專利名稱：：預防和治療老年癡呆癥的藥物的制作方法
技術領域：
：本發明是關于巻柏總黃酮及穗花杉雙黃酮的醫藥新用途，具體的說是巻柏總黃酮及其單一成分穗花杉雙黃酮在預防和治療老年癡呆癥藥物中的應用，也涉及該藥物的提取分離和藥物制劑，本發明屬于醫藥
技術領域：
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背景技術：
：老年癡呆是一種中樞神經衰退性疾病。主姜表現在中老年期間有進行性記憶損傷以及智力喪失，記憶障礙、抽象思維障礙、語言能力失常、行為和方向障礙等癥狀。其發病機理不十分清楚，是一種非常復雜的神經和細胞衰老過程。因此老年癡呆癥的預防和治療目前仍是一個世界難題。目前對老年癡呆癥預防基本上是以病理特征為切入點，可分為抗P-淀粉樣蛋白沉積藥物，擬膽堿藥物，促乙酸膽堿釋放藥物，細胞生長因子促進劑，腦功能改善藥物等。已上市或正在進入臨床研究的藥物有乙酰卡尼汀、他可林、維那克林、水飛薊素、毒扁豆堿和知母皂苷等(中草藥2001年32巻8期附4-5)。已上市的藥品毒副作用都較大。因此研究開發毒副作用小，安全有效的抗老年癡呆藥物具有重要意義。巻柏屬植物巻柏資源豐富，我國約有50多種，民間稱為"九死還魂草、長生不老草、萬年青"等。全草入藥，歷代醫家認為其能破血散瘀，活血止血，主治腹痛、閉經、吐血、便血、尿血等。現代藥理及臨床研究表明，巻柏屬植物具有防癌治癌、抗炎、抗病毒、鎮痛、降血壓、降血糖、抗痛風和增強人體免疫功能等作用(國外醫學植物藥分冊，2002年報17巻3期97-99頁)，特別是含有豐富的雙黃酮類成分是該屬植物的一大特征。到目前為止還未發現有比巻柏屬植物含有雙黃酮更高的植物。本發明完成前未發現有關巻柏總黃酮及穗花杉雙黃酮用于預防和治療老年癡呆癥的報道。本發明具有廣泛的應用前旦豕。穗花杉雙黃酮(amentofeavone)的結構:
發明內容本發明的目的之一是提供巻柏總黃酮和穗花杉雙黃酮在治療和預防老年癡呆癥中的應用。具體的說是巻柏總黃酮和穗花杉雙黃酮用于制備防治老年癡呆藥物的新用途。經動物試驗，本發明的制劑具有顯著改善癡呆小鼠學習記憶功能，弁能明顯提高SOD的活性，降低MDA的含量，提高腦系數，最終提供防治老年癡呆癥安全有效的藥物制劑。本發明目的之二是提供了巻柏總黃酮及其穗花杉雙黃酮的提取分離方法，以往公開的提取分離巻柏總黃酮和單體穗花杉雙黃酮的方法多是以石油醚脫脂和除葉綠素等脂溶性雜質或僅限于實驗室的分離，不適合產業化生產。本發明采用了安全有效的活性炭在乙醇提取液中脫脂除葉綠素等雜質的方法，可操作性強，適合工業生產。乙醇提取液回收乙醇后，在大孔樹脂柱上分離之前，先調節PH值為弱酸性沉淀出巻柏雙黃酮，除去大量水溶性非雙黃酮類雜質。提高了大孔樹脂的分離能力和分離樣品的純度。將沉淀用乙醇溶解再拌入預處理好的大孔樹脂中，揮去乙醇，裝在大孔樹脂柱上端，再進行分離，也是本發明主要創新之一，解決了水不溶性樣品在大孔樹脂柱上難以分離的難題。本發明分離純化巻柏總黃酮和穗花杉雙黃酮的方法，成本低，易操作，獲得的樣品純度高，巻柏總黃酮中穗花杉雙黃酮含量高達35%45%，總黃酮含量在50%以上。利用C-18反相(常壓或中低壓)柱分離純化穗花杉雙黃酮單體成分也是一項新的技術。該方法分離的穗花杉雙黃酮純度高(含量98%)由于采用常壓或中低壓分離柱，可根據需要設計柱的規格，可大量制備高純度穗花杉雙黃酮，分離柱可反復清洗使用，易操作，在本發明申請前未見有用該方法分離純化穗花杉雙黃酮的報道。本發明的目的之三是提供巻柏總黃酮和穗花杉雙黃酮單體成分的藥物制劑。主要是口服制劑，主要選自片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸劑，口服制劑中的任何一種。本發明目的之四是提供藥物優選含有1%—99%的穗花杉雙黃酮或巻柏總黃酮和99%—1%的藥用賦形劑或其它可組方的藥物。本發明藥物中的其它配伍的藥物，指的是以有效劑量的巻柏總黃酮或穗花杉雙黃酮為一定的藥物原料，再配伍其它允許合用的中藥或化學藥巻柏總黃酮、穗花杉雙黃酮及其藥物制劑具有預防和治療老年癡呆疾病的作用，這些藥理作用，通過以下藥效學試驗例得到證實。1、巻柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對A1C13致小鼠記憶障礙的影響取小鼠90只，隨機分成9組，按表1分組。第1天至第7天，對照組每天皮下注射生理鹽水，其余各組小鼠皮下注射A1C1350mg/kg。用藥組分別灌胃連續給藥2周。進行避暗試驗，記錄3min內小鼠進入暗室的錯誤次數，24h后以錯誤次數及錯誤百分率測驗記憶成績。表l、巻柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對A1C13致小鼠記憶障礙的影響(n=10，X±S)組別動物數(只)劑量(mg/kg)錯誤次數(3min)錯誤發生率(％)正常對照100.2±0.310模型組102.3±0.8**80**總黃酮102200.4土0.7aa20a總黃酮101100.5土0.6aa30總黃酮10550.6土0.8aa40穗花杉雙黃酮101500.3土0.4aa20a穗花杉雙黃酮10750.5士0.6a^20a穗花杉雙黃酮1037.50.6士0.8aa30腦復康106000.4士0.4aa20a*與正常組比較，*P<0.05，"P〈0.01;a與模型組比較，/xP〈0.05，a厶P〈0.01說明穗花杉雙黃酮與巻柏總黃酮不同計量對A1C13致記憶障礙均有不同程度的對抗效果。減少小鼠的錯誤發生次數及錯誤發生率。2、巻柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對東莨菪堿致小鼠記憶障礙的影響取小鼠90只，隨機分成9組，按表2分組。第1天至第7天，對照組及模型組給蒸餾水，其余各組按表2給藥。每天一次，連續7天，末次給藥lh后，正常組給生理鹽水0.1ml/10g，其余各組給氫溴酸東莨菪堿3mg/kg，10min后進行跳臺實驗，訓練3min，24h后進行測試成績。結果見表2。表2巻柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對東莨菪堿致小鼠記憶障礙的影響(11=10，X±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01;^與模型組比較，aP〈0.05，aaP〈0.01氫溴酸東莨菪堿組小鼠錯誤次數較正常組顯著增加，用藥組明顯減少了小鼠的錯誤次數，對氫溴酸東莨菪堿組所致的小鼠記憶障礙有明顯的對抗作用。明顯減少小鼠的錯誤發生次數及錯誤發生率。3、穗花杉雙黃酮及巻柏總黃酮對30%乙醇致小鼠記憶障礙的影響取小鼠90只，隨機分成9組，按表3分組。第1天至第7天，對照組及模型組給蒸餾水，其余各組按表3給藥。每天一次，連續7天，末次給藥lh后，正常組給生理鹽水0.1ml/10g，其余各組給30%乙醇，15min后進行跳臺實驗，測試記錄5min內每之小鼠的錯誤次數。結果見表3。表3巻柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對30%乙醇致小鼠記憶障礙的影響(11=10，X±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*與正常組比較，*P〈0.05，**P<0.01;。與模型組比較，aIXO.05，aaP〈0.0130%乙醇組小鼠錯誤次數較正常組顯著增加，用藥組除小劑量總黃酮外，其余各組對30%乙醇所致的小鼠記憶障礙有明顯的對抗作用。4、巻柏總黃酮及穗花杉雙黃酮對老年癡呆模型小鼠腦線粒體超氧化物歧化酶SOD活性、丙二醛(MDA)含量及腦系數的影響。取小鼠90只，隨機分為正常對照組和模型組。模型組給A1C13溶液，開始70天按400mg/kg/d灌胃，以后一直用2000mg/LAlCh溶液飲用；正常對照組灌胃等量的蒸餾水。將模型組隨機分為8組，按表4所示，灌胃給藥60天，正常對照組癡呆模型組灌以量的蒸餾水。整個實驗過程避免與鋁制品接觸。處死小鼠，于冰浴中迅速取出腦組織，并精確稱取，分別測定SOD、MDA和計算腦系數。表4對老年癡呆模型小鼠腦S0D活性、MDA含量及腦系數的影響(『10，X±S)組別動物數(只)劑景(mgZkg)SODMDA腦系數正常對照10240.0±48,412.6±2,80.332±0.046模型組10178.9±44.6*21.2±3.8*0.272±0.025*總黃酮10220245.4土50.4a12.2士3.2a0.348士0.062a總黃酮10110229.4士38.8a.13.6土2.9a0.328士0.054a總黃酮1055195.8±40.718.2±3.90.287±0.045穗花杉雙黃酮10150252.5土53.5a]0.0士3.0aa0.374士0.085a穗花杉雙黃酮1075265.6士48.2a13.4土3.3a0.343士0.068a穗花杉雙黃酮]037.5224.1土44.6a16.1士3.1a0.2卯±0.052腦復康10600243.4士53.2a9.2土3.6aa0.364士0.072a*與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01;a與模型組比較，aP<0.05，z^P<0.01模型對照組腦SOD活性降低，MDA含量增加，'腦系數減少(P〈0.05)。與模型組比較，穗花杉雙黃酮高、中、低劑量組SOD活性升高，MDA含量降低，總黃酮高、中劑量組SOD活性升高，MDA含量降低(P〈0.05或P〈0.01)說明穗花杉雙黃酮及總黃酮具有明顯的抗氧化作用，改善自由基在體內的過量代謝。增加SOD含量，增強抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制過氧化反應，抑制過氧化產物MDA產生及清除過量的MDA的作用，穗花杉雙黃酮及總黃酮高、中劑量組腦系數顯著增加，從而說明有抗腦萎縮的作用。5、穗花杉雙黃酮及巻柏總黃酮對老年癡呆模型乙酰膽堿含量的影響。取小鼠90只，隨機分為正常對照組和模型組。模型組給A1CL溶液，開始70天按400mg/kg/d灌胃，以后一直用2000mg/LAlCh溶液飲用；正常對照組灌胃等容的蒸餾水。將模型組隨機分為8組，按表5所示，灌胃給藥60天，正常對照組癡呆模型組灌以等體積的蒸餾水。整個實驗過程避免與鋁制品接觸。大鼠斷頭處死，迅速開顱剝離腦組織(去除小腦組織)，取部分腦組織生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，加入冷生理鹽水放入勻漿管在冰浴中充分研碎，制成10%的腦勻漿，離心，取上清用比色法測定腦組織乙酰膽堿酶含量。表5穗花杉雙黃酮及總黃酮對老年癡呆模型乙酰膽堿含量的影響(『10，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*與正常組比較，*p〈0.05，**p<0.01;a與模型組比較，,一p〈:o.05，z^p〈o.c各治療組和模型組比較，乙酰膽堿含量降低，并有顯著性差異。6、小鼠的急性毒性實驗以動物能耐受的最大給藥濃度(0.5g/ml)、小鼠最大給藥容積(0.4ml/10g體重)一日內灌胃給藥1次，連續觀察7天內有無毒性反應及動物死亡。測得結果是小鼠7天內動物均無一死亡，在此劑量下未觀察到明顯急性毒性反應。其小鼠最大給藥量為20g/kg休重/d。具體實施例方式結合實施例對本發明作進--步描述，但本發明不受實施例的任何限制。實施例l巻柏總黃酮的提取制備藥材lkg，用30-95%乙醇(優選75%乙醇)8倍量回流提取2-3次，每次提取13小時，用提取液1.5°/。(w/v')的活性炭脫色，回收乙醇至無醇味，加去離子水調濃度至1.5g/ml藥材.調ph45，靜置24小時，抽濾或離心，取沉淀，用乙醇溶解，將乙醇可溶部分拌入預先處理好的D101或AB—8大孔樹脂中，充分吸附，伴揮去乙醇，將吸附樣品的大孔樹脂加到預先裝好的大孔樹脂柱上端，先用30—-40%的乙醇洗脫3-4BV,再用60—70%乙醇洗脫3-4BV，收集60—70%乙醇洗脫部分，回收乙醇，干燥得巻柏總黃酮。實施例2穗花杉雙黃酮的制備將巻柏總黃酮在C-18反相柱(常壓)上分離純化，用20-50%含水甲醇為洗脫劑，收集穗花杉雙黃酮流分，薄層鑒定后合并，揮去部分溶劑，得穗花杉雙黃酮結晶。實施例3(膠囊劑)穗花杉雙黃酮或總黃酮原料lOOg.藥用淀粉適量，混合均勻，制粒，干燥，整粒，裝入1號膠囊，制成1000粒，即得。穗花杉雙黃酮每次1粒、總黃酮每次2粒，每日3次。實施例4(片劑)穗花杉雙黃酮或總黃酮原料100g，藥用淀粉適量，糊精適量，混合均勻，制粒，干燥，整粒，干燥，加入潤滑劑適量，壓片，制成1000片，即得。穗花杉雙黃酮每次1片、總黃酮每次2片。每日3次。實施例5(滴丸劑)稱取30g聚乙二醇4000，在水浴上熔化，加穗花杉雙黃酮或總黃酮原料10g，攪拌均勻，傾入保溫管中，調節恒溫裝置，使藥液在80—9(TC下滴入冷卻過的液體石蠟中，滴完后，將藥丸傾入濾紙上吸干石蠟油，制成1000粒，即得。穗花杉雙黃酮每次iO粒、總黃酮每次20粒。每日3次。實施例6(顆粒劑)穗花杉雙黃酮或總黃酮原料100g，糖粉400g，混合均勻，用適量乙醇制粒，干燥、整粒、分裝，制成500袋，即得。穗花杉雙黃酮每次0.5袋、總黃酮每次l袋。每日3次。權利要求1、從卷柏屬植物提取制備卷柏總黃酮及其穗花杉雙黃酮，其特征在于卷柏總黃酮中含有穗花杉雙黃酮(amentoflavone)、異柳杉雙黃酮(isocryptomixin)、扁柏雙黃酮(hinokiflavone)、蘇鐵雙黃酮(sotatsuflavone)等。2、根據權利要求1所述的巻柏總黃酮和穗花杉雙黃酮單體成分，其特征在于巻柏總黃酮中含有穗花杉雙黃酮為35%45%，以穗花杉雙黃酮為對照品測定巻柏總黃酮含量在50%以上。穗花杉雙黃酮單體成分純度為98%以匕3、根據權利要求12所述的巻柏總黃酮及其單體成分穗花杉雙黃酮，其特征在于以巻柏屬植物為藥材制備巻柏總黃酮和單體穗花杉雙黃酮的方法是(1)藥材用8-10倍量30-95%的乙醇回流提取兩次，每次提取時間為13小時，濾過，合并提取液，用1.5%(w/v)的活性炭脫色，回收乙醇至無醇味，加去離子水至1.5g/ml藥材，調pH值45，靜置24小時，抽濾或離心，取沉淀，用乙醇溶解，將乙醇可溶部分拌入預先處理好的D101或AB—8大孔樹脂中，充分吸附，并揮去乙醇，將吸附樣品的大孔樹脂加到預先裝好的大孔樹脂柱上端，先用20—40。/。的乙醇洗脫3-4BV，再用60—70。/q乙醇洗脫3-4BV，收集60—70%乙醇洗脫部分，回收乙醇，干燥得巻柏總黃酮。(2)將巻柏總黃酮在C-18反相柱(常壓或中低壓)h分離純化，用20-50%含水甲醇為洗脫劑，收集穗花杉雙黃酮流分，薄層鑒定后合并，揮去部分溶劑，得穗花杉雙黃酮晶體。4、根據權利要求13所述的巻柏總黃酮及其穗花杉雙黃酮單體成分在預防和治療老年癡呆藥物中的應用。5、根據權利要求4所述的應用其特征在于含有有效治療劑量的穗花杉雙黃酮或總黃酮和一種或多種藥學卜.可接受的藥用賦形劑，或口f與穗花杉雙黃酮或總黃酮組方的其它藥物制成的制劑。6、根據權利要求5所述的藥物制劑，其特征在于優選含有1%—99%的穗花杉雙黃酮或總黃酮和99/。一1%的藥用賦形劑或其它可組方的藥物。7、根據權利要求4所述的藥物制劑，其特征在于所說的藥物是口服制劑的劑型。8、根據權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于所說的口服制劑選自于片劑、丸劑、膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑當中的任何一禾中。9、權利要求6所述的藥用賦形劑包括填充劑、崩解劑等，填充劑選自淀粉、乳糖、微晶纖維素、糊精、磷酸鈣等；崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯聚維酮；也可選加黏合劑、潤濕劑和潤滑劑。全文摘要以卷柏科卷柏屬(Selaginella)植物墊狀卷柏S.pvlvinata(Hook.etGev.)Maxim、卷柏S.tamariscina(beav.)spring和江南卷柏S.moellendorfiiHieron等為原料提取、分離卷柏總黃酮及其單一成分穗花杉雙黃酮，并制成藥物制劑，用于老年癡呆癥的預防和治療。文檔編號A61K47/38GK101297823SQ20081005089公開日2008年11月5日申請日期2008年6月27日優先權日2008年6月27日發明者南敏倫,呂雪峰,張蓮珠,王蓮萍,趙全成申請人:趙全成