專利名稱：：能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，特別涉及一種既能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白(Decorin)及其制備方法和在抑制腫瘤生長和轉移中的應用。
背景技術：
：最近表皮細胞生長因子受體家族新成員HER-2/neu(c-ErbB-2)癌基因在乳腺癌的發生發展中所起的重要作用引起病理學家和臨床醫學家的高度關注。HER-2/neu基因定位于人17號染色體，編碼一185KD的跨膜糖蛋白，即表皮生長因子-2受體(HER-2)。與表皮生長因子受體家族(EGFR)其它成員一樣，HER-2具有酪氨酸激酶活性，介導細胞的生長與分化信號的傳導。HER-2可以單體、同源或異源二聚體的形式存在于細胞膜，以異源二聚體的酪氨酸激酶活性為最強。在正常細胞表面，HER-2表達甚微，幾乎無異源二聚體存在；因而介導促生長信號的能力亦相對微弱。但HER-2在許多腫瘤細胞則以異源二聚體的形式高水平表達，進而形成強烈的促生長信號。有證據提示HER-2/neu過度表達與乳腺癌的發生、發展及轉移密切相關。動物實驗發現HER-2/neu在轉基因小鼠乳腺上皮表達可誘發轉移性腫瘤。臨床研究表明約2030%的浸潤性乳腺癌患者的乳腺癌細胞HER-2/neu明顯上調，HER-2高度表達，而且轉移灶與原發灶癌細胞的表達水平一致；凡高水平HER-2表達的浸潤性乳腺癌病例，對常化療不敏感、預后不良、容易轉移、死亡率高。Herceptin是一新近被FDA批準進入III期抗乳腺癌臨床實驗的重組人HER-2單克隆抗體。其臨床前研究表明Herc印tin通過直接阻斷HER-2的胞外段，可明顯抑制HER-2表達陽性的乳腺癌細胞生長。臨床多中心實驗表明Herceptin與化療藥聯合，可明顯提高治療反應率，延緩病程，增加生存期。以上證據支持HER-2可作為新的特異性治療浸潤性乳腺癌的靶點(M丄DuffyBiochemicalmarkersinbreastcancer:whichonesareclinicallyuseftilClinicalBiochemistry2001;34:347-352)。小分子富亮氨酸蛋白糖甙家族成員飾膠蛋白(Decorin)因被證實是一強的腫瘤細胞生長負性調節因子而成為腫瘤研究領域的熱點。Decorin由核心蛋白及其以共價鍵相連的氨基糖甙鏈組成，未成熟肽含有359個氨基酸。內源性Decorin在血管、結蒂組織和某些腫瘤等組織表達，尤以急性損傷組織的上皮下層表達甚強。在腫瘤組織，Decorin由其兩種主要支架細胞成纖維細胞和平滑肌細胞分泌產生并高濃度聚集于腫瘤細胞間的基質中。作為EGFR天然配體，Decorin通過與EGFR相互作用，抑制腫瘤細胞生長、浸潤和遠距離轉移。Decorin對腫瘤細胞生長的負性調節作用以及高度濃集于腫瘤細胞侵及的微環境的特性，實際上是宿主天然抗腫瘤免疫功能的體現(MarkoStander，UlrikeNaumannandWolfgangWickTransforminggrowthfactor-betaandP21:multiplemoleculartargetsofdecorin-mediatedsuppressionofneoplasticgrowthCellTissueRes1999;296:221-227;RenatoV,Iozzo,DavidK.Moscatello,DavidJ.McQuillanetal.Decorinisabiologicalligandfortheepidermalgrowthfactor.TheJournalofBiologicalChemistry1999;274(8):4489-4492)。Manoranjan等用重組Decorin轉染HER-2高表達的乳腺肉瘤細胞MDA-453,使該細胞HER-2的表達量降低約40%，其酪氨酸激酶的活性幾乎完全喪失，內源性P21蛋白(一種強的細胞周期素依賴激酶抑制因子)活性增強，進而細胞持續處于周期停止、生長延遲的抑制狀態。裸鼠實驗顯示Decorin轉染HER-2高表達的乳腺肉瘤細胞MDA-453不能誘導腫瘤形成。因此，Decorin被認為是作為一種EGFR天然特異性拮抗劑，能安全有效地抑制HER-2高表達的腫瘤細胞(ManoranjanSantra，IngeEichstetterandRenatoV.IozzoAnanti-oncogenicroleforDecorindown-regulationofErbB2leadstogrowthsuppressionandcytodifferentiationofmammarycarcinomacells.TheJournalofBiologicalChemistry2000;275(45):35153-35161)。
發明內容為了解決上述現有技術的不足之處,本發明的首要目的在于提供一種能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白(Decorin)。本發明的另一目的在于提供上述飾膠蛋白(Decorin)的制備方法。本發明的再一目的在于提供上述飾膠蛋白(Decorin)在制備抑制腫瘤細胞生長和轉移的藥物中的應用。本發明利用特異性的PCR引物從人骨髓cDNA中采用PCR的方法克隆Decorin的成熟肽編碼序列，然后直接連接到原核克隆表達載體PET30a(+)，轉化至克隆菌株JM109，經測序鑒定序列正確后，轉化至表達菌株BL21(DE3)，利用IPTG誘導表達Decorin飾膠蛋白，然后分離包含體、純化、復性、酶切標簽蛋白、HPLC分離目標蛋白，最終得到Decorin飾膠蛋白純品；利用HER-2高表達的乳腺肉瘤細胞MDA-MB-231，采用MTT的方法檢測Decorin對乳腺癌細胞的抑制效應。本發明的目的通過如下技術方案來實現:一種能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白(Decorin),所述能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白Decorin的核酸編碼序列(飾膠蛋白Decorin基因成熟肽的核酸編碼序列)為TATAAG3'。所述能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白Decorin氨基酸序列(飾膠蛋白Decorin基因成熟肽的氨基酸編碼序列)為AspGluAlaSerGlylieGlyProGluValProAspAspArgAspPheGluProSerLeuGlyProValCysProPheArgCysGinCysHisLeuArgValVal'GlnCysSerAspLeuGlyLeuAspLysValProLysAspLeuProProAspThrThrLeuLeuAspLeuGinAsnAsnLyslieThrGlulieLysAspGlyAspPheLysAsnLeuLysAsnLeuHisAlaLeulieLeuValAsnAsnLyslieSerLysValSerProGlyAlaPheThrProLeuValLysLeuGluArgLeuTyrLeuSerLysAsnGinLeuLysGluLeuProGluLysMetProLysThrLeuGinGluLeuArgAlaHisGluAsnGlulieThrLysValArgLysValThrPheAsnGlyLeuAsnGinMetlieVallieGluLeuGlyThrAsnProLeuLysSerSerGlylieGluAsnGlyAlaPheGinGlyMetLysLysLeuSerTyrlieArgHeAlaAspThrAsnlieThrSerlieProGin.GlyLeuProProSerLeuThrGluLeuHisLeuAspGlyAsnLysHeSerArgValAspAlaAlaSerLeuLysGlyLeuAsnAsnLeuAlaLysLeuGlyLeuSerPheAsnSerlieSerAlaValAspAsnGlySerLeuAlaAsnThrProHisLeuArgGluLeuHisLeuAspAsnAsnLysLeuThrArgValProGlyGlyLeuAlaGluHisLysTyrlieGinValValTyrLeuHisAsnAsnAsnHeSerValValGlySerSerAspPheCysProProGlyHisAsnThrLysLysAlaSerTyrSerGlyValSerLeuPheSerAsnProValGinTyrTrpGlulieGinProSerThrPheArgCysValTyrValArgSerAlalieGinLeuGlyAsnTyrLys。上述能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白(Decorin)的制備方法，包括如下步驟(1)根據Genebank數據庫提供的人Decorin的cDNA序列設計RT-PCR引物Decorin-F和Decorin-R,擴增Decorin成熟肽編碼序列。(2)從人骨髓細胞中提取總RNA，反轉錄成單鏈cDNA。(3)利用引物Decorin-F和Decorin-R以反轉錄合成的單鏈cDNA為模板PCR擴增Decorin，得到Decorin的PCR產物。所述PCR熱循環程序條件如下94°C5min;94°C10S，56.0°C10S，72°C5S，30個循環；72°C，5min。(4)將步驟(3)獲得的Decorin的PCR產物經膠回收后，與PET30a(+)質粒載體用5am/ff+￡co//進行雙酶切pET-30a(+)質粒載體的酶切產物與PCR產物的酶切產物進行連接，將Decorin的PCR產物直接插入pET-30a(+)質粒載體，構建得到Decorin/pET-30a(+)，酶切初步鑒定后進行測序確認。(5)經確證的Decorin/pET-30a(+)轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)細胞中，用IPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)進行誘導表達，收獲并裂解菌體，上清液通過Ni親和介質(鎳固相親和層析樹脂)進行純化，最后用腸激酶切掉His-Tag，過RP-HPLC(反相高效液相色譜)得到純化的能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白(Decorin)。所述引物Decorin陽F:5'cgggatcccatcatcaccatcaccatgacgacgacgacaaggatgaggcttctgggataggcc3';其5，-端具有BamHI酶切位點和EK識別位點一(Asp)4Lys的編碼序列；所述引物Decorin-R:5'ggaattcttacttatagtttccgagtt';所述引物含有酶切位點EcoRI和終止密碼子。上述能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白(Decorin)在抑制人乳腺癌細胞或組織的生長和轉移中的應用。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白Decorin蛋白具有如下特點1)能特異性識別HER-2高表達的乳腺腫瘤細胞，故高選擇性地大量聚集在乳腺原發腫瘤及其轉移灶組織；2)Decorin能特性異性阻斷HER-2高表達乳腺癌的浸潤性生長和轉移。圖l為酶切鑒定Decorin/PET30a(+)。其中，1，Decorin/PET30a(+)BamHI單酶切；2,Decorin/PET30a(+)BamHI&EcoRI雙酶切；3，Decorin/PET30a(+)EcoRI單酶切；4，Decorin/PET30a(+);M，Marker。圖2為Decorin/PET30a(+)重組體的測序結果。圖3為Decorin/His-tag的誘導表達。其中，1、蛋白分子量Marker，Kd;2、包含體溶液；3、4、Ni親和層析后的目標蛋白。圖4為Decorin/His-tag的EK酶切除His-tag。其中，1、Ni親和層析后復性的Decorin/His-tag;2、酶切后HPLC分離后的Decorin;3、復性的Decorin/His-tagEK酶切產物；4、蛋白分子量Marker，Kd。圖5為Decorin對MDA-MB-231乳腺癌細胞的抑制效應。圖6為Decorin對SDF-la誘導MDA-MB-231乳腺癌細胞趨化遷移的抑制效應。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1Decorin基因的克隆及其原核表達系統的構建1.引物設計根據Genebank數據庫提供的人Decorin的cDNA序列按照一般引物設計原則和PET30a(+)克隆的要求，采用primer5.0以編碼區為模板設計RT-PCR引物Decorin-F和Decorin-R，直接擴增Decorin成熟肽編碼序列。所述人Decorin基因cDNA序列的5'-末端引物(Decorin-F)(用以克隆人Decorin基因成熟肽編碼序列)5'cgggatcccatcatcaccatcaccatgacgacgacgacaaggatgaggcttctgggataggcc3，；其5，-端具有Bamffl酶切位點和EK識別位點一(Asp)4Lys的編碼序列；所述人Decorin基因cDNA序列的3'-末端引物(Decorin-R)(用以克隆人Decorin基因成熟肽編碼序列)5'ggaattcttacttatagtttccgagtt';所述引物含有酶切位點EcoRI和終止密碼子。2.總RNA的提取自液氮中取出人骨髓細胞樣品約0.25ml，立即加入0.75mlTRIZOLLSReagent(總RNA提取試劑)，待樣品解凍后，用吸管反復吹打裂解骨髓細胞。裂解的細胞勻漿在1530°C條件下保溫5min以便核蛋白復合體的解離。然后加入0.2ml氯仿，用力振蕩15s并在1530°C條件下保溫215min。12，000xg、28°C離心15min。離心后的樣品分為三層，RNA即存在于上層無色清液中(總體積約為TRIZOLLSReagent的70。/0。取上層清液于新的EP管中，加入0.5ml異丙醇混勻，1S30。C保溫10min，12，000xg，28。C離心10min。去上清，用lml70%的乙醇渦旋洗滌沉淀，7，500xg，28。C離心5min。去上清，室溫揮發殘余乙醇510min，然后將沉淀溶解于20ulDEPC處理的水中，檢測A260/A280比值，保存于-70。C備用。(RNA提取過程中的所有器皿、溶液和水均經DEPC(焦碳酸二乙酯)處理)。3.反轉錄合成單鏈cDNA:單鏈cDNA的合成按SuperScriptTMFirstStrandSynthesisSystemforRT國PCR(Invitrogenlifetechnologies,Cat.No.11904-018)所提供的方法采用oligo(dT)primer進行，概述如下a.按如下順序加入各組分到已編號的0.2ml的PCR薄壁管中混勻，65°C保溫5min，然后置于冰上至少1min。組分樣品RNA非反轉錄對照對照RNA5嗎總RNA—14nl<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>c.向a步驟中的每管加入一份9^1的反應混合液，輕輕混勻，低速離心收集。d.42°C保溫2min。e.除非反轉錄對照外，每管加入IW(50單位)SuperscriptII(反轉錄酶)，混勻，42。C保溫50min。f.70。C保溫15min終止反應，置于冰上冷卻。g.每管加入lplRNaseH(RNA酶)，37°C保溫20min，然后保存于—20°C備用。4.Decorin的PCR擴增利用引物Decorin-F和Decorin-R以反轉錄合成的單鏈cDNA為模板PCR擴增Decorin，得到Decorin的PCR產物。PCR熱循環程序條件如下94°C5min;94。C10S，56.0。C10S，72。C5S，30個循環；72°C，5min。5.Decorin/PET30a(+)的構建Decorin的PCR產物經膠回收后，與預先制備PET30a(+)質粒載體按照下表進行雙酶切:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>酶切產物全部上樣到lxTAE(三硝基氨基甲烷-EDTA-醋酸鈉緩沖液)配制的1.5%瓊脂糖凝膠(含EBlpg/ml)上進行電泳。紫外透射反射分析儀檢測條帶分離開后，凝膠成像系統照相。根據DNAMarker判斷目標條帶所在的位置，分別用手術刀片準確切下目標帶所在的凝膠塊，轉入干凈的1.5ml試管中。用E.Z.N.A應GelExtractionKit回收目標片段，回收過程按試劑盒說明書進行。pET-30a(+)的酶切產物最后用20nl滅菌ddH20洗脫，濃度約為0.05pmol/^l;PCR產物的酶切產物最后用40pl滅菌ddH20洗脫，濃度約為0.2-0.6pmol4ilopET-30a(+)(質粒載體)和PCR產物的雙酶切回收產物的連接按下面的反應體系進行l(HU連接反應體系如下16'C連接反應0.5h以上。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述連接體系采用熱休克方法直接轉化至感受態JM109菌株。陽性克隆的篩選PCR法作初步鑒定挑取單個菌落，接種于盛有500plLB(含有50^ig/mlKanamycin(卡那霉素))液體培養基的1.5mlEP管中，37'C，250r/min振蕩培養4h，以此菌液為模板，PCR法確認pET-30a(+)質粒載體中插入片段的大小。PCR體系同前，只是PCR模板為各自的陽性菌落培養液，PCR循環中的退火溫度比進行PCR基因擴增時相應降低12°C。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，有PCR產物且產物DNA片段與用于克隆連接的外源DNA片段大小相同的初步確定為陽性克隆。質粒提取及酶切鑒定從PCR篩選出的陽性克隆中挑取一個單菌落接種5mLLB液體培養基(50ng/mlKanamycin),37°C，過夜培養(約1214h)。次日，10000g，lmin離心，收集細胞。按E.Z.N.A.PlasmidMiniprepKitI說明書提取質粒，質粒經BamHI/EcoRI單/雙酶切，再次驗證是否有外源片段插入。經PCR和酶切篩選的重組質粒進一步測序鑒定。酶切鑒定結果表明，Decorin基因已經成功插入PET30a(+)載體(圖1)，構建得到Decorin/pET-30a(+)重組質粒，測序結果表明，Decorin克隆成功，序列完全正確(圖2)。實施例2Decorin/pET-30a(+)重組質粒的原核表達和純化1、經確證的Decorin/pET-30a(+)重組質粒約200ng加入200nl感受態大腸桿菌BL21(DE3)(NOVAGEN)細胞中(氯化鈣法制備)，輕輕混勻，在冰上放置30min，然后在42。C熱休克90s，立即轉到冰上放置2min，隨后加入800plLB培養液在37。C條件下振蕩培養45min,取200til鋪到含50tig/ml卡那霉素的LB平板，37。C培養過夜(約12hr)，隨機挑取5個陽性菌落分別接種于50ml的LB液體培養基(含50pg/ml卡那霉素)37。C振蕩培養約12hr，然后分別取5ml上述培養液轉接于500ml的LB液體培養基(含50ng/ml卡那霉素)37。C振蕩培養約3hr，然后再取上述培養液20ml轉接到2000ml的LB液體培養基(含50jig/ml卡那霉素)37。C振蕩培養，當OD600二0.5時，分別加入終濃度為0.75mM的IPTG37。C誘導表達3hr，3000xg離心15min收獲菌體。然后按ProBond頂resinForPurificationof6xHis國TaggedProteins(鎳固相親和層析樹脂)(Invitrogen，Catalognos.R801-01，R801-15)的操作說明進行純化，具體操作如下1)Guanidinium(鹽酸胍)裂解緩沖液(6M鹽酸胍，2OmMNaPO4，pH7.8500mMNaCl)至37。C。2)重懸菌體于40ml鹽酸胍裂解緩沖液中。3)在冰上超聲處理細胞裂解液5s，間隔5s,重復4次。4)在60。C條件下緩慢振蕩30min以保證菌體全部裂解。5)3，000xg離心15min，將上清轉入干凈的試管中，取5pl裂解液上清用作SDS-PAGE檢測樣品。6)加10mlProBondWresin(樹脂)到40ml上清液中。7)室溫下輕微振蕩結合30min，800xg離心15min，去除上清液。8)用40mlDenaturing(變性)結合緩沖液(8M尿素(Urea),20mMNaPO4，pH7.8，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800xg離心15min，小心去除上清液，并取50pl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復一次。9)用40ml變性洗滌緩沖液(8MUrea，20mMNaPO4，pH6.0，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800xg離心15min，小心去除上清液，并取50pl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復一次。10)用80ml非變性洗滌緩沖液(20mMimidazole(咪唑)，20mMNaP04，pH8.0，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800xg離心15min，小心去除上清液，并取50pl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復三次。11)用8ml溶出緩沖液(500mM咪唑，20mMNaPO4，pH8.0，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗漆15min，800xg離心15min，小心吸取上清于干凈的試管中，并取50^上清用作SDS-PAGE檢測樣品，其余保存于—80°C。SDS-PAGE檢測結果表明，Decorin/pET-30a(+)重組體能夠在大腸桿菌BL21(DE3)中正常表達，Ni親和純化出約37KD的目標蛋白帶，與理論分子量37.4KD—致，純度至少在80%以上(圖3)。12)在4。C用復性緩沖液A(3M尿素，20mMTris-HCl(pH7.5)，lmMEDTA，lmM2-巰基乙醇(2-Mecaptoethano1)，135mMNaCl)透析上述樣品1624hr。用復性緩沖液B(1.5M尿素，20mMTris-HCl(pH7.5)，lmMEDTA，lmM2-巰基乙醇，135mMNaCl)繼續透析上述樣品1624hr。用復性緩沖液C(20mMTris-HCl(pH7.5),lmMEDTA，135mMNaCl，O.lmMGSH(還原型谷胱甘肽)，O.OlmMGSSG(氧化型谷胱甘肽))繼續透析上述樣品1624hr。用復性緩沖液D(20mMTris-HCl(pH7.5)，135mMNaCl)繼續透析上述樣品1624hr。13)超濾濃縮后按說明書提供的條件用腸激酶EnterokinaseMaxTM(EKMaxTM)(Invitrogen，Catalognos.El80-01，E180-02)切除His-Tag。14)反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離Decorin、His-Tag和腸激酶(Enterokinase)，最后得純化的Decorin飾膠蛋白，儲存于-80°C備用(圖4)。實施例3生物活性測定1、MTT收集對數期MDA-MB-231細胞(人乳腺癌細胞系)，調整細胞懸液濃度(5xl03Cells/ml)，接種于7塊96孔板，每孔200pL;置37。C、5%0)2溫箱培養使細胞貼壁;加入預定終濃度(10nmol/L)的Decorin蛋白，置37°C、5%C02培養箱，開始計時培養，分別在第0hr(加藥完畢開始計時時為0點)、24hr、48hr、72hr、96hr、120hr、144hr等時間點取出96孔板進行常規MTT檢測，最后進行數據統計，以OD(490nm)值為縱軸，處理時間為橫軸，描繪Decorin對乳腺癌細胞MDA-MB-231生長的抑制效應(圖5)。2、Decorin抑制野生型SDF-la誘導的MDA-MB-231細胞遷徙的活性分別用不同濃度梯度的Decorin(10-91(T5mol/L)預處理MDA-MB-231細胞，37°C、3hr,然后將經預處理的細胞加入趨化小巢的上腔中，并將裝有細胞的上腔置于加有20nM的SDF-la的下腔之上，處理5小時，然后取下上腔底部濾膜，用棉刷輕輕去除膜上表面黏附的細胞，保留下表面黏附的細胞，將濾膜置入甲醇溶液固定后用蘇木精伊紅染色，記數濾膜下表面的細胞數。與未經任何處理的細胞相比，觀察Decorin對SDF-la誘導MDA-MB-231遷徙的抑制作用。結果表明Decorin明顯抑制SDF-la誘導的MDA-MB-231遷徙，其抑制作用呈明顯的劑量依賴關系(圖6)。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING〈110〉溫州醫學院<120>能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白及其制備方法和應用〈130〉2〈160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉987<212>DNA<213〉Homosapiens<220>〈221〉CDS<222>(1)(987)<223>飾膠蛋白Decorin基因成熟肽的編碼序列〈400>1gatgaggettctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttc48AspGluAlaSerGlylieGlyProGluValProAspAspArgAspPhe151015gagccctecetaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatgccatctt96GluProSerLeuGlyProValCysProPheArgCysGinCysHisLeu202530cgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggat144ArgValValGinCysSerAspLeuGlyLeuAspLysValProLysAsp354045cttccccctgacacaactctgetagacctgcaaaacaacaaaataacc192LeuProProAspThrThrLeuLeuAspLeuGinAsnAsnLyslieThr505560gaa_ateaaagatggagactttaagaacctgaagaaccttcacgcattg240GlulieLysAspGlyAspPheLysAsnLeuLysAsnLeuHisAlaLeu65707580attcttgtcaacaataaaattageaaagttagtcctggagcatttaca288lieLeuValAsnAsnLyslieSerLysValSerProGlyAlaPheThr859095cctttggtgaagttggaacgactttatctgtecaagaatcagctgaag336ProLeuValLysLeuGluArgLeuTyrLeuSerLysAsnGinLeuLys100105110gaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccat384GluLeuProGluLysMetProLysThrLeuGinGluLeuArgAlaHis115120125gag朋tgaga/tcacca<aagtgcgagttactttcaMggactgaac432GluAsnGlulieThrLysValArgLysValThrPheAsnGlyLeuAsn130135140cagatgattgtca<tag朋ctgggc￡iccaatccgctg犯gageteagga480GinMetlieVallieGluLeuGlyThrAsnProLeuLysSerSerGly145150155160attgaaaatggggetttccagggaatgaagaagetctectacatecgc528lieGluAsnGlyAlaPheGinGlyMetLysLysLeuSerTyrlieArg165170175attgetgataccaatateaccageattcctcaaggtcttcctccttec576lieAlaAspThrAsnlieThrSerlieProGinGlyLeuProProSer180185190cttacggaattacatcttgatggcaacaaaateageagagttgatgca624LeuThrGluLeuHisLeuAspGlyAsnLyslieSerArgValAspAlagetAlaeia_cAsn225ctgLeugggGlyAsn8CCThrcagGin305tctSerageSer210ageSeraggArgctgLeuatelie肪3Lys290tacTyr195ctgLeuateliegsgGlugesAlatctSer275朋gLystggTrpgccAla3￡iaggsLysGlytctgetSerAlacttcacLeuHis245gagcatGluHis260gtagttValValgettctAlaSergagatsGlulieattliecaaetcGinLeu325200205ctgaataatttggetaagttgggattgagtttc672LeuAsnAsnLeuAlaLysLeuGlyLeuSerPhe215220gttgacaatggctctctggccaacacgcctcat720ValAspAsnGlySerLeuAlaAsnThrProHis230235240ttggacaacaacaagcttaccagagtacctggt768LeuAspAsnAsnLysLeuThrArgValProGly250255aagtacatecaggttgtctaccttcataacaac816LysTyrlieGinValValTyrLeuHisAsnAsn265270ggateaagtgacttctgcccacctggacacaac864GlySerSerAspPheCysProProGlyHisAsn280285tattegggtgtgagtcttttcageaacccggtc912TyrSerGlyValSerLeuPheSerAsnProVal295300cagccatecaccttcagatgtgtctacgtgcgc960GinProSerThrPheArgCysValTyrValArg310315320ggaaactataag987GlyAsnTyrLys〈210>2<211>329〈212〉PRT〈213>Homosap16ns〈400>2AspGluAla1GluProSerGlylieGlyProGluValProAspAspArgAspPheArgValLeuPro50Glulie65lieLeuSerVal35ProLeu20Gin5GlyProValCysCysSerAspAspThrThrLysAspGlyVaJAsnProLeuValGluLeuGluAsn130GinMet145lieGluPro115GluLys100GluAsn85LeuAsp70LyslieVallieAsnGlylieAlaAspThr180Ala165AsnGlu150PheLeu55PheL>eu40LeuPro25Gly10PheLeuArgAspAspLeuGinLysAsnLeulieSerLysGluArgLeuLysMetProlieThrLysVal135LeuLys120ArgTyr105ThrVal90LeuLys75SerCysLysAsn60AsnGinVal45Asn15HisLeuCys30ProLysAspLyslieThrLeuHisAlaProGlyAlaSerLysAsnLeuGinGluLysValThrGlyGinGlyMetThrAsnlieThrSerlie185Lys170ProPro155LysPhe140LeuLeu125AsnGin110Phe95LeuLeu80ThrLysAlaHisGlyLeuAsnLysSerSerLeuSerTyrGinGlyLeuPro190lie175ProGly160ArgSerLeuThrGluLeuHisLeuAspGlyAsnLyslieSerArgValAspAla195200205AlaSerLeuLysGlyLeuAsnAsnLeuAlaLysLeuGlyLeuSerPhe210215220AsnSerlieSerAlaValAspAsnGlySerLeuAlaAsnThrProHis225230235240LeuArgGluLeuHisLeuAspAsnAsnLysLeuThrArgValProGly245250255GlyLeuAlaGluHisLysTyrlieGinValValTyrLeuHisAsnAsn260265270AsnlieSerValValGlySerSerAspPheCysProPro'GlyHisAsn275280285ThrLysLysAlaSerTyrSerGlyValSerLeuPheSerAsnProVal290295300GinTyrTrpGlulieGinProSerThrPheArgCysValTyrVaJArg305310315320SerAlalieGinLeuGlyAsnTyrLys325〈210〉3<211>63〈212〉DNA<213>人工序列<220〉〈221>misc—feature<223>根據人Decorin基因cDNA序列設計的5'-末端引物,用以克隆人Decorin基因成熟肽編碼序列<400〉3cgggatcccatcatcaccatcaccatgacgacgacgacaaggatgaggcttctgggatag60gcc63<210>4〈211〉27<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223>根據人Decorin基因cDNA序列設計的3'-末端引物，用以克隆人Decorin基因成熟肽編碼序列<400>4ggaattcttacttatagtttccgagtt2權利要求1、一種能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白，其特征在于所述飾膠蛋白的核酸編碼序列為5’GATGAGGCTTCTGGGATAGGCCCAGAAGTTCCTGATGACCGCGACTTCGAGCCCTCCCTAGGCCCAGTGTGCCCCTTCCGCTGTCAATGCCATCTTCGAGTGGTCCAGTGTTCTGATTTGGGTCTGGACAAAGTGCCAAAGGATCTTCCCCCTGACACAACTCTGCTAGACCTGCAAAACAACAAAATAACCGAAATCAAAGATGGAGACTTTAAGAACCTGAAGAACCTTCACGCATTGATTCTTGTCAACAATAAAATTAGCAAAGTTAGTCCTGGAGCATTTACACCTTTGGTGAAGTTGGAACGACTTTATCTGTCCAAGAATCAGCTGAAGGAATTGCCAGAAAAAATGCCCAAAACTCTTCAGGAGCTGCGTGCCCATGAGAATGAGATCACCAAAGTGCGAAAAGTTACTTTCAATGGACTGAACCAGATGATTGTCATAGAACTGGGCACCAATCCGCTGAAGAGCTCAGGAATTGAAAATGGGGCTTTCCAGGGAATGAAGAAGCTCTCCTACATCCGCATTGCTGATACCAATATCACCAGCATTCCTCAAGGTCTTCCTCCTTCCCTTACGGAATTACATCTTGATGGCAACAAAATCAGCAGAGTTGATGCAGCTAGCCTGAAAGGACTGAATAATTTGGCTAAGTTGGGATTGAGTTTCAACAGCATCTCTGCTGTTGACAATGGCTCTCTGGCCAACACGCCTCATCTGAGGGAGCTTCACTTGGACAACAACAAGCTTACCAGAGTACCTGGTGGGCTGGCAGAGCATAAGTACATCCAGGTTGTCTACCTTCATAACAACAATATCTCTGTAGTTGGATCAAGTGACTTCTGCCCACCTGGACACAACACCAAAAAGGCTTCTTATTCGGGTGTGAGTCTTTTCAGCAACCCGGTCCAGTACTGGGAGATACAGCCATCCACCTTCAGATGTGTCTACGTGCGCTCTGCCATTCAACTCGGAAACTATAAG3’。2、根據權利要求l所述的一種能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白，其特征在于所述能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白氨基酸序列為AspGluAlaSerGlyHeGlyProGluValProAspAspArgAspPheGluProSerLeuGlyProValCysProPheArgCysGinCysHisLeuArgValValGinCysSerAspLeuGlyLeuAspLysValProLysAspLeuProProAspThrThrLeuLeuAspLeuGinAsnAsnLyslieThrGlulieLysAspGlyAspPheLysAsnLeuLysAsnLeuHisAlaLeuHeLeuValAsnAsnLyslieSerLysValSerProGlyAlaPheThrProLeuValLysLeuGluArgLeuTyrLeuSerLysAsnGinLeuLysGluLeuProGluLysMetProLysThrLeuGinGluLeuArgAlaHisGluAsnGlulieThrLysValArgLysValThrPheAsnGlyLeuAsnGinMetlieVallieGluLeuGlyThrAsnProLeuLysSerSerGlylieGluAsnGlyAlaPheGinGlyMetLysLysLeuSerTyrlieArglieAlaAspThrAsnlieThrSerlieProGinGlyLeuProProSerLeuThrGluLeuHisLeuAspGlyAsnLysHeSerArgValAspAlaAlaSerLeuLysGlyLeuAsnAsnLeuAlaLysLeuGlyLeuSerPheAsnSerlieSerAlaValAspAsnGlySerLeuAlaAsnThrProHisLeuArgGluLeuHisLeuAspAsnAsnLysLeuThrArgValProGlyGlyLeuAlaGluHisLysTyrHeGinValValTyrLeuHisAsnAsnAsnlieSerValValGlySerSerAspPheCysProProGlyHisAsnThrLysLysAlaSerTyrSerGlyValSerLeuPheSerAsnProValGinTyrTrpGluHeGinProSerThrPheArgCysValTyrValArgSerAlalieGinLeuGlyAsnTyrLys。3、權利要求l所述的一種能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白的制備方法，包括如下步驟(1)根據Genebank數據庫提供的人Decorin的cDNA序列設計RT-PCR引物Decorin-F和Decorin-R，擴增Decorin成熟肽編碼序列；(2)從人骨髓細胞中提取總RNA，反轉錄成單鏈cDNA;(3)利用引物Decorin-F和Decorin-R以反轉錄合成的單鏈cDNA為模板PCR擴增Decorin，得到Decorin的PCR產物；所述PCR熱循環程序條件94°C5min;94°C10S，56.0。C10S，72°C5S，30個循環；72°C，5min;(4)將步驟(3)獲得的Decorin的PCR產物經膠回收后，與PET30a(+)質粒載體用5"附///+￡(707/進行雙酶切pET-30a(+)質粒載體的酶切產物與PCR產物的酶切產物進行連接，將Decorin的PCR產物直接插入pET-30a(+)質粒載體，構建得到Decorin/pET-30a(+)，酶切初步鑒定后進行測序確認；(5)經確證的Decorin/pET-30a(+)轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)細胞中，用異丙基-p-D-硫代半乳糖苷進行誘導表達，收獲并裂解菌體，上清液通過鎳固相親和層析樹脂進行純化，最后用腸激酶切掉His-Tag,過反相高效液相色譜，得到純化的能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白Decorin;所述引物Decorin-F:5，cgggatcccatcatcaccatcaccatgacgacgacgacaaggatgaggcttctgggataggcc3，；其5，-端具有Bamffl酶切位點和EK識別位點一(Asp)4Lys的編碼序列；所述引物Decorin-R:5'ggaattcttacttatagtttccgagtt';所述引物含有酶切位點EcoRI和終止密碼子。4、權利要求l所述的一種能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白在制備抑制人乳腺癌細胞或組織的生長和轉移藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種能抑制腫瘤細胞生長和轉移的飾膠蛋白即Decorin及其制備方法和在抑制人乳腺癌細胞或組織的生長和轉移中的應用。本發明用特異性引物以人骨髓cDNA為模板克隆Decorin飾膠蛋白成熟肽編碼序列，并將其直接插入克隆表達載體pET-30a(+)，構建成Decorin/pET-30a(+)重組體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選陽性克隆，經IPTG誘導表達，純化、復性、酶切、高效液相色譜分離制備Decorin蛋白。本發明飾膠蛋白具有抑制野SDF-1α對乳腺癌細胞的趨化遷移、抑制乳腺癌細胞的生長的活性，可應用于制備抑制人乳腺癌細胞或組織的生長和轉移的藥物。文檔編號A61P35/04GK101333252SQ200810030040公開日2008年12月31日申請日期2008年8月6日優先權日2008年8月6日發明者翼張,李校堃,健肖,露蔡,毅譚,馬偉鋒申請人:溫州醫學院