sec×2循環95℃×30sec60℃×30sec×2循環95℃×30sec56℃×30sec72℃×30sec×40循環72℃×10min4℃×30sec ×1循環1.16設備使用裝備有CM5芯片和Ni-NTA芯片的Biacore 3000最高性能研究系統(Biacore International SA，79111Freiburg，德國)進行實驗。
結果2.1 LIMK-1與整聯蛋白GPIIb相互作用通過與商業上可獲得的GPIIb的特異性抗體進行免疫共沉淀，我們富集了具有GPIIb的蛋白質復合物。這些復合物通過2維凝膠電泳分離(圖1)。在該實驗中獲得的結果清楚地證明了LIMK-1與人血小板提取物中的整聯蛋白GPIIb免疫共沉淀。
為了驗證這些結果，我們利用血小板提取物以及人巨核細胞系DAMI和MEG-01提取物與商業上可獲得的LIMK-1的特異性抗體進行免疫沉淀，隨后通過Western分析檢測GPIIb(圖2)。這些結果證實了人血小板中整聯蛋白GPIIb與LIMK-1相結合的發現。在人巨核細胞系DAMI和MEG-01中沒能顯示GPIIb與LIMK-1之間的相互作用。這些巨核細胞系是前體細胞系，經分化后能產生血小板(Fugman等，1990；George 2000；Greenberg等，1988；Ogura等，1988；Schick等，1998；Takeuchi等，1998；Vittet等，1992)。然而，對于我們的實驗，我們使用了這些非分化形式的細胞系。當在這些非分化的巨核細胞系中分析GPIIb整聯蛋白的表達水平時，我們發現GPIIb在這些細胞系中的表達相對于在血小板中的表達要低得多。這解釋了為什么我們在這些細胞系中檢測不到整聯蛋白與LIMK-1之間的相互作用。
為進一步驗證我們的結果，我們利用血小板提取物與商業上可獲得的LIMK-1和GPIIb的特異性抗體進行免疫沉淀，隨后通過Western分析檢測LIMK-1(圖3)。這些結果再次證實了我們先前的發現，即在人血小板中整聯蛋白GPIIb與LIMK-1相結合。
2.2 LIMK-1的組織分布使用LIMK-1的特異性抗體，我們分析了LIMK-1在血小板以及巨核細胞系DAMI和MEG-01中的表達(圖4)。這樣，使用LIMK-1的特異性抗體，我們證實了LIMK-1在血小板中和在巨核細胞系DAMI和MEG-01中的表達。
此外，為了分析LIMK-1在不同人組織中的表達，我們通過凝膠電泳分離了人組織提取物進行隨后的Western分析(圖5)。這些結果顯示了LIMK-1在睪丸、心臟、血小板、肌肉和腦組織中表達。雖然其表達并非絕對是血小板特異性的，但LIMK-1并非在所有組織中都普遍表達。這一發現得到Taqman分析的證實(圖6)，該圖顯示了LIMK-1在腦、胎腦和睪丸中的表達。血小板沒有在該Taqman組中表示。
權利要求
1.LIMK-1或LIMK-1類似物用于結合GPIIb的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中LIMK-1類似物是GPIIb/IIIa下游信號傳遞的激活劑或抑制劑，優選為其抑制劑。
3.根據權利要求1或2的用途，用于GPIIb/IIIa下游信號傳遞的激活或抑制，優選用于其抑制。
4.LIMK-1配體用于激活或抑制GPIIb/IIIa下游信號傳遞的用途，優選用于其抑制。
5.根據權利要求4的用途，其中LIMK-1配體是一種LIMK-1激動劑或LIMK-1拮抗劑，優選為LIMK-1拮抗劑。
6.LIMK-1、LIMK-1類似物或LIMK-1配體在制備用于預防或治療血栓形成或血液凝固疾病的藥物中的用途。
7.根據權利要求6的用途，其中LIMK-1類似物是GPIIb/IIIa下游信號傳遞的抑制劑，或者其中LIMK-1配體是LIMK-1拮抗劑。
8.根據權利要求6或7的用途，其中所述疾病是與血栓形成或血液凝固增加相關的疾病。
9.根據權利要求6至8任一項的用途，其中所述疾病是動脈血栓形成性疾病。
10.根據權利要求6至9任一項的用途，其中所述疾病選自心肌梗塞、不穩定型心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、冠狀動脈疾病、冠狀動脈溶栓后再閉塞、血栓形成期間的閉塞和冠狀動脈再狹窄、中風、短暫性腦缺血發作、肺栓塞、左心室功能障礙、患有心血管和腦血管疾病的患者的臨床血管并發癥的二級預防、動脈粥樣硬化、血管介入性策略的結合藥物治療。
11.一種篩選LIMK-1類似物的方法，其中該方法包括步驟(a)提供GPIIb蛋白和任選地至少一個其下游信號傳遞元件；(b)提供測試化合物；和(c)檢測測試化合物對GPIIb蛋白的結合，其中所述測試化合物衍生自LIMK-1。
12.根據權利要求11的方法，包括如下步驟以替換步驟(c)(c’)檢測GPIIb/IIIa和/或其下游信號傳遞的激活或抑制。
13.一種篩選LIMK-1配體的方法，其中該方法包括步驟(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供測試化合物；和(c)檢測測試化合物對LIMK-1蛋白的結合。
14.根據權利要求13的方法，還包括如下步驟以替換步驟(c)(c’)檢測LIMK-1或GPII/IIIa下游信號傳遞的激活或抑制，優選檢測其失活。
15.一種篩選與GPIIb/IIIa和/或其下游信號傳遞級聯相互作用的測試化合物的方法，其中該方法包括步驟(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供GPIIb和/或至少一種其下游信號傳遞元件；(c)提供測試化合物；和(d)檢測該化合物與LIMK-1蛋白的相互作用。
16.根據權利要求13至15任一項的方法，其中以化學化合物文庫的形式提供所述測試化合物。
17.根據權利要求11至16任一項的方法，其中測試化合物與所述GPIIb蛋白或所述LIMK-1蛋白的結合或其對GPIIb和/或其下游信號傳遞的效應通過異質或均質測定法檢測。
18.根據權利要求17的方法，其中異質測定法是ELISA(酶聯免疫吸附試驗)、DELFIA(解離增強鑭系熒光免疫分析)或SPA(閃爍親近測定法)。
19.根據權利要求17的方法，其中均質測定法是TR-FRET(時間分辨熒光共振能量轉移)測定法、FP(熒光偏振)測定法、ALPHA(增強發光鄰近均質分析)、EFC(酶片斷互補)測定法。
20.根據權利要求11至19任一項的方法，其中該方法在陣列上進行。
21.根據權利要求11至17任一項的方法，其中該方法使用整個細胞進行。
22.根據權利要求11至21任一項的方法，其中該方法在機器人系統中進行。
23.根據權利要求11至22任一項的方法，其中該方法使用微流體學進行。
24.根據權利要求11至23任一項的方法，其中該方法是一種高通量輸出篩選LIMK-1類似物或LIMK-1配體的方法。
25.一種制備用于預防或治療血栓形成或血液凝固疾病的藥物的方法，其中該方法包括步驟(a)實施根據權利要求11至24任一項的方法，(b)提供適量的所檢測的化合物，和(c)將所檢測的測試化合物與一種或多種藥學上可接受的載體或輔助物質一起配制。
26.根據權利要求25的方法，其中該疾病是一種動脈血栓形成性疾病。
27.根據權利要求26的方法，其中動脈血栓形成性疾病選自心肌梗塞、不穩定型心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、冠狀動脈疾病、冠狀動脈溶栓后再閉塞、血栓形成期間的閉塞和冠狀動脈再狹窄、中風、短暫性腦缺血發作、肺栓塞、左心室功能障礙、患有心血管和腦血管疾病的患者的臨床血管并發癥的二級預防、動脈粥樣硬化、血管介入性策略的結合藥物治療。
全文摘要
本發明涉及LIMK－1、LIMK－1類似物或LIMK－1配體用于結合GPIIb和/或激活或抑制GPIIb/IIIa下游信號傳遞(的用途)，用于制備預防或治療血栓形成或血液凝固疾病的藥物(的用途)，(涉及)篩選LIMK－1類似物或LIMK－1配體的方法以及制備治療血栓形成或血液凝固疾病的藥物的方法。
文檔編號G01N33/86GK1889973SQ200480036080
公開日2007年1月3日 申請日期2004年11月23日 優先權日2003年12月4日
發明者A·呂克, T·萊烏, M·赫爾曼, G·西本霍恩 申請人:塞諾菲-安萬特德國有限公司