專利名稱：：一種CXCR4拮抗劑重組蛋白SDF-1βP2G及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，特別涉及一種能拮抗趨化因子受體CXCR4、促進缺血后血流恢復和血管再生的重組蛋白SDF-1卩P2G的制備和應用。
背景技術：
：促進血管發生和新血管生成是挽救嚴重缺血組織或器官功能衰竭的有效治療策略(UrbichandDimmeler,CircRes,2004,95:343-353)。利用促血管生成因子如VEGF(Schratzbergeretal.，NatMed，2000，6:405-413),FGF-2(Caoetal.,NatMed,2003，9:604-613;KhuranaandSimons,TrendsCardiovascMed,2003，13:116-122)和SDF隱l(Jinetal.,NatMed，2006，12:557-567)治療下肢嚴重缺血患者獲得了短期療效，但其長期療效仍未得到臨床證實(Jinetal.,NatMed,2006，12:557-567)。組織損傷常伴隨著血管再生微環境的破壞，使得損傷部位周圍或外源性的成血管祖細胞(Progenitorcells)難以順利進入損傷部位促進血管發生和新血管形成。越來越多的證據表明，骨髓中的成血管祖細胞能被動員并趨化至缺血部位啟動血管新生過程，從而及時快速的促進血管發生和新血管形成(RafiiandLyden,NatMed,2003,9:702-712)。自體骨髓來源的細胞能夠遷移至缺血部位并分化成內皮細胞、促進新血管形成，通過動員以增加外周血中可直接遷移至缺血部位的成血管細胞的數量是一種很有前景的治療策略(Broxmeyer，CurrOpinHematol,2008,15:49-58;Petitetal.，TrendsImmunol,2007，28:299-307;Shireman，JVaseSurg,2007,45SupplA:48-56)。近年，SDF-1(Stromalcellderivedfactor-1)的成血管細胞動員和血管生成效應受到廣泛的關注(Broxmeyer,CurrOpinHematol,2008，15:49-58;Petitetal.,TrendsImmunol,2007,28:299-307)。全身或局部注射SDF-1均能動員EPCs、趨化EPCs至缺血部位，顯著促進血流恢復和血管生成(Carretal.，CardiovascRes，2006,69:925-935;Hiasaetal.，Circulation,2004,109:2454-2461;Tanetal.,CardiovascRes,2007,73:823-832)。然而，由于SDF-1/CXCR4軸具有復雜、重要的生理功能，很難直接在臨床上利用SDF-1動員成血管細胞促進缺血性血管再生，比如SDF-1不但能動員和趨化正常的干細胞，而且也能趨化CXCR4+的腫瘤細胞和腫瘤干細胞，促進腫瘤血管的形成和腫瘤轉移(Kryczeketal"AmJPhysiolCellPhysiol，2007，292:987-995;Wangetal.，CancerMetastasisRev,2006,25:573-587)。最近研究發現，利用特異性拮抗劑拮抗CXCR4能有效動員造血干細胞從骨髓進入外周血而不會激活CXCR4介導的下游信號通路(Broxmeyeretal.,JExpMed,2005,201:1307-1318;Lilesetal.，Blood，2003,102:2728-2730)，這為利用CXCR4特異性拮抗劑動員成血管細胞治療局部缺血等外周血管疾病成為可能。通過單劑量注射CXCR4的拮抗劑AMD3100(Broxmeyeretal.，JExpMed,2005,201:1307-1318;Lilesetal.,Blood,2003,102:2728-2730)或T-140(Abrahametal.,StemCells,2007,25:2158-2166)急性阻斷SDF-l和CXCR4間的相互作用能顯著促進造血干細胞的瞬時外周動員。在正常小鼠下肢缺血模型中(Capocciaetal.,Blood，2006,108:2438-2445)和糖尿病(Jiaoetal.,DiabetoIogia,2006,49:2786-2789)，短期少量(2-3劑量)注射AMD3100能顯著促進急性缺血期(缺血后7天內)血流恢復和新生血管形成。我們的研究結果(圖3&4)也證實了AMD3100能夠促進正常小鼠下肢急性缺血期(缺血后7天內)血流恢復和血管再生。但是，長期注射AMD3100并不能持續促進血流恢復(每天1次、注射14天)；文獻報道中每天2次、注射21天(Jinetal.,NatMed,2006,12:557-567)。這種長期給藥的副效應可能應歸因于AMD3100對成血管細胞(Yinetal.，JCardiovascPharmacol,2007,50:61-67)和其他器官的毒性作用(Hendrixetal.,JAcquirImmuneDeficSyndr，2004，37:1253-1262;Rusconietal.，CurrTopMedChem,2007，7:1273-1289)。正是由于長期、多次用藥的毒性作用，AMD3100作為抗HIV-1感染的特效藥物的臨床試驗已經于數年前終止(Hendrixetal.,JAcquirImmuneDeficSyndr,2004,37:1253-1262;Rusconietal"CurrTopMedChem,2007,7:1273-1289)。因此，開發高效、低毒的CXCR4特異性拮抗劑迫在眉睫。
發明內容為了解決上述現有技術中存在的不足，本發明的首要目的在于提供一種CXCR4拮抗劑重組蛋白SDF-1(3P2G的cDNA和由此推斷的氨基酸序列。本發明的另一目的在于提供上述SDF-1PP2G的cDNA的表達載體。本發明的第三個目的在于提供利用上述表達載體制備重組蛋白SDF-1PP2G的方法。本發明的第四個目的在于提供上述SDF-1PP2G6重組蛋白在制備治療缺血性疾病、恢復缺血器官的功能、促進造血重建、抑制惡性腫瘤的生長和轉移或抑制風濕性關節炎等疾病的藥物中的應用。本發明通過如下技術方案來實現以人SDF-ip基因為模板，利用定點突變和基因重組技術研制一種CXCR4的特異性拮抗劑重組蛋白SDF-1PP2G。SDF-1卩P2GcDNA的核苷酸序歹U為5，aagggcgtcagcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgcc3gagccaacgtcasgcatctcaaaattctcaacsctcc犯3ctgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacasc3gac犯gtgtgcattgacccgaagct3肌gtggattcaggagtacctggag肌agctttaaacaagaggttc旭gatg3，0由此推斷的氨基酸序列為LysGlyValSerLeuSerTyrArgCysProCysArgPhePheGluSerHisValAlaArgAlaAsnValLysHisLeuLyslieLeuAsnThrProAsnCysAlaLeuGinlieValAlaArgLeuLysAsnAsnAsnArgGinValCyslieAspProLysLeuLysTrplieGinGluTyrLeuGluLysAlaLeuAsnLysArgPheLysMet。本發明用特異性引物以SDF-l(3cDNA為模板經PCR擴增獲得直接擴增SDF-ipN末端第二位氨基酸殘基由脯氨酸突變成甘氨酸的突變體SDF-1PP2G的cDNA，并將其連接入pET30a(+)載體，構建得到表達載體SDF-ipP2G/pET-30a(+);測序鑒定序列正確后轉化至BL21(DE3)表達菌株，利用IPTG進行誘導表達，經分離包涵體、復性、純化、酶切標簽蛋白和高效液相色譜分離等常規分子生物學技術處理后，得到SDF-1PP2G重組蛋白。然后利用MOLT-4細胞株鑒定SDF-1PP2G拮抗CXCR4的活性，利用小鼠下肢缺血模型考察SDF-ipP2G拮抗CXCR4、動員成血管前體細胞、促進缺血下肢血管再生和血流恢復的治療效應。本發明的重組蛋白完全可以應用于制備治療缺血性疾病、恢復缺血器官的功能、促進造血重建、抑制惡性腫瘤的生長和轉移或抑制風濕性關節炎等疾病的藥物。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果SDF-lpP2G的cDNA以CXCR4的天然配體SDF-ip為模板進行PCR擴增得到，具有易于合成、生物利用度高、不激活受體信號通路和低免疫源性等優勢；同時長期用藥未觀察到SDF-1PP2G重組蛋白對心臟、肝臟、腎臟和睪丸等臟器的急性和慢性毒性效應(包括形態學改變、細胞凋亡、特異性細胞增殖等)；SDF-1(3P2G對于動員成血管細胞、促進缺血性血管再生具有重要的臨床意義，開發CXCR4特異性肽類拮抗劑用于此目的是一種較理想的選擇。圖l是重組質粒SDF-ipP2G/pET-30a(+)的酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。其中M為蛋白質分子量標準；l為Kpnl酶切后的質粒；2為SacI酶切后的質粒；3為Kpnl和Sacl雙酶切后的質粒。圖2是SDF-l卩P2G/pET-30a(+)的測序結果。圖3是大腸桿菌表達SDF-lpP2G重組蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。其中M為蛋白質分子量標準；1、2、3、4代表不同的克隆的細胞裂解液。圖4是變性條件下利用ProBondTMResin親和層析SDF-ipP2G/His-tag圖譜；其中I為上樣峰；II為過柱峰；III為洗脫峰。圖5是SDF-ipP2G/His-tag利用ProBondTMResin親和層析的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。其中l為SDF-l卩P2G/His-taglBs溶液；2為SDF-l卩P2G/His-taglBs過ProBondResin柱后的溶液；3為洗滌ProBoncFMResin柱后的變性結合緩沖液(DenaturingBindingBuffer);4為洗滌ProBondTMResin柱后的變性洗滌緩沖液(DenaturingBindingBuffer);5為洗滌ProBondTMResin柱后的變性洗滌緩沖液含80mM咪唑(DenaturingBindingBuffer)。圖6顯示了EKMaxTM在不同的酶切時間下對SDF-1pP2G/His-tag切割效果其中M為蛋白質分子量標準；l-10依次表示超濾濃縮后SDF-ll3P2G/His-tag蛋白在的酶切時間分別為0.5hr、l.Ohr、2.0hr、3.0hr、4.0hr、5.0hr、6.0hr、8.0hr、10.0hr和12.0hr后的產物;11.為SDF-ipP2G/His-tag未經EKMaxTM酶切放置2.0hr后的產物；12.為SDF-lpP2G/His-tag未經EKMaxTM酶切放置12.0hr后的產物。圖7是RP-HPLC分離SDF-ipP2G和His-tag的層析圖譜；其中I是His-tag;II是SDF-lj3P2G。圖8是SDF-lpP2G和SDF-1卩對MOLT-4細胞的趨化活性比較。圖9顯示了SDF-1(3P2G預處理對SDF-lp對MOLT-4細胞的趨化活性的抑制效應。圖10顯示了SDF-ipP2G喪失對MOLT-4細胞Ca"內流的誘導效應。圖11顯示了SDF-1(3P2G誘導MOLT-4細胞表明CXCR4內在化。圖12顯示了SDF-1卩P2G動員成血管前體細胞(單核細胞、中性粒細胞和巨噬細)從骨髓進入外周血。其中A是根據流式細胞儀FSC和SSC區分成熟巨噬細胞(Rl)，中性粒細胞(R2)和單核細胞(R3)的代表圖；B是單核細胞動員效應的統計結果；C是中性粒細胞動員效應的統計結果；D是成熟巨噬細胞動員效應的統計結果。圖13顯示了SDF-1)3P2G能顯著促進小鼠缺血下肢的血流恢復。其中A是激光多普勒血流掃描結果;B是缺血下肢血流恢復統計結果。圖14.顯示了SDF-1(3P2G能顯著促進小鼠缺血下肢毛細血管增生。其中A是缺血下肢腓腸肌冰凍切片CD31免疫組化染色結果；B和C分別是缺血后第7天和第14天缺血下肢腓腸肌毛細血管增生的統計結果。具體實施方式下面結合實施例，對本發明作進一步詳細說明。實施例1SDF-1卩P2GcDNA的克隆及其原核表達系統的構建1.引物設計根據Genebank數據庫提供的人SDF-ip的cDNA序列按照一般引物設計原則和PET30a(+)克隆的要求，采用primer5.0以編碼區為模板設計RT-PCR引物SDF-l(3P2G-F/SDF-lpP2G-R，直接擴增SDF-lpN末端第二位氨基酸殘基由脯氨酸突變成甘氨酸的突變體SDF-1(3P2G。弓I物SDF-1卩P2G-F為5，-ggGGTACCgacgacgacgacaagaagggcgtcagcctgagctacagat-3，；引物SDF-1卩-R為5，-acgGAGCTCacatcttgaacctcttgtt-3，。2.總RNA的提取自液氮中取出骨髓樣品約0.25ml，立即加入0.75mlTRIZOLLSReagent,待樣品解凍后，用吸管反復吹打裂解骨髓細胞。裂解的細胞勻漿在15~30°C條件下保溫5min以便核蛋白復合體的解離。然后加入0.2ml氯仿，用力振蕩15s并在15~30°C條件下保溫2~15min。12,000xg、2~8°C離心15min。離心后的樣品分為三層，RNA即存在于上層無色清液中(總體積約為TRIZOLLSReagent的70%)。取上層清液于新的EP管中，加入0.5ml異丙醇混勻，1530。C保溫10min，12，000xg，2~8°C離心10min。去上清，用lml70%的乙醇渦旋洗滌沉淀，7,500xg，2~8°C離心5min。去上清，室溫揮發殘余乙醇5-10min，然后將沉淀溶解于20ulDEPC處理的水中，檢測A260/A280比值，保存于-70。C備用。(RNA提取過程中的所有器皿、溶液和水均經DEPC處理)。3.反轉錄合成單鏈cDNA:單鏈cDNA的合成按SuperScriptTMFirstStrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogenlifetechnologies,Cat.No.11904-018)所提供的方法采用oligo(dT)primer進行，概述如下a.按如下順序加入各組份到已編號的0.2ml的PCR薄壁管中混勻，65°C保溫5min，然后置于冰上至少1min。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>b.按如下順序準備反應混合液。Components1OXRTbuffer25mMMgC120.1MDTTRNaseOUTRecombinantRNaseInhibitorC.向a步中的每管加入一份9pl的反應混合液，輕輕混勻，低速離心收集。d.42°C保溫2min。e.除NoRTControl夕卜，每管加入1^1(50units)SuperscriptII，混勻，42°C保溫50min。f.70。C保溫15min終止反應，置于冰上冷卻。g.每管加入1^1RNaseH，37°C保溫20min，然后保存于一20。C備用。4.SDF-1(3P2GcDNA的PCR擴增利用引物SDF-1PP2G-F/SDF-1卩P2G-R以反轉錄合成的cDNA為模板PCR擴增SDF-lpP2G。PCR熱循環程序94°C5min;94°C10S，51.5°C10S，72°C5S，30個循環；72°C，5min。5.SDF-l(3P2G/PET30a(+)的構建SDF-1PP2GcDNA的PCR產物經膠回收后，與預先制備PET30a(+)質粒載體按照下表進行雙酶切<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>酶切產物全部上樣到lxTAE配制的1.5%瓊脂糖凝膠(含EBlpg/ml)上進行電泳。紫外透射反射分析儀檢測條帶分離開后，凝膠成像系統照相。根據DNAMarker判斷目標條帶所在的位置，分別用手術刀片準確切下目標帶所在的凝膠塊，轉入干凈的1.5mleppendorf管中。用E.Z.N.A.GelExtractionKit回收目標片段，回收過程按試劑盒說明書進行。pET-30a(+)的酶切產物最后用20^1滅菌ddH20洗脫，濃度約為0.05pmoll;PCR產物的酶切產物最后用40^1滅菌ddH20洗脫，濃度約為0.2-0.6pmol/nl。質粒載體和PCR產物的雙酶切回收產物的連接按下面的反應體系進行1(^1連接反應體系如下16。C連接反應0.5h以上。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述連接體系采用熱休克方法直接轉化至感受態JM109菌株。陽性克隆的篩選PCR法作初步鑒定挑取單個菌落，接種于盛有500plLB(含有50pg/mlKanamycin)液體培養基的1.5mlEP管中，37°C，250r/min振蕩培養4h，以此菌液為模板，PCR法確認pET-30a(+)載體中插入片段的大小。PCR體系同前，只是PCR模板為各自的陽性菌落培養液，PCR循環中的退火溫度比進行PCR基因擴增時相應降低1-2°C。1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，有PCR產物且產物DNA片段與用于克隆連接的外源DNA片段大小相同的初步確定為陽性克隆。質粒提取及酶切鑒定從PCR篩選出的陽性克隆中挑取一個單菌落接種5mLLB液體培養基(50pg/mlKanamycin)，37°C，過夜培養(約12-14h)。次日，lOOOOg，lmin離心，收集細胞。按E.Z.N.A.PIasmidMiniprepKitI說明書提取質粒，質粒經Kpnl/Sacl單雙酶切，再次驗證是否有外源片段插入。經PCR和酶切篩選的重組質粒進一步測序鑒定。酶切鑒定結果表明，SDF-lpP2G基因已經成功插入PET30a(+)載體(圖1)，測序結果表明，SDF-1(3P2G克隆成功，序列完全正確(圖2)。實施例2重組蛋白SDF-1(3P2G的原核表達和純化經確證的SDF-lpP2G/pET-30a(+)重組質粒約200ng加入200nl感受態大腸桿菌BL21(DE3)(NOVAGEN)細胞中(氯化鈣法制備)，輕輕混勻，在冰上放置30min，然后在42。C熱休克90s，立即轉到冰上放置2min，隨后加入80(^1LB培養液在37。C條件下振蕩培養45min，取2001鋪到含50pg/ml卡那霉素的LB平板，37。C培養過夜(約12hr)，隨機挑取5個陽性菌落分別接種于50ml的LB液體培養基(含50pg/ml卡那霉素)37。C振蕩培養約12hr，然后分別取50nl上述培養液轉接于50ml的LB液體培養基(含50pg/ml卡那霉素)37。C振蕩培養約3hr，當OD600-0.5時，分別加入終濃度為0.75mM的IPTG37。C誘導表達3hr，3000xg離心15min收獲細胞。然后按ProBondTMresinForPurificationof6xHis-TaggedProteins(鎳固相親和層析樹脂)(Invitrogen，Catalognos.R801-01，R801-15)的操作說明進行純化，具體操作如下1)Guanidinium(鹽酸胍)裂解緩沖液(6M鹽酸胍，20mMNaPO4，pH7.8500mMNaCl)至37。C。2)重懸菌體于8ml鹽酸胍裂解緩沖液中。3)在冰上超聲處理細胞裂解液5s，間隔5s，重復4次。4)在60。C條件下緩慢振蕩30min以保證菌體全部裂解。5)3,000xg離心15min，將上清轉入干凈的試管中，取5iul裂解液上清用作SDS-PAGE檢測樣品。6)力口2mlProBond頂resin(樹脂)至廿8ml上清液中。7)室溫下輕微振蕩結合30min，800xg離心15min，去除上清液。8)用4mlDenaturing(變性)結合緩沖液(8M尿素(Urea)，20mMNaPO4，pH7.8，500mMNaCD重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min,800xg離心15min，小心去除上清液，并取50pl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復一次。9)用4ml變性洗滌緩沖液(8MUrea，20mMNaPO4,pH6.0，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800xg離心15min,小心去除上清液，并取50iil上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復一次。10)用8ml非變性洗滌緩沖液(20mMimidazole(咪唑)，20mMNaPO4，pH8.0，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800xg離心15min，小心去除上清液，并取50pl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復三次。11)用8ml溶出緩沖液(500mM咪唑，20mMNaPO4，pH8.0，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌15min，800xg離心15min，小心吸取上清于干凈的試管中，并取50pl上清用作SDS-PAGE檢測樣品，其余保存于一80。C。SDS-PAGE檢測結果表明，SDF-lpP2G/pET-30a(+)重組體能夠在大腸桿菌BL21(DE3)中正常表達(圖3)，Ni親和純化出約14KD的目標蛋白帶，與理論分子量一致，純度至少在80%以上(圖4和圖5)。12)在4。C用復性緩沖液A(3M尿素，20mMTris-HCl(pH7.5),lmMEDTA，lmM2-巰基乙醇(2-Mecaptoethanol),135mMNaCl)透析上述樣品1624hr。用復性緩沖液B(1.5M尿素，20mMTris-HCl(pH7.5)，lmMEDTA，lmM2-巰基乙醇，135mMNaCl)繼續透析上述樣品1624hr。用復性緩沖液C(20mMTris-HCl(pH7.5)，lmMEDTA，135mMNaCl，O.lmMGSH(還原型谷胱甘肽)，O.OlmMGSSG(氧化型谷胱甘肽))繼續透析上述樣品1624hr。用復性緩沖液D(20mMTris-HCl(pH7.5),135mMNaCl)繼續透析上述樣品1624hr。13)超濾濃縮后按說明書提供的條件用腸激酶EnterokinaseMaxTM(EKMax)(Invitrogen,Catalognos.El80-01,El80-02)切除His-Tag，結果見圖6。14)反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離SDF-IpP2G，His-Tag和腸激酶(Enterokinase),最后得純化的SDF-ipP2G，純度在95%以上，結果見圖7，儲存于-80。C備用。實施例3SDF-lpP2G拮抗CXCR4的活性1、趨化活性取24孔板，每孔加入預定終濃度(0,0.001，0.01,0.1,0.5,1,10,100nmol/L等濃度梯度)的SDF-ip、SDF-1PP2G的RPMI1640稀釋液，然后輕輕的用鑷子放上底部帶有5pm孔徑濾膜的趨化小室(Chemotaxicchamberwithporesizeof5pm)，注意避免產生氣泡，隨即在趨化小室中加入lxl07Cdls/ml的MOLT-4細胞懸液200pL;5%C02孵箱中、37。C孵育2—3hr，然后輕輕的一次性取出趨化小室，在顯微鏡下計數細胞培養板每孔中的細胞數。相對趨化活性(RelativeChemotaxicActivity):跨膜細胞數/上載細胞總數x100。/。。每處理重復三次，數據用DPSv5.02處理，結果以Mean士S表示，DUNCAN新復極差法多重比較。結果表明，SDF-1(3P2G對MOLT-4細胞的趨化活性幾乎完全喪失(圖8)。2、SDF-ipP2G對SDF-lp趨化活性的抑制效應按規定的SDF-1pP2G的終濃度梯度、在5%C02孵箱中、37°C預處理MOLT-4細胞2-3hr;然后按上述趨化活性的測定方法檢測10nmol/L的SDF-ip對預處理MOLT-4細胞的趨化效應。結果及統計方法同趨化活性實驗。實驗結果表明，SDF-1卩P2G預處理MOLT-4細胞能顯著抑制SDF-lp對MOLT-4細胞的趨化活性(圖9)3、鈣內流CXCR4屬G蛋白耦聯受體家族成員，SDF-l結合并激活CXCR4，通過其耦聯的G蛋白異源三聚體啟動下游信號通路，引起胞內C^+濃度的瞬時升高。MOLT4特異性高表達CXCR4,SDF-l及其突變體誘導MOLT4細胞后，通過檢測MOLT4胞內Ca^濃度的變化評價它們對CXCR4的激活效應。方法概述如下a、Fluo-3/AM儲存液的配制根據產品說明書進行；b、向lxl07cells/ml的MOLT4細胞的RPMI1640(含10%FBS)懸液中加入適量的Fluo-3/AM儲存液，使其終濃度為4pmol/L，混勻并在暗處室溫下保溫45min;然后用Hank's(含20mmol/LHepes，0.2%BSA,不含酚紅)液洗滌細胞二次，然后用上述Hank's液重懸細胞，使其終濃度為lxl06cells/ml，保存于暗處備用；C、將流式細胞儀Coulter圖的橫軸設為時間(Time),縱軸設為熒光強度(FL1)，取400pl細胞懸液于流式專用管中，上機檢測基線水平40sec，然后取下流式專用管，立即加入預定濃度的誘導劑混勻上機，持續檢測熒光強度的變化48min。數據用CdlQuestsoftware(BectonDickinson)處理。結果表述Fluo-3在與(^2+結合之前不會發出強熒光，當與Ca^結合后熒光強度增加40倍以上，并且熒光強度的變化與Ca^濃度成正比，因此可以利用誘導后MOLT4熒光強度的變化間接的描述胞內(^2+濃度的變化。實驗結果表明，SDF-1PP2G完全喪失對MOLT-4細胞Ca^內流的誘導效應(圖10)。4、細胞表面CXCR4的內在化先用拮抗劑與MOLT4細胞表面的CXCR4結合，然后用CXCR4的單克隆抗體檢測MOLT4細胞表面CXCR4的表達情況。方法概述如下a、取MOLT4細胞懸液(2.5xl06cells/ml)400W—份，各加入SDF-1卩或其突變體蛋白至預定濃度混勻，在5%C02孵箱中、37。C孵育MOLT4細胞2—3hr;b、用PBS洗滌細胞2次，將細胞懸于5(^1的PBS中，均分成兩份，其中一份加入5(Hig/ml的小鼠抗人CXCR4單克隆抗體12G51(^1，混勻后在冰上孵育30min，另一份不加單抗；C、用PBS洗滌細胞3次，重懸細胞于25^d的PBS中，兩份分別同時加入50嗎/ml的羊抗小鼠IgG-FITC10^1，混勻后在冰上孵育30min;d、用PBS洗滌細胞2次，重懸細胞于300pl的PBS中，以其中未加CXCR4單克隆抗體12G5者為對照檢測MOLT4細胞表面的熒光強度。結果表述以SDF-ip及其突變體蛋白SDF-ipP2G不同濃度處理后MOLT4細胞表面熒光強度的高低反應SDF-1P及SDF-1(3P2G促使CXCR4內在化的能力。實驗結果表明，SDF-lpP2G與SDF-1(3—樣，具有正常的CXCR4結合能力，并誘導CXCR4內在化(圖11)。實施例4SDF-1PP2G對成血管前體細胞的動員效應FVB小鼠(雄性、8周齡)進行隨機分組，分析尾靜脈注射1小時后，SDF-ipP2G動員成血管細胞的效應。SDF-1PP2G和AMD3100用PBS溶解稀釋，SDF-1(3P2G按5mg/kg的劑量靜脈注射給藥，以AMD3100(5mg/kg，皮下)和PBS分別作為陽性和陰性對照；1小時后處死小鼠，用肝素化抗凝管(BD)收集外周血，BDFACSlysingsolution裂解紅細胞，血細胞計數器分析白細胞的數量，流式細胞儀分析單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞數量。實驗結果表明，SDF-1PP2G能顯著動員單核細胞、中性粒細胞和巨噬細胞從骨髓進入外周血(圖12)。實施例5SDF-ipP2G促小鼠下肢缺血后血管再生和血流恢復的治療效應FVB小鼠(雄性、8周齡)，利用Ketamine(100mg/kg)和Xylazine(10mg/kg)充分麻醉小鼠后，備皮、剪開腹股溝皮膚，用6-0線結扎股淺動脈和靜脈(從深股動脈下到胭動脈和靜脈)，然后剪斷并分離，保持伴行神經不受損傷，然后用4-0線縫合皮膚，即建成小鼠下肢缺血模型。將下肢缺血FVB小鼠隨機分組，在手術前1天及手術后每天1次靜脈注射SDF-lpP2G(5mg/kg)，仍以AMD31005mg/Kg(皮下)和PBS分別作為陽性和陰性對照，在手術后第0(手術當天)、1、3、5、7、14天利用LDPI監測小鼠下肢血流恢復情況，在第14天處死小鼠，分離缺血和非缺血下肢小腿腓腸肌，用OCT包埋備冰凍切片，新生毛細血管密度將采用抗CD31抗體免疫組化檢測。激光多普勒血流成像分析(LDPI):小鼠經Ketamine(100mg/kg)和Xylazine(10mg/kg)充分麻醉后，腹部朝上固定在軟木板上，后肢脫毛后用激光多普勒分析儀(PeriscanPMIILaserDopplerPerfusionImager,PerimedAB,Sweden)檢測下肢血流，然后用LDPIwin2.5軟件進行定量分析，為了減小個體差異，LDPI血流數據表示為缺血(左)/正常(右)的比值。實驗結果表明，SDF-1PP2G能顯著促進缺血小鼠下肢血流快速恢復(圖13)。毛細血管密度利用缺血下肢腓腸肌冰凍切片(5|nm)和抗CD31單克隆抗體(RatAnti-MouseCD31antibody,BD)進行免疫組化染色，并用蘇木精對染，然后在高倍光鏡下觀察，每實驗組取7-10張切片，每張切片取10-15個高倍視野(400x)計數CD31陽性細胞數(毛細血管)和肌纖維數量，毛細血管密度表示為每根肌纖維上的CD31陽性細胞數量。實驗結果表明，SDF-1(3P2G顯著促進了缺血下肢腓腸肌毛細血管的增生(圖14)。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING〈110〉溫州醫學院〈120〉一種CXCR4拮抗劑重組蛋白SDF-leP2G及其制備方法和應用〈130〉1〈160〉4〈170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉216〈212〉廳〈213〉Homosapiens〈220〉〈221〉CDS〈222〉(1)(216)〈223〉SDF-leP2G重組蛋白的核苷酸編碼序列〈400〉1aagggcgtcagectgageLysGlyValSerLeuSer15catgttgccagagccaacHisValAlaArgAlaAsn20aactgtgcccttcagattAsnCysAlaLeuGinlie35gtgtgcattgacccgaagValCyslieAspProLys50getttaaacaagaggttcAlaLeuAsnLysArgPhe6570tacagatgcccatgccgaTyrArgCysProCysArg10gtcaagcatetcaaaattValLysHisLeuLyslie25gtagcceggctgaagaacValAlaArgLeuLysAsn40etaaagtggattcaggagLeuLysTrplieGinGlu5560aagatgLysMetttcttcgaaage48PhePheGluSer15etcaacactcca96LeuAsnThrPro30aacaacagsc犯144AsnAsnArgGin45tacctggagaaa192TyrLeuGluLys216<210>2〈211〉72<212>PRT〈213〉Homosapiens〈400〉2LysGlyValSer1HisValAlaArg20AsnCysAlaLeu35ValCyslieAsp50AlaLeuAsnLys65LeuSerTyrArgCysProCysArgPhePheGluSer51015AlaAsnValLysHisLeuLyslieLeuAsnThrPro2530GinlieValAlaArgLeuLysAsnAsnAsnArgGin4045ProLysLeuLysTrplieGinGluTyrLeuGluLys5560ArgPheLysMet70〈210〉3〈211〉48<212>腿〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223〉根據Genebank數據庫提供的人SDF-ie的cDNA序列設計的5'-末端引物，用以克隆SDF-1eP2G的cDNA〈400〉3ggggtaccgacgacgacgacaagaagggcgtcagcctgagctacagat48〈210〉4〈211〉28〈212〉DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223〉根據Genebank數據庫提供的人SDF-1P的cDNA序列設計的3'-末端引物，用以克隆SDF-1PP2G的cDNA〈400〉4acggagctcacatcttgaacctcttgtt28權利要求1、一種CXCR4拮抗劑重組蛋白SDF-1βP2G的cDNA，其特征在于它的核苷酸序列如下5’aagggcgtcagcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtcaagcatctcaaaattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaagtgtgcattgacccgaagctaaagtggattcaggagtacctggagaaagctttaaacaagaggttcaagatg3’。2、一種CXCR4拮抗劑重組蛋白SDF-1(3P2G，其特征在于SDF-1(3P2G的氨基酸序列如下LysGlyValSerLeuSerTyrArgCysProCysArgPhePheGluSerHisValAlaArgAlaAsnValLysHisLeuLyslieLeuAsnThrProAsnCysAlaLeuGinlieValAlaArgLeuLysAsnAsnAsnArgGinValCyslieAspProLysLeuLysTrplieGinGluTyrLeuGluLysAlaLeuAsnLysArgPheLysMet。3、一種表達載體，其特征在于包含權利要求l所述cDNA。4、表達載體SDF-l(3P2G/pET-30a(+)，其特征在于包含權利要求1所述cDNA。5、重組蛋白SDF-1PP2G的制備方法，其特征在于包括下列步驟將權利要求4所述的表達載體轉化大腸桿菌細胞，利用IPTG進行誘導表達，經分離包涵體、復性、純化、酶切標簽蛋白和高效液相色譜分離，得到重組蛋白SDF-1PP2G。6、重組蛋白SDF-1PP2G在制備治療缺血性疾病、恢復缺血器官的功能、促進造血重建、抑制惡性腫瘤的生長和轉移或抑制風濕性關節炎等疾病的藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種CXCR4拮抗劑重組蛋白SDF-1βP2G及其制備方法和應用。用特異性引物以人SDF-1βcDNA為模板，通過定點突變PCR擴增得到SDF-1βP2GcDNA，并將其直接插入克隆表達載體pET-30a(+)，構建成SDF-1βP2G/pET-30a(+)重組體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選陽性克隆，經IPTG誘導表達，純化、復性、酶切和高效液相色譜分離制備SDF-1βP2G重組蛋白。SDF-1βP2G重組蛋白能夠拮抗趨化因子受體CXCR4，促進干細胞、成血管細胞等從骨髓進入外周血，促進缺血器官血管再生和血流恢復。文檔編號A61P9/00GK101333531SQ200810030039公開日2008年12月31日申請日期2008年8月6日優先權日2008年8月6日發明者李校堃,露蔡,毅譚申請人:溫州醫學院